基于表面等离子体共振的有机磷检测方法

1.一种基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1.提供一免疫传感芯片；其中，所述免疫传感芯片包含光子晶体结构基底、覆盖在所述基底上的金属膜以及键合在所述金属膜上的有机磷抗体OPs-Ab；
S2.将有机磷样品液结合到所述免疫传感芯片上，所述有机磷样品液中的有机磷抗原OPs-Ag与所述OPs-Ab结合，在所述免疫传感芯片上形成样品膜；
S3.可见光或红外光经入射光纤以预设的入射角透过所述样品膜打在所述免疫传感芯片上，入射光通过所述免疫传感芯片上的光子晶体结构反射，经出射光纤进入光谱仪，获得测量SPR图谱；
S4.将所述测量SPR图谱与基准SPR图谱进行比较，根据吸收峰是否有偏移，确定所述有机磷样品液中是否含有有机磷；根据吸收峰的位移量，确定有机磷的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，所述光子晶体结构基底通过以下步骤制备：
提供一基底；
在所述基底表面上打周期性点阵结构排列的孔。
3.根据权利要求2所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，所述周期性点阵结构的排列形状为正方形或六边形。
4.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，所述光子晶体结构的晶格常数为0.8至1.2微米，占空比为1:4。
5.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，所述有机磷抗体通过以下步骤键合在所述金属膜上：
在所述金属膜上修饰胺基-NH2；
在所述胺基上修饰有机磷抗体OPs-Ab。
6.根据权利要求5所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，在所述金属膜上修饰胺基的步骤中，包含以下子步骤：
将覆盖了金属膜的基底放置在37℃的20毫摩尔/升巯基乙胺溶液中浸泡2小时。
7.根据权利要求5所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，在所述胺基上修饰有机磷抗体的步骤中，包含以下子步骤：
将所述修饰了胺基的基底放置在4℃的加入了0.2毫摩尔/升的碳二亚胺EDC和0.5毫摩尔/升的N-羟基琥珀酰亚胺NHS水溶液的OPs-Ab溶液中浸泡12小时。
8.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，在所述步骤S2中，包含以下子步骤：
将有机磷样品液滴到所述免疫传感芯片上，并在37℃下放置30分钟；
用PBS冲洗所述免疫传感芯片；
室温晾干或吹干，在所述免疫传感芯片上形成样品膜。
9.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，在所述步骤S2中，包含以下子步骤：
将所述免疫传感芯片放置在37℃的有机磷样品液中浸泡30分钟；
用PBS冲洗所述免疫传感芯片；
室温晾干或吹干，在所述免疫传感芯片上形成样品膜。
10.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，所述基准SPR图谱通过以下步骤获得：
光源发射的可见光或红外光经入射光纤以预设的入射角打在所述免疫传感芯片上；
入射光通过所述免疫传感芯片上的光子晶体结构反射，经出射光纤进入光谱仪，得到基准SPR图谱。
11.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，在所述步骤S4之后，还包含以下步骤：
将形成了样品膜的免疫传感芯片放置在37℃的0.25毫克/毫升异硫氰酸荧光素FITC有机磷抗体OPs-Ab溶液中，浸泡30分钟，然后用磷酸盐缓冲液PBS冲洗，晾干或吹干之后，测定SPR图谱。
12.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，其特征在于，在所述步骤S4之后，还包含以下步骤：
采用5毫摩尔/升的盐酸HCl溶液清洗所述免疫传感芯片，去除所述免疫传感芯片上形成的样品膜；
在重新结合样品膜之前，测定SPR图谱。

基于表面等离子体共振的有机磷检测方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及生物化学检测领域，特别涉及基于表面等离子体共振的有机磷检测方法。\n背景技术\n[0002] 生物化学检测在医疗、环保、生物、食品检测等直接关系人类生存发展的诸多领域都有着重要作用。近年来，随着对痕量、微量样品的检测需求的不断提出，对特殊物质、成分、状态等被测对象的不断扩展，传统的检测技术已无法满足需求。\n[0003] 表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称“SPR”)是一种物理光学现象，由入射光波和金属表面的自由电子相互作用而产生。当入射光线从光密介质照射到光疏介质时，在入射角大于临界角时，会发生全反射现象。如果在两种介质界面之间存在几十纳米的金属薄膜，则全反射时产生的消逝波的P偏振分量(P波)会进入金膜，与金膜中的自由电子相互作用，激发出沿金膜表面传播的表面等离子体波(Surface Plasmon Wave，SPW)。当入射角的角度或波长为某一特定值时，消逝波与表面等离子体将发生能量耦合产生共振，入射光的能量将被转移到表面等离子体上，导致反射光能量急剧下降，在反射光谱上产生共振吸收峰，此时入射光的角度或波长称为SPR共振角或共振波长。共振角或共振波长与金膜表面介质的折射率密切相关，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比，据此，可对金膜表面结合的待测物进行检测和分析。\n[0004] 如图1所示，在传感器101金膜102表面上固定抗体103(生物识别分子)，然后使游离的抗原104缓缓通过流通池，入射光106透过棱镜105和传感器101打到金膜102表面，检测反射光107，得到SPR图谱。光在基底111界面处发生全内反射时的消逝波110与金属表面的自由电子，在振荡在金属接近样品108的表面上形成电子疏密波(即表面等离子体波109)，当消逝波110和表面等离子体波109的频率和波数相等时，发生表面等离子体共振，使光信号得到增强。当抗原抗体发生特异性结合时，SPR的共振角就会随之发生改变，并且随着反应时间的改变共振角也会发生相应的改变，直至抗原-抗体反应达到平衡，共振角也不会再发生改变，故通过SPR反射光谱的共振峰的变化可对抗原进行高灵敏度的检测。在实际检测中，将待测液通过流通池，分析在抗原抗体发生特异性结合之前和之后的SPR图谱中共振峰是否发生偏移，可以确定待测液中是否含有能与抗体发生特异性结合的抗原，而且根据偏移程度，可以确定待测液中能与抗体发生特异性结合的抗原的浓度。但是，目前采用SPR技术进行生物分子检测和分析的仪器为获得高精度及自动化检测能力，其光学系统、自动进样系统较为复杂，且存在体积大、成本高的缺点，限制了它们的推广运行。而一些小型仪器，如生物传感器和微射流系统SensiQ，通常是半自动的，无法实现自动检测，而且该仪器的传感器拆卸不方便，流通池固定不紧时容易漏液。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的在于提供一种基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，使得在基于SPR技术的有机磷检测中不用棱镜进行分光，不采用流通池进行进样，从而缩小仪器体积，实现仪器小型化。\n[0006] 为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，包含以下步骤：\n[0007] S1.提供一免疫传感芯片；其中，所述免疫传感芯片包含光子晶体结构基底、覆盖在所述基底上的金属膜以及键合在所述金属膜上的有机磷抗体OPs-Ab；\n[0008] S2.将有机磷样品液结合到所述免疫传感芯片上，所述有机磷样品液中的有机磷抗原OPs-Ag与所述OPs-Ab结合，在所述免疫传感芯片上形成样品膜；\n[0009] S3.将可见光或红外光以预设的入射角透过所述样品膜打在所述免疫传感芯片上，检测通过所述免疫传感芯片上的光子晶体结构反射回来的光，获得测量SPR图谱；\n[0010] S4.将所述测量SPR图谱与基准SPR图谱进行比较，根据吸收峰是否有偏移，确定所述有机磷样品液中是否含有有机磷；根据吸收峰的位移量，确定有机磷的浓度。\n[0011] 本发明实施方式相对于现有技术而言，通过将有机磷样品液结合到键合了有机磷抗体OPs-Ab的免疫传感芯片上，有机磷样品液中的有机磷抗原OPs-Ag与OPs-Ab结合，在免疫传感芯片上形成样品膜；将可见光或红外光以预设的入射角透过样品膜打在免疫传感芯片上，检测通过免疫传感芯片上的光子晶体结构反射回来的光，获得测量SPR图谱；将测量SPR图谱与基准SPR图谱进行比较，根据吸收峰是否有偏移，确定有机磷样品液中是否含有有机磷；根据吸收峰的位移量，确定有机磷的浓度。使得在基于SPR技术的有机磷检测中不用棱镜进行分光，不采用流通池进行进样，从而缩小仪器体积，实现仪器小型化。\n[0012] 另外，所述光子晶体结构基底通过以下步骤制备：\n[0013] 提供一基底；\n[0014] 在所述基底表面上打周期性点阵结构排列的孔。\n[0015] 具有周期性点阵结构排列的孔的光子晶体结构基底能增强反射光的信号强度，从而提高了检测的灵敏度，降低了检出限。\n[0016] 另外，所述周期性点阵结构的排列形状为正方形或六边形。孔的周期性点阵结构的排列形状越有规律，则共振峰越强，半波宽越窄，从而进一步使信号强度得到增强。\n[0017] 另外，所述光子晶体结构的晶格常数为0.8至1.2微米，占空比为1∶4。可以最大程度激发SPR共振，进一步有利于信号强度的增强。\n[0018] 另外，所述有机磷抗体通过以下步骤键合在所述金属膜上：\n[0019] 在所述金属膜上修饰胺基-NH2；\n[0020] 在所述胺基上修饰有机磷抗体OPs-Ab。\n[0021] 免疫传感芯片上键合的有机磷抗体决定了能检测出的有机磷种类，根据需要检测出的有机磷种类，可以自由选择有机磷抗体，从而使本发明的有机磷检测方法的使用范围广泛，有利于推广应用。\n[0022] 另外，在所述步骤S2中，包含以下子步骤：\n[0023] 将有机磷样品液滴到所述免疫传感芯片上，并在37℃下放置30分钟；\n[0024] 用PBS冲洗所述免疫传感芯片；\n[0025] 室温晾干或吹干，在所述免疫传感芯片上形成样品膜。\n[0026] 将有机磷样品液滴到免疫传感芯片上，易于操作，不用采用复杂的进样系统，进一步缩小仪器体积，实现仪器小型化。\n[0027] 另外，在所述步骤S2中，包含以下子步骤：\n[0028] 将所述免疫传感芯片放置在37℃的有机磷样品液中浸泡30分钟；\n[0029] 用PBS冲洗所述免疫传感芯片；\n[0030] 室温晾干或吹干，在所述免疫传感芯片上形成样品膜。\n[0031] 将免疫传感芯片放置在有机磷样品液中浸泡，能使抗原和抗体充分结合，从而使检测结果更准确。\n[0032] 另外，在所述步骤S4之后，还包含以下步骤：\n[0033] 将形成了样品膜的免疫传感芯片放置在37℃的0.25毫克/毫升异硫氰酸荧光素FITC有机磷抗体OPs-Ab溶液中，浸泡30分钟。\n[0034] 通过在表面结合FITC-OPs-Ab，并测定SPR图谱，可以检验抗体和抗原都结合到了基底上，进一步确保有机磷检测结果的准确性。\n[0035] 另外，在所述步骤S4之后，还包含以下步骤：\n[0036] 采用5毫摩尔/升的盐酸HCl溶液清洗所述免疫传感芯片，去除所述免疫传感芯片上形成的样品膜；\n[0037] 在重新结合样品膜之前，测定SPR图谱。\n[0038] 洗去免疫传感芯片上的样品膜，可以使芯片再生，重复利用，节约成本；并且，通过测定SPR图谱，可以确保清洗干净。\n附图说明\n[0039] 图1是根据现有技术的基于表面等离子体共振的有机磷检测原理示意图；\n[0040] 图2是根据本发明一较佳实施方式的基于表面等离子体共振的有机磷检测方法的流程图；\n[0041] 图3A至图3C是免疫传感芯片的结构示意图；\n[0042] 图4是免疫传感芯片上只键合了OPs-Ab，结合了OPs-Ag，又结合了OPs-Ab的SPR图谱示意图。\n具体实施方式\n[0043] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。\n[0044] 本发明的一较佳实施方式涉及一种基于表面等离子体共振的有机磷检测方法，具体流程如图2所示，包含以下步骤：\n[0045] 步骤201，提供一免疫传感芯片；其中，免疫传感芯片包含光子晶体结构基底、覆盖在基底上的金属膜以及键合在金属膜上的有机磷抗体OPs-Ab；\n[0046] 光子晶体结构基底可以通过以下步骤制备：提供一基底，并在基底表面上打周期性点阵结构排列的孔。具有周期性点阵结构排列的孔的光子晶体结构基底能增强反射光的信号强度，从而提高了检测的灵敏度，降低了检出限。\n[0047] 如图3A所示是光子晶体结构基底的剖视图，如图3B和3C是光子晶体结构基底的俯视图，图中301是基底，302是金属层，303是周期性点阵结构的孔。可以采用半导体工艺中的光刻工艺在基底上打孔，光刻掩模上的图案具有周期性点阵结构，经光刻之后，基底就具有了周期性点阵结构的孔。点阵结构的周期是可控的，比如，周期性点阵结构的孔的周期T为0.8至1.2微米，占空比为1∶4。\n[0048] 值得说明的是，周期性结构引起周期性介电常数的变化，对于不同的周期T，引起的周期性势场也会不同，从而导致共振峰位置发生相应的变化，通过模拟和实验测量圆孔排列为正方形排列，得出其共振峰位置基本与晶格常数(即周期性点阵结构的孔的周期)之比为1∶1，六边形排列基本接近于\n[0049] 此外，占空比是圆孔直径和圆孔间距之比，随着占空比变大，共振峰的强度变大。\n由光学原理可知，光传播分为横电波(TE)和横磁波(TM)两种传播模式，而在占空比较小时，能够制造能带禁带，形成表面等离子体(SPR)共振的主要是TM传播模式，此时TE传播模式影响基本可以忽略，而当占空比变大，TE传播模式也逐渐形成禁带，当占空比达到某一值时，两者禁带完全重合，此时TE和TM传播模式都能制造能带禁带，激发SPR共振，从而可以得到最高强度的SPR共振峰。\n[0050] 在基底上打孔的结构构成了光子晶体结构，光子晶体是指具有光子带隙(Photonic Band-Gap，简称为PBG)特性的人造周期性电介质结构，有时也称为PBG光子晶体结构。光子晶体具有波长选择的功能，可以有选择地使某个波段的光通过而阻止其它波长的光通过其中。光子晶体中是折射率的周期性变化产生了光带隙结构，从而由光带隙结构控制着光在光子晶体中的运动。本实施方式是在高折射率材料(如金属层)的某些位置周期性的出现低折射率(如周期性点阵结构的孔)的材料。在本发明中，由于在这种光子晶体结构之上还覆盖了金属层，在有光照射到金属层上时，会发生反射，而由于表面不是平滑的，周期性孔的存在，使某些波长的光不能反射回来，起到分光的作用，形成波长分辨率极高而体积极小的超棱镜，可以省略光谱采集系统中的棱镜，不用棱镜进行分光，从而缩小仪器体积，实现仪器小型化。在此，值得说明的是，孔的深度不宜过深，过深会导致光入射进去之后，无法反射出来；孔的深度不宜过浅，过浅会达不到分光的目的。此外，随着孔的深度的增加，信号增强效果越明显，但到达12微米左右之后，信号增强效果会减弱，因此，周期性点阵结构的孔的深度在1至15微米之间较为适宜，进一步有利于信号强度的增强。\n[0051] 值得一提的是，图3B中周期性点阵结构的排列形状为正方形，还可以排成六边形，如图3C所示，但是，本发明并不以此为限，任意周期性点阵结构的排列形状都在本发明的保护范围之内。周期性点阵结构的排列形状越有规律，则共振峰越强，半波宽越窄。在实际实验中，可以看出六边形排列比正方形排列有着更强的共振峰和更窄的半波宽。这是由两种排列所具有的不同周期性程度引起，六边形排列比正方形排列有着更好的周期性，其在六个方向上的周期都相等，而正方型排列只在两个方向的周期相等，这使得光波在六边形排列基底传输过程中更少的受到传输方向的影响，所以其能激发更强和更窄的共振峰。\n[0052] 有机磷抗体(OPs-Ab)通过以下步骤键合在金属膜上：先在金属膜上修饰胺基(-NH2)，接着在胺基上修饰OPs-Ab。具体地说，先将覆盖了金属膜的基底放置在37℃的20毫摩尔/升巯基乙胺溶液中浸泡2小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗。接着，将修饰了胺基的基底放置在4℃的加入了0.2毫摩尔/升的碳二亚胺EDC和0.5毫摩尔/升的N-羟基琥珀酰亚胺NHS水溶液的OPs-Ab溶液中浸泡12小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗。\n[0053] 免疫传感芯片上键合的有机磷抗体决定了能检测出的有机磷种类，根据需要检测出的有机磷种类，可以自由选择有机磷抗体，从而使本发明的有机磷检测方法的使用范围广泛，有利于推广应用。可以选择与多种有机磷抗原结合的通用抗体，比如，市面上有一种有机磷单克隆抗体可以检测五种药物：甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、氯硫磷、皮蝇磷；也可以选择只与一种有机磷抗原结合的单一抗体。\n[0054] 步骤202，将有机磷样品液结合到免疫传感芯片上，有机磷样品液中的有机磷抗原OPs-Ag与OPs-Ab结合，在免疫传感芯片上形成样品膜。\n[0055] 由于在免疫传感芯片上形成样品膜是固态的，从而使有机磷检测仪器中不用采用流通池，可以进一步缩小仪器体积，实现仪器小型化；而且，相较于在流通池中注入有机磷溶液，固态的样品膜比液体对光信号的干扰小，因为液体对某些波段有吸收，从而使检测结果更准确。\n[0056] 在实际实现中，可以通过以下方法在免疫传感芯片上形成样品膜：\n[0057] 将有机磷样品液滴到免疫传感芯片上，并在37℃下放置30分钟；\n[0058] 用PBS冲洗免疫传感芯片；\n[0059] 室温晾干或吹干，在免疫传感芯片上形成样品膜。\n[0060] 这种方法易于操作，不用采用复杂的进样系统，可以进一步缩小仪器体积，实现仪器小型化。\n[0061] 也可以通过以下方法在免疫传感芯片上形成样品膜：\n[0062] 将免疫传感芯片放置在37℃的有机磷样品液中浸泡30分钟；\n[0063] 用PBS冲洗免疫传感芯片；\n[0064] 室温晾干或吹干，在免疫传感芯片上形成样品膜。\n[0065] 这种方法将免疫传感芯片放置在有机磷样品液中浸泡，能使抗原和抗体充分结合，从而使检测结果更准确。\n[0066] 步骤203，将可见光或红外光以预设的入射角透过样品膜打在免疫传感芯片上，检测通过免疫传感芯片上的光子晶体结构反射回来的光，获得测量SPR图谱。具体地说，光源发射的可见光或红外光经入射光纤以预设的入射角透过样品膜打在免疫传感芯片上；入射光通过免疫传感芯片上的光子晶体结构反射，经出射光纤进入光谱仪，得到测量SPR图谱。\n[0067] 步骤204，将测量SPR图谱与基准SPR图谱进行比较，根据吸收峰是否有偏移，确定有机磷样品液中是否含有有机磷；根据吸收峰的位移量，确定有机磷的浓度。\n[0068] 其中，基准SPR图谱通过以下步骤获得：光源发射的可见光或红外光经入射光纤以预设的入射角打在免疫传感芯片上；入射光通过免疫传感芯片上的光子晶体结构反射，经出射光纤进入光谱仪，得到基准SPR图谱。基准SPR图谱可以在芯片制备时测定，也可以在每次检测前测定。此外，还可以在键合OPs-Ab之前和之后，测定SPR图谱，进行比较，确保在免疫传感芯片键合OPs-Ab，从而确保后续有机磷的检测结果的正确性。\n[0069] 在步骤S4之后，还包含以下步骤：\n[0070] 将形成了样品膜的免疫传感芯片放置在37℃的0.25毫克/毫升异硫氰酸荧光素FITC有机磷抗体OPs-Ab溶液中，浸泡30分钟，然后用PBS冲洗，晾干或吹干之后，测定SPR图谱。通过在表面结合FITC-OPs-Ab，并测定SPR图谱，可以检验抗体和抗原都结合到了基底上，进一步确保有机磷检测结果的准确性。也就是说，结合荧光标记的抗体可以证明前边操作中抗体和抗原都结合到了基底上，通过扫描得到的SPR图谱可以看出来，如果有共振峰漂移，不一定能证明基底上结合了抗体和抗原，也可能是别的物质，通过结合荧光标记的抗体，再测定SPR图谱，如果发生了共振峰漂移，则说明基底上一定结合了抗体和抗原，这样可以确保有机磷检测结果的准确性。\n[0071] 如图4所示是免疫传感芯片上只键合了OPs-Ab(图中401)，结合了OPs-Ag(图中402)，又结合了OPs-Ab(图中403)的示意图，在实验中，选择入射角30°，光谱范围\n400-1000nm，吸收峰945nm左右。由图可以看出，结合了OPs-Ag的吸收峰相较于只键合了OPs-Ab的吸收峰发生了偏移，说明有机磷样品液中含有OPs-Ab能检测出的OPs-Ag，如果免疫传感芯片上键合的OPs-Ab是一种有机磷单克隆抗体，该抗体可以检测五种药物：甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、氯硫磷、皮蝇磷，那么有机磷样品液中含有这五种药物中的一种或几种。通过测量402曲线的吸收峰相较于的401曲线的吸收峰的位移量，可以确定有机磷样品液中有机磷的浓度。值得说明的是，需要事先建立OPs-Ag浓度与吸收峰位移量的线性关系，也就是说，分别配制已知浓度的有机磷标准溶液，将有机磷标准溶液结合到免疫传感芯片上，分别测定不同浓度的有机磷标准溶液对应的SPR图谱，记录吸收峰位移量，建立有机磷浓度与吸收峰位移量的对应关系。\n[0072] 此外，值得一提的是，洗去免疫传感芯片上的样品膜，可以使芯片再生，重复利用，节约成本；并且，通过测定SPR图谱，可以确保清洗干净。具体地说，采用5毫摩尔/升的盐酸HCl溶液清洗免疫传感芯片，去除免疫传感芯片上形成的样品膜；在重新结合样品膜之前，测定SPR图谱。\n[0073] 上面各种方法的步骤划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个步骤或者对某些步骤进行拆分，分解为多个步骤，只要包含相同的逻辑关系，都在本专利的保护范围内；对算法中或者流程中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的设计，但不改变其算法和流程的核心设计都在该专利的保护范围内。\n[0074] 本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。