榄香烯脂肪乳注射液及制备方法

1、一种榄香烯脂肪乳注射液，其特征在于该注射液的重量/体积％ (g/ml)组成为榄香烯0.05～0.25％、注射用大豆油10～30％、磷脂选择 注射用蛋黄卵磷脂1.0～1.5％或注射用大豆磷脂0.8～1.5％、注射用甘 油2.0～2.5％、注射用水加至100ml。
2、一种如权利要求1所述的一种榄香烯脂肪乳注射液的制备方法， 其特征在于该方法是在惰性气体保护下，将注射用磷脂以及榄香烯高 速搅拌至均匀制成油相，另将注射用甘油加入盛有适量注射用水容器 内，混匀后过滤至澄明，加热至40～70℃制成水相，在高速搅拌下 将油相与水相混合制成初乳并用10％氢氧化钠溶液调节pH值8.0～ 10.0，加注射用水至全量将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒检 查合格，粒子＜1μ以下占97％以上，再经微孔滤膜过滤，灌装于 250～500ml玻瓶中，通氮、加胶塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115 ℃30分灭菌，检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。

技术领域：\n本发明属药物制剂技术领域。具体涉及一种榄香烯脂肪乳注射液 及制备方法。\n背景技术：\n榄香烯是从姜科植物郁金(莪术)中提取的抗癌有效成份，以β -榄香烯为主要成份，同时含有少量δ、γ-榄香烯及其萜类化合物。\n祖国医药认为莪术性温、味苦辛，有行气破血、消积止痛、抗肿 瘤功效。六十年代末，进行抗癌试验亦见于报导。七十年代初，有人 将莪术挥发油局部应用治疗宫颈癌有一定疗效。大连医科所在七十年 代初用温州产莪术进行抗癌实验研究，发现其挥发油对各种小鼠体内 肿瘤有明显治疗效果，已将榄香烯制成注射液及口服液。但该注射液 系用吐温-80为增溶剂，含量高达10％，不符合国家有关吐温-80用 量规定。于是大连医科所又进行剂型改进，以磷脂为乳化剂制成榄香 烯乳注射液(20ml∶100mg)，可用于胸腔及静脉给药。\n1996年，榄香烯乳注射液获得国家西药二类新药证书，其批准 文号为(ws-049(x-041)-96-(2))。经上万例的临床应用，证实本品 具有抗肿瘤效果，对治疗癌性胸腹水，颅内肿瘤、肝癌具有良好效果， 并能缓解癌性疼痛和提高机体免疫力作用，为一种非细胞毒广谱抗肿 瘤新药。但在静脉给药时，存在严重的静脉刺激和疼痛，静脉炎发生 率高达30％左右，使患者无法忍受。借鉴国外对静脉刺激性大的药物 如麻醉药丙泊酚、依托米酯等溶解于油相中制成水包油乳剂以降低静 脉炎的发生率和减轻疼痛程度。\n发明内容：\n本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计榄香烯 的新制剂，提高药效，降低副作用。\n本发明提供了一种榄香烯脂肪乳注射液，该注射液的重量％组成 包括榄香烯0.05～0.25％、注射用大豆油10～30％、注射用蛋黄卵磷脂 1.0～1.5或注射用大豆磷脂0.8～1.5％、注射用甘油2.0～2.5％、注射用 水加至100ml。\n本发明的注射液为水包油乳剂，250ml∶250mg，其用量每次为榄 香烯250～750mg。经药理试验证实其静脉刺激性和疼痛程度比现有制 剂减轻。并且因本制剂采用大豆油作溶媒、卵磷脂作乳化剂，使其在 临床治疗时还能提供人体热能和必需脂肪酸等营养成份，尚具有临床 营养支持功效。\n本发明的榄香烯注射液对动物疼痛及血管刺激试验结果如下：\n1、受试物：\n配制方法：10％脂肪乳注射液含0.1％榄香烯(I号)、20％脂肪乳 注射液含0.1％榄香烯(II号)及20％脂肪乳注射液含6％右旋醣酐及 0.1％榄香烯(III号)三个样品均采用原液。参照品原榄香烯乳注射液 以生理盐水稀释，榄香烯浓度从0.5％稀释至0.1％(IV)。\n2、试验内容：\n(1)小鼠扭体试验：\n实验动物：昆明小鼠，每组实验10～20只，雌雄各半。\n剂量及给药途径：I、II及III号三个榄香烯脂肪乳注射液样品均采 用原液1ml/只小鼠，即1mg/只小鼠。参照品原榄香烯乳注射液(现 已改名为榄香烯注射液)采用生理盐水稀释后榄香烯浓度1m/1mIV 号样品，给药浓度也为1ml/只小鼠，即1mg/只小鼠。各样品试液均 采用腹腔途径给药。(备注：按常规腹腔途径给药的体积为0.5ml/只 小鼠，本次实验的预试验发现受试物若给0.5ml/0.5mg/只小鼠未出现 “扭体”反应。为强化受试物的应激条件，将其给药的体积增至1ml/ 只小鼠)。\n小鼠扭体试验方法：在室温20℃±2℃条件下，将受试液注入小 鼠腹腔内，使小鼠因刺激而引起腹部深部的、大面积而持久的疼痛反 应。统计观察各组小鼠0～15分钟及15～30分钟内产生“扭体”(腹部 内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)的次数，以各组小鼠引起“扭体” 的次数，进行统计。\n小鼠扭体试验结果：三个被筛选I、II、III号三个榄香烯脂肪乳注 射液样品对小鼠扭体刺激基本不出现反应，它们对小鼠扭体刺激十分 明显低于原榄香烯乳注射液IV。详见表1。\n表1小鼠扭体试验                                                               (1)n＝5；(2)n＝10   样品   雌鼠扭体数X±SD   雄鼠扭体数X±SD   0～15分钟   15～30分钟   0～15分钟   15～30分钟   原榄香烯乳   IV号   (1)13.6±11.1   (2)12.4±7.5   (1)0.4±0.8   (2)0.2±0.4   (1)3.2±6.4   (2)5.3±5.2   (1)1.4±0.9   (2)0.8±1.0   10％榄香烯乳   I号   (1)2.2±4.9   (2)0.6±1.2   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0   20％榄香烯乳   II号   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0   (3)0   (4)0   20％乳+低右   III号   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0   (1)0   (2)0\n注：1、括弧内1及2分别表示两次实验结果\n2、第1次实验每组小鼠10只，第2次每组20只，均雌雄各半。\n(2)小鼠热板致疼痛试验：\n实验动物：昆明小鼠，体重20±2克，每组实验10～20只，雌雄 各半。\n剂量及给药途径：I、II及III号三个榄香烯脂肪乳注射液样品均采 用原液0.3ml/只小鼠，即0.3mg/只小鼠。对照品IV号给药浓度也为 0.3ml/只小鼠，即0.3mg/只小鼠。各样品试验均采用右后足趾皮下给 药。\n小鼠热板致疼痛试验方法：小鼠后足趾皮下注射0.03ml试液后， 置于20℃±1℃的热板上，观察小鼠出现疼痛反应的时间以及给药后 5分钟内出现疼痛的次数，所得结果与原榄香烯乳注射液比较按下式 进行计算。\n拟定的标准：舔足1次计2分\n            提足1次计1分\n            上述动作连续超过5分钟累加1次\n            出现刺激时间：即开始出现舔足或提足时间(秒)\n抑制刺激的百分率＝\n[(阳性组刺激计分-试验组刺激计分)/阳性组刺激计]分×100％\n出现刺激时间的延长率＝\n[(试验组出现刺激时间-阳性组出现刺激时间)/阳性组出现刺 激时间]×100％\n小鼠热板法致疼痛试验结果：I、II、III号三个被筛选的榄香烯注 射液样品对小鼠热板致疼痛反应无论初次出现刺激的时间或疼痛都 明显低于原榄香烯乳注射液对照品IV号，结果详见表2、3、4。\n小鼠热板试验：\n表2：                                                                           n＝10(雌雄各半)   样品   出现刺激时间(秒)   刺激积分   雌性   雄性   总平均分   雌性   雄性   总分   原榄香烯乳   27.2±2.0   34±13.9   30.6   22.9±16.2   14.8±7.1   18.85   10％榄香烯乳   71.2±19.5   65.8±22.6   68.5   5.3±4.1   2.4±1.9   3.85   20％榄香烯乳   84.6±26.9   83.0±31.2   83.8   4.4±4.2   1.0±1.3   2.70   20％乳+低右   96.4±48.0   119.2±1.6   107.8   2.6±3.8   0.2±0.6   1.40\n表2：                                                                            n＝10(雌雄各半)   样品   出现刺激时间(秒)   刺激积分   雌性   雄性   总平均分   雌性   雄性   总分   原榄香烯乳   39.6±11.2   21.6±2.0   30.6   27.1±12.0   21.9816.6   24.5   10％榄香烯乳   58.0±9.5   64.2±35.7   61.1   6.7±2.3   5.1±3.4   5.9   20％榄香烯乳   82.4±20.9   83.8±33.7   83.1   2.8±2.8   1.4±2.4   2.1   20％乳+低右   95.2±18.4   104.6±31   99.9   6.0±11.8   0.1±0.3   3.05\n表3   样品   出现刺激时间延长率％   刺激抑制率％   第1次   第2次   第1次   第2次   10％榄香烯乳   123.8   99.6   79.5   75.9   20％榄香烯乳   173.8   171.5   85.6   91.4   20％乳+低右   252.2   226.4   92.5   87.5\n注1：以上数据均与原榄香烯乳注射液比较。\n(3)家兔耳缘静脉连续滴注的刺激试验：\n实验动物：家兔6号，体重2.5～3.0kg，雄性。\n剂量及给药途径：I号样品每天以20～25ml/1h耳缘静脉滴注，每 天给药量10mg/kg，连续给药8天，总剂量为80mg/kg。对照品IV号 样品，以相同的剂量方案给药。阴性对照组为生理盐水。\n家兔耳缘静脉刺激试验结果：\n大体观察：给药的前3天未见明显耳缘静脉刺激反应，至第5天各组出 现不同程度的刺激。在给药的过程中发现原榄香烯乳组的耳缘出现强 直刺激状。改进的制剂所出现的程度很轻。\n病理观察：各组耳缘均分6段观察。榄香烯脂肪乳注射液(静脉用) 虽与原榄香烯乳注射液具有相似的血管刺激症状，但刺激程度较轻， 而且未见血栓形成；且刺激发生的范围也较原榄香烯乳注射液为小。\n注：本实验是在以上两种实验的基础上进行的，因此仅选用了一个10％ 榄香烯脂肪乳注射液(静脉用)做比较。\n药理刺激试验结论：三个处方榄香烯脂肪乳注射液(静脉用)对 所选用的3种动物致疼痛及致刺激模型进行的试验，均能反映出新设 计的榄香烯脂肪乳输液较原榄香烯乳注射液均能明显地减轻疼痛及 血管刺激。\n本发明的榄香烯脂肪乳注射液抗肿瘤药效学试验结果如下： 抗肿瘤药效学：\n1、体外细胞毒试验：榄香烯脂肪乳注射液体外对人体肝癌细胞株QGY、 肺癌细胞株LAX、乳腺癌细胞株Bre-04、肠癌细胞株Col-06及白血 病等肿瘤细胞株的增殖抑制作用，其IC50值介于60-120ug/ml之间。\n2、体内抗肿瘤试验：榄香烯脂肪乳注射液体内以80mg/kg、40mg/kg 及20mg/kg高、中、低三个剂量iv×10qd的治疗方案对人体肝癌 QGY异种移植于裸小鼠皮下接种模型的抑瘤率分别为：44.90％、35.71％ 及31.12％；对人体胃癌MKN-45异种移植于裸小鼠皮下接种模型的抑 瘤率分别为：41.70％、32.26％及26.42％；对小鼠黑色素瘤K111静脉 接种的人为肺转移模型的抑瘤率分别为：56.28％、48.38％及42.91％； 对小鼠脑胶质瘤G-422颅内接种模型的延长生命率分别为：68.23％、 55.29％及49.41％以及对小鼠脑胶质瘤G422皮下接种模型的抑瘤率分 别为：35.16％、30.59％及23.29％。\n3、榄香烯脂肪乳注射液体内合并不同化疗药对各种小鼠肿瘤模型的 抗肿瘤疗效：榄香烯脂肪乳注射液采用80mg/kg、40mg/kg及20mg/kg 高、中、低三个剂量iv×10qd单独用药的治疗方案对小鼠肉瘤S180 皮下接种模型的抑瘤率分别为：37.14％、33.02％及28.25％，合并CTX 15  mg/kg，ip×7qd后的抑瘤率提高为：55.24％、52.06％及49.84％；合并 MMC 1mg/kg，ip×7qd后的抑瘤率分别从单独用药的38.13％、33.11％、 28.09％提高为：55.18％、53.18％及51.51％；对小鼠脑神经胶质瘤G-422 颅内接种模型合并VM-26mg/kg，ip×7qd后的生命延长率分别从单独 用药的60.60％、41.41％、32.32％提高为：92.93％、83.84％及73.74％； 对小鼠Lewis肺癌皮下接种模型合并DDP 1mg/kg，ip×7qd后分别从单 独用药的32.06％、28.63％、25.19％提高为：54.96％、52.67％及51.15％； 对小鼠黑色素瘤K111静脉接种的人为肺转移模型合并DDP 1mg/kg，ip ×7qd后的肺转移抑制率从单独用药的54.20％、44.14％、38.89％提高 为：58.36％、55.56％及53.86％。榄香烯脂肪乳注射液体内合并不同化 疗药对各种小鼠肿瘤模型的抗肿瘤疗效均有不同程度的提高，其中以 小鼠脑神经胶质瘤G-422颅内接种模型合并VM-26的效果最为明显。\n4、榄香烯脂肪乳注射液体内合并放疗对小鼠肝癌模型的抑瘤率：榄 香烯脂肪乳注射液采用80mg/kg、40mg/kg及20mg/kg高、中、低 三个剂量iv×10qd单独用药的治疗方案对小鼠肝癌H22皮下接种模 型的抑瘤率分别为：37.97％、33.62％及26.96％，合并放疗500拉德 后的抑瘤率提高为：61.16％、59.71％及60.00％；\n5、免疫功能试验：榄香烯脂肪乳注射液体内以80mg/kg、40mg/kg及 20mg/kg高、中、低三个剂量iv×10qd给药对荷Lewis肺癌小鼠 NK、淋巴细胞增殖活性，以及对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能均有 较明显的促进和提高。\n6、减毒试验：榄香烯脂肪乳注射液对CTX所致C57BL/6小鼠的白细 胞影响与阳性对照云芝糖肽组相似，影响不明显，但也不增加化疗药 的骨髓抑制。\n小鼠最大耐受量试验：\n对昆明小鼠静脉给药的最大耐受量为40mg/Kg，为临床每天用药 剂量(400～700mg/50Kg/次)的3～5倍。\n静脉局部刺激试验\n实验结果表明：榄香烯脂肪乳注射液应用于静脉注射时，对家兔耳 缘静脉血管刺激试验，以原液1mg/ml/Kg浓度的剂量，每天一次，连续三 天后，实验显示榄香烯乳注射液对家兔耳静脉血管无明显的与药物 有关的刺激反应。\n过敏试验\n实验结果表明：榄香烯乳注射液对豚鼠过敏试验中，未见明显过 敏反应。\n溶血试验\n实验结果表明：榄香烯乳注射液对家兔红血球溶血试验呈阴性 反应。\n本发明的另一目的是提供了上述榄香烯脂肪乳注射液的制备方 法，该方法是在惰性气体保护下，将注射用蛋黄磷脂(或注射用大豆 磷脂)以及榄香烯高速搅拌至均匀制成油相。另将注射用甘油加入盛 有适量注射用水容器内，混匀后过滤至澄明，加热至40～70℃制成 水相，在高速搅拌下将油相与水相混合并用10％氢氧化钠溶液调节 pH值8.0～10.0，加注射用水至全量将初乳经二步高压匀质机反复乳 化至乳粒检查合格(粒子＜1μ以下占97％以上，再经微孔滤膜过滤 灌装于250～500ml玻瓶中，加通氮、胶塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌 器中115℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。\n本发明的制剂质量如下：\n1、性状：本品为白色的乳状液体。\n2、鉴别：\n取本品3ml，置试管中加乙醇1ml，摇匀后沿管壁缓慢加1％香草 醛硫酸液0.5ml，在两液层交界处显紫红色环，摇匀后显紫堇色。\n在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照 品峰的保留时间一致。\n3、检查项目：PH值、有关物质、游离脂肪酸、乳粒大小、热原、 无菌及有关注射剂项下的各项规定。\n4、含量测定：榄香烯  采用气相色谱法测定\n5、有关物质检查：主要检查游离脂肪酸(采用化学法测定)及有关 杂质(采用气相色谱法测定)。\n6、稳定性试验：\n榄香烯乳注射液经影响因素试验(光照、40℃、60℃、80℃加 速10天)；40℃恒温加速三个月后，其含量无明显变化，而游离脂肪酸 值及PH随着时间及温度有所变化，即PH稍有降低，游离脂肪酸值 有所增加，但均能符合所订质量标准。其它如外观、乳粒大小等均无 明显变化，初步证明本品在室温贮放可稳定二年左右。\n本发明的制剂产品有如下生物活性\n1、抑制肿瘤细胞生长：体内、体外研究表明，本品对多种肿瘤细胞 有作用。\n2.免疫保护作用：本品能增强T淋巴细胞亚群的功能。\n3.升白作用：本品不引起骨髓抑制，用药期间白细胞数无明显下降， 对放疗和其他化疗药引起的白细胞减少有一定保护作用。\n4.放.化疗协同作用：本品与其他化疗药物联合应用(如顺铂、足叶 乙甙、长春新碱、阿霉素等)有一定的协同作用。\n5.营养作用：本品为脂类制剂，能为机体提供高能量和必需脂肪酸 营养。\n6.能通过血脑屏障：血脑屏障的存在是影响颅内肿瘤化疗的一个重 要因素，本品的药代动力学实验表明：经3H标记的榄香烯可通过血 脑屏障进入脑内，其分布与含量除肺部较高外，脑组织与其他组织相 似。实验肿瘤学证明以脑瘤原位接种的小鼠有较高的延长生命率。\n作用机理\n1.直接抑制肿瘤细胞生长，对正常细胞(如外周血白细胞等)影响较 小。\n2.通过提高机体免疫功能起到抑制癌肿的作用。\n3.作用于细胞周期S期与G2及M期的调控点，阻滞S期细胞进入 G2+M期，降低肿瘤，细胞分裂能力，抑制其增殖。\n4.通过干扰肿瘤细胞生长代谢，诱发肿瘤细胞快速发生细胞凋亡。\n毒理作用\n急毒和长毒实验证明：本品毒副作用低微。静脉注射的LD50为 270.07±18.93mg/kg；对小鼠无致畸突变作用。用狗和大鼠静脉给药 连续90天进行长期毒性实验，结果各种动物的血象及肝、肾功能等 生化指标均无明显变化。\n适应症\n主要适用于肺癌、脑癌、肝癌、胃癌等。\n用法与用量\n静脉注射：每日1次，400-600mg/次，静脉缓慢滴注15天为 一疗程。选取较粗静脉血管，两臂交替使用，最好使用套管针。如能 采用锁骨下静脉注射最佳。\n具体实施方式：\n实施例一：\n在氮气保护下，称取注射用大豆油120g，加热至70℃，加入注射 用蛋黄卵磷脂13g和榄香烯0.8g，高速搅拌至均匀，制成油相。另 将注射用甘油23g，加入适量注射用水混匀后加热至60℃过滤后在高 速搅拌下与油相混合制成初乳，然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值 9.5，加注射用水至1000ml将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒 检查合格(粒子＜1μ以下占97％以上)，再经微孔滤膜过滤，灌装 于250～500ml玻瓶中，通氮、加塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115 ℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。\n实施例二：\n在氮气保护下，称取注射用大豆油200g，加热至60℃，加入榄香 烯1.5g，高速搅拌至均匀，制成油相。另将注射用甘油22g加入适量 注射用水混匀后在高速搅拌下再加入注射用大豆磷脂8g混匀后加热 至70℃，在高速搅拌下与油相混合制成初乳，并用10％氢氧化钠溶 液调节pH值8.5，加注射用水至全量1000ml将初乳经二步高压匀质 机反复乳化至乳粒检查合格(粒子＜1μ以下占97％以上)，再经微 孔滤膜过滤灌装于250～500ml玻瓶中，通氮、加塞、轧盖于回转式 蒸汽灭菌器中115℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射 液。\n实施例三：\n在氮气保护下，称取注射用大豆油150g，加热至80℃，加入注射 用蛋黄卵磷脂14g和榄香烯1.2g，高速搅拌至均匀，制成油相。另将 注射用甘油24g，加入适量注射用水混匀后加热至50℃过滤后在高速 搅拌下与油相混合制成初乳，然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值8.5， 加注射用水至1000ml将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒检查 合格(粒子＜1μ以下，再经微孔滤膜过滤灌装于250～500ml玻瓶中， 通氮、加塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115℃30分灭菌。检查合格 后即成榄香烯脂肪乳注射液。