用于抑制酵母活性的方法

1.用于控制或防止酵母在具有pH2-6的食品中生长的方法，包括向所述食品添加作为抗酵母剂的a)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和b)碱性氨基酸的衍生物的组合，所述碱性氨基酸的衍生物选自碱性氨基酸的聚合物和碱性氨基酸α-酰胺的酯，和/或其盐。
2.权利要求1的方法，其中将表没食子儿茶素没食子酸酯作为绿茶提取物添加至食品中。
3.权利要求1或2的方法，其中所述碱性氨基酸的聚合物为多聚赖氨酸。
4.权利要求3的方法，其中所述多聚赖氨酸是ε-多聚赖氨酸。
5.前述权利要求的任一项的方法，其中所述碱性氨基酸α-酰胺的酯是月桂酰精氨酸酯。
6.前述权利要求的任一项的方法，其中将表没食子儿茶素没食子酸酯以0.0001wt.%至2wt.%，优选0.001wt.%至1wt.%，更优选0.01wt.%至0.5wt.%以及更优选0.01wt.%至
0.1wt.%的浓度添加至食品中。
7.前述权利要求的任一项的方法，其中将碱性氨基酸的衍生物以0.00001wt.%至
1wt.%，优选0.0001wt.%至0.1wt.%，更优选0.0005wt.%至0.01wt.%以及更优选0.001wt.%至0.005wt.%的浓度添加至食品中。
8.前述权利要求的任一项的方法，其中所述食品具有3-5，优选3-3.5以及更优选约
3.2的pH。
9.前述权利要求的任一项的方法，其中所述食品是饮料。
10.前述权利要求的任一项的方法，其中所述酵母是白色念珠菌、酿酒酵母和/或拜耳接合酵母。
11.一种用于添加至食品中的组合物，其包含a)表没食子儿茶素没食子酸酯以及b)月桂酰精氨酸酯和多聚赖氨酸。
12.权利要求11的组合物，其中a)与b)之间的重量比为0.01a:1b至5000a:1b，特别是5a:1b至2000a:1b，优选10a:1b至1000a:1b，更优选50a:1b至500a:1b以及更优选
100a:1b。
13.一种具有pH2-6的食品，其包含a)表没食子儿茶素没食子酸酯以及b)月桂酰精氨酸酯和多聚赖氨酸。
14.权利要求13的食品，其包含浓度为0.0001wt.%至2wt.%，优选0.001wt.%至1wt.%，更优选0.01wt.%至0.5wt.%以及更优选0.01wt.%至0.1wt.%的a)和浓度为0.00001wt.%至1wt.%，优选0.0001wt.%至0.1wt.%，更优选0.0005wt.%至0.01wt.%以及更优选
0.001wt.%至0.005wt.%的b)。

用于抑制酵母活性的方法\n[0001] 本发明涉及用于抑制酸性食品中的酵母的方法，涉及用于添加至食物中的组合物，涉及包含所述组合物的酸性食品。\n[0002] 酵母构成很大一部分食品微生物腐败。食品安全和食品腐败的防止在世界范围内永远受到关注，特别是酸性食品例如饮料、乳制品、即食餐(ready to eat meal)、汤或调味汁,所述酸性食品占据了食品工业的重要部分。食品腐败对于食品制造商来说是个主要经济问题。还存在日益增长的对组合良好口味与高质量的健康和全天然食品的需要。食品制造商需要保护公众的健康和安全，同时要通过递送食用安全并且具有在冷冻或环境温度贮藏下的保证保质期(guaranteed shelf life)的产品来满足消费者需要。\n[0003] 酸性食品难以保存，因为使用防腐剂的可能性受到限制。只有就保持其稳定性和抗微生物活性而言能够抗这样的酸性环境的试剂是适当的。这使得例如许多蛋白质、氨基酸和酶不适合用作酸性食品中的防腐剂。\n[0004] 表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate)(EGCG)是存在于绿茶提取物中的因其有益的生理性质而闻名的天然产物。EGCG和相关儿茶素衍生物已被描述为用作抗氧化剂和用作血压、血糖水平和胆固醇水平升高的抑制剂(EP1297757)。\n[0005] 还已报导包含EGCG和/或密切相关的儿茶素的组合物具有抗微生物活性。\n[0006] DE19917836描述了基于柑桔类果实的防腐剂并且提及EGCG作为可存在于柠檬果实提取物中的活性类黄酮组分之一。该文献还公开了葡萄柚提取物组合物是在体外抗几种微生物(包括革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和酵母)的活性剂。\n[0007] WO2006/117029描述了用于抗口臭的包含多聚赖氨酸和多羟基酚类化合物的组合物，所述口臭主要由厌氧菌引起。多羟基酚类化合物是绿茶提取物，其可包含EGCG或橄榄提取物。该组合物的抗菌活性通过在使用例如包含多聚赖氨酸和绿茶提取物(作为抗细菌剂组分)的口腔喷雾制剂或薄荷片剂后测量口腔中的厌氧细菌代谢产物的量的减少来进行评估。\n[0008] JP11-292710描述了包含醇、天然提取物、表面活性剂和水的杀菌组合物。天然提取物选自苹果苯酮、扁柏酚(hinokitiol)、多聚赖氨酸和绿茶提取物。EGCG被提及为可包含在绿茶提取物中的儿茶素之一。所述文献中所示的实例显示了不同组合物的抗革兰阳性和革兰阴性细菌的活性。\n[0009] WO2009/031041描述了包含月桂酰精氨酸酯(lauric arginate)(LAE)或其衍生物(作为抗微生物化合物)和可以是绿茶提取物的抗微生物材料的组合物。在该文献中，在培养基中分析了该组合物抗一系列不同的微生物的活性。在所示的其中评估抗酵母活性的实例中，对于显示高于10000ppm的最低抑菌浓度(MIC)的绿茶提取物未观察到抑制活性，然而LAE显示分别以24和7ppm的MIC抑制酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。此外，在酵母的抑制中未观察到LAE与绿茶提取物的组合的相互作用。\n[0010] 现已令人惊讶地发现，与碱性氨基酸的衍生物和/或其盐组合的EGCG显示了优异的抗酸性食品(即具有pH2-6的食品)中的酵母的抑制活性。\n[0011] 碱性氨基酸衍生物选自碱性氨基酸的聚合物和碱性氨基酸α酰胺的酯。\n[0012] EGCG和碱性氨基酸衍生物本身并非因具有高抗酵母活性而众所周知。本发明人现已令人惊讶地发现EGCG与碱性氨基酸的衍生物的组合在酸性食品中用作有效的抗酵母剂。出乎意料地，该组合在酸性食品中的抗酵母活性显著高于当单独使用时化合物的活性之和，这可能归因于该组合抗酵母的协同作用。\n[0013] 因此，在一个方面本发明涉及用于控制或防止酵母在具有pH2-6的食品中生长的方法，包括向所述食品中添加a)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与b)碱性氨基酸的衍生物的组合，作为抗酵母剂，所述碱性氨基酸的衍生物选自碱性氨基酸的聚合物和碱性氨基酸α-酰胺的酯和/或其盐。\n[0014] 本文中描述的方法不仅使用所有天然化合物来控制或防止酵母在酸性食品中生长而且还有利地需要相对低的量的防腐剂即抗酵母剂。\n[0015] 对其添加本文中描述的抗酵母组合的所使用的食品是酸性食品，其可以本来就是酸性的或可通过添加酸化剂而被酸化。酸性食品是具有2-6，优选3-5，更优选3-3.5，更优选约3.2的pH的食品。酸性食品可以是固体食品或液体食品。此类酸性食品包括例如饮料(例如软饮料、果汁和蔬菜汁、啤酒、葡萄酒、牛奶和液体酸乳酪)、汤、调味品(dressings)、调味汁(sauce)、浓汤、浇头(topping)、果酱、乳制品、肉制品和鱼制品、冷冻和高温处理的产品以及即食餐。\n[0016] 本文中描述的方法使用a)EGCG与b)碱性氨基酸的衍生物的组合作为抗酵母剂，所述碱性氨基酸的衍生物选自碱性氨基酸的聚合物和碱性氨基酸α-酰胺的酯和/或其盐。\n[0017] 在本申请的说明书中，抗酵母剂是具有抗酵母活性即抑制酵母的生长和/或具有针对酵母的杀生物作用的化合物的组合。当用于食品时，本文中描述的抗酵母剂通过控制或防止酵母在食品中生长而用作防腐剂。这导致酵母以及从酵母的代谢活性衍生的毒性化合物和/或使食品腐败的化合物在食品中的存在的减少或抑制。因此，食品的稳定性得到增强。\n[0018] 组合的组分a)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是天然多羟基酚类化合物，其存在于植物来源的提取物例如绿茶提取物中。可将EGCG以分离的形式或作为绿茶提取物的部分添加至酸性食品。通常，适当的绿茶提取物具有可接受的感官性质和溶解度的组合。\n还可使用EGCG的其它来源例如柠檬果实提取物。EGCG可商购获得，可按照本领域技术人员已知的方法从天然来源提取或可通过合成途径制备。\n[0019] 组合的组分b)是碱性氨基酸的衍生物，其选自碱性氨基酸的聚合物和碱性氨基酸α-酰胺的酯和/或其盐。\n[0020] 可将碱性氨基酸衍生物以游离化合物或以盐的形式或以游离化合物与盐的组合的形式添加至食品。可使用适合于添加至食品，例如遵从GRAS(在联邦规章集21CFR182下，一般认为安全的)的碱性氨基酸衍生物的任何盐。适当的盐包括例如盐酸盐、氢溴酸盐以及硫酸氢盐。\n[0021] 本申请的上下文中的碱性氨基酸是具有高于7的等电点(pI)的氨基酸。碱性氨基酸的组内的优选氨基酸是天然氨基酸，即天然存在的氨基酸。它们包括赖氨酸(pI为\n9.74)、精氨酸(pI为10.76)和组氨酸(pI为7.59)。赖氨酸和精氨酸的衍生物的使用是优选的。\n[0022] 在本说明书的上下文内，术语碱性氨基酸的聚合物包括5-1000个碱性氨基酸单体的聚合物，包括多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚组氨酸。多聚化的程度可优选在5与500个单体之间，更优选5至100个单体之间，最优选10至50个单体之间变化。多聚赖氨酸是L-赖氨酸的同聚物并且优选使用。多聚赖氨酸可以以α-多聚赖氨酸、ε-多聚赖氨酸或其混合物的形式使用并且优选以ε-多聚赖氨酸的形式使用。ε-多聚赖氨酸优选包含通过游离羧基与ε-氨基之间的肽键连接的25至35个L-赖氨酸单体。\n[0023] 多聚赖氨酸可商购获得并且通常通过好氧细菌发酵产生。\n[0024] 在本说明书的上下文中，术语碱性氨基酸α-酰胺的酯意指具有酯基团和连接至氨基酸的α碳的酰胺基团而非羧酸基团和氨基的碱性氨基酸。氨基酸的碱性侧链可以是游离的或以盐的形式存在。这样的碱性氨基酸α-酰胺的酯的盐形式具有下列结构：\n[0025] \n[0026] 其中X是抗衡离子例如Br、Cl或HSO4;R1是具有8至14个碳原子的线性烷基链；\nR2是芳基或1至18个碳原子的线性或支链烷基链；并且R3是下列之一：\n[0027] \n[0028] 并且n为0至4。\n[0029] 碱性氨基酸α-酰胺的酯优选是精氨酸的α-酰胺的酯。这样的酯的具体实例是月桂酰精氨酸酯。月桂酰精氨酸酯衍生自月桂酸和精氨酸，特别是，精氨酸单盐酸盐的月桂酰胺的乙酯。月桂酰精氨酸酯(也称为Minerat -N和月桂酰胺精氨酸乙酯，即LAE)可从月桂酸、乙醇和L-精氨酸合成。LAE可以以一系列浓度从商购获得(以结合在麦芽糊精载体上的粉剂形式和以可直接添加至食品的丙二醇中的LAE单盐酸盐溶液的形式)。\n[0030] LAE的盐酸盐的化学结构如下：\n[0031] \n[0032] 不同碱性氨基酸衍生物的组合可用作组分b)。例如，组分b)可以是不同碱性氨基酸聚合物的组合、不同碱性氨基酸α-酰胺酯的组合或碱性氨基酸聚合物与碱性氨基酸α-酰胺酯的组合。\n[0033] 因此，可将EGCG例如与LAE组合、与多聚赖氨酸组合或与LAE和多聚赖氨酸组合使用。\n[0034] 本文中描述的方法有利地需要相对低的量的必须添加至酸性食品的a)和b)组分的每一种组分。\n[0035] 以足以产生酵母抑制的量和比例添加两种组分。为特定酸性食品选择抗酵母剂的每一种组分的最佳量和比例完全在本领域技术人员的能力之内。最佳量和比例可通过例如利用本领域技术人员已知的方法比较对其添加了EGCG与碱性氨基酸衍生物的不同组合的酸性食品中的酵母菌落形成单位(CFU)的量来进行估计。\n[0036] 通常可将EGCG以0.0001至2wt.%，优选0.001wt.%至1wt.%，更优选0.01wt.%至\n0.5wt.%，更优选0.01wt.%至0.1wt.%的浓度添加至酸性食品中。\n[0037] 通常可将碱性氨基酸衍生物以0.00001wt.%至1wt.%，优选0.0001wt.%至\n0.1wt.%，更优选0.0005wt.%至0.01wt.%，更优选0.001wt.%至0.005wt.%的浓度添加至酸性食品中。当将不同碱性氨基酸衍生物的组合用作组分b)时，不同碱性氨基酸衍生物(例如LAE和多聚赖氨酸)之合的浓度通常也为0.00001wt.%至1wt.%，优选0.0001wt.%至0.1wt.%，更优选0.0005wt.%至0.01wt.%，更优选0.001wt.%至0.005wt.%。\n[0038] 重量百分比是指每酸性食品的总重量中活性化合物的重量，活性化合物为EGCG(而非绿茶提取物)和碱性氨基酸衍生物(不包括盐阴离子)。其中将组合的组分a)和b)添加至酸性食品的重量比率可以为0.01a:1b至5000a:1b，具体地5a:1b至2000a:1b，优选10a:1b至1000a:1b，更优选50a:1b至500a:1b以及更优选100a:1b。\n[0039] 可将EGCG和碱性氨基酸衍生物各自单独地或作为预混合物添加至酸性食品。可以以固体形式(例如作为粉剂)或液体形式(例如作为溶液、分散体或糖浆)添加每一种组分或预混合物。还可通过载体将抗酵母剂添加至食品。适当的载体包括硅石、环糊精和/或麦芽糊精。通常，对于液体、颗粒状或糊状食品，优选通过将抗酵母剂与酸性食品混合来进行添加。还可通过例如喷雾将抗酵母剂施用至食品表面上。\n[0040] 还可将其它添加剂单独地或与EGCG和/或碱性氨基酸衍生物预混合添加至酸性食品。也显示抗酵母活性的一定增强的优选添加剂包括香兰素、肉桂提取物、单和/或双甘油酯、啤酒花浸膏(hop extract)、肉桂酸或其盐、己酸、六偏磷酸钠、脂肪酸乳酰乳酸盐(例如癸酰乳酰乳酸钠和月桂酰乳酰乳酸钠)、山梨酸或其盐、丙酸或其盐以及来自Purac的培养糖(例如PuraQ Verdad NV10和PuraQ Verdad NV15，其由玉米葡糖的发酵产物例如糖、有机酸、肽和芳香化合物组成)。其它添加剂包括例如风味增强剂、pH调节剂、抗氧化剂、乳化剂和防腐剂。即使本发明的方法通常免去对使用其它食品防腐剂剂的需要，但必要时可添加它们。\n[0041] 一般地，优选地添加至酸性食品的所有组分根据GRAS是安全的。还优选地，添加剂不会在例如口味、质地和颜色方面不利地影响酸性食品的感官质量。\n[0042] 发现本文中描述的方法非常有效地抗通常与食品腐败相关的酵母，例如念珠球菌属(Candida)(例如白色念珠菌)、酵母(例如酿酒酵母)和接合酵母属(例如拜耳接合酵母)。\n[0043] 在其它方面，本发明涉及用于添加至食品的包含表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、月桂酰精氨酸酯(LAE)和多聚赖氨酸的组合物和包含EGCG、LAE和多聚赖氨酸的酸性食品。\n[0044] 如上所述，可按照本文中描述的方法有效地使用包含a)EGCG和b)LAE及多聚赖氨酸的组合物。因此，组合物可以以0.01a:1b至5000a:1b，优选5a:1b至2000a:1b，优选\n10a:1b至1000a:1b，更优选50a:1b至500a:1b和更优选100a:1b的重量比包含组分a)和b)。\n[0045] 包含a)EGCG以及b)LAE和多聚赖氨酸的酸性食品通常包含浓度为0.0001wt.%至2wt.%，优选0.001wt.%至1wt.%，更优选0.01wt.%至0.5wt.%以及更优选0.01wt.%至0.1wt.%的a)和浓度为0.00001wt.%至1wt.%，优选0.0001wt.%至0.1wt.%，更优选\n0.0005wt.%至0.01wt.%以及更优选0.001wt.%至0.005wt.%的b)，即LAE和多聚赖氨酸的总和。\n[0046] 本发明进一步通过下列实施例来举例说明，本发明不限定于这些实施例。\n[0047] 实施例1:酵母的抑制\n[0048] 具有53wt.%的EGCG的绿茶提取物EGCG50购自Layn,Lijiang,China。ε-多聚赖氨酸(50wt.%的多聚赖氨酸)购自Chisso,Japan。LAE,Minerat -N(40wt.%)购自Vedeqsa,Spain。\n[0049] 白色念珠菌(Candida albicans)分离自商业饮料，酿酒酵母(CBS2190)和拜耳接合酵母(CBS6708)获自CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures)。\n[0050] A)最小抑制浓度的测定\n[0051] 将酵母培养物于25°C在螺旋盖试管中生长在液体培养基(每升：5克来自Oxoid Ltd.,England的过滤的麦芽提取物、40克葡萄糖和5克来自Becton Dickinson,USA的细菌蛋白胨(Bacto Peptone)，pH3.5，按照制造商的说明书制备的)中生长至少48小时。\n[0052] 为了测定MIC，如上所述利用递增量的抑制剂制备液体培养基。\n[0053] 将200μl的包含每一种抑制的培养基转移至一组无菌96孔微量滴定板。将完成的孔板于4°C贮存直至进一步使用。为了接种含抑制剂的液体培养基，使用5μl的72至\n84小时生长的培养物。接种后96小时，测量每一种成分的光密度(OD)。获得的MIC值示于表1中。\n[0054] 表1\n[0055] \n[0056] *测试的最高量\n[0057] B)组合测试\n[0058] 评估EGCG与多聚赖氨酸或LAE的组合对酵母的抑制。\n[0059] 将酵母培养物生长在模型饮料中，所述模型饮料每升去矿质水包含：40g的蔗糖、