具有葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶活性的多酶产物及其制备方法

1.一种具有葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶活性的多酶产物， 其特征在于由用选自ATCC 76060、ATCC 76061、MUCL 28815、 MUCL 28816和NRRL 3112菌株的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 发酵的麦麸组成，所述葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶活性具有 如下最低值：
—葡糖淀粉酶：每克干物质至少12525nkat，
—蛋白水解酶：每克干物质至少100PU，
—木聚糖酶：每克干物质至少1670nkat。
2.权利要求1的产物，其特征在于其葡糖淀粉酶活性为每克干物质 至少25050nkat。
3.权利要求1的产物，其特征在于其木聚糖酶活性为每克干物质至 少5010nkat。
4.一种具有葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶活性的多酶产物， 其特征在于由用黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 201202菌株发酵的 麦麸组成，所述葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶活性具有如下最 低值：
—葡糖淀粉酶：每克干物质至少1670nkat，
—蛋白水解酶：每克干物质至少100PU，
—木聚糖酶：每克干物质至少5010nkat。
5.权利要求4的产物，其特征在于其木聚糖酶活性为每克干物质至 少6680nkat。
6.多酶产物的制备方法，其特征在于该方法包括步骤(a)选取麦 麸；(b)对所述麦麸加湿和进行热处理以便灭菌；(c)用选自ATCC 76060、ATCC 76061、MUCL 28815、MUCL 28816和NRRL 3112菌 株的黑曲霉菌株接种得到的麦麸；(d)麦麸呈至少10cm厚的层状， 在一个定期通风和搅拌的反应器中在28～38℃下固态发酵1～3天， 将所述麦麸的初始水含量调节到50～60wt％并且在发酵期间保持不 变，在适当的通风条件下发酵以免对发酵有害的二氧化碳在反应器中 积累，并且避免由于发酵致使温度升高超出指定范围，直到发酵产物 具有如下酶活性最低值为止：
—葡糖淀粉酶：每克干物质至少12525nkat，
—蛋白水解酶：每克干物质至少100PU，
—木聚糖酶：每克干物质至少1670nkat。
7.多酶产物的制备方法，其特征在于该方法包括步骤(a)选取麦 麸；(b)对所述麦麸加湿和进行热处理以便灭菌；(c)用ATCC 201202 的黑曲霉菌株接种得到的麦麸；(d)麦麸呈至少10cm厚的层状，在 一个定期通风和搅拌的反应器中在28～38℃下固态发酵1～3天，将 所述麦麸的初始水含量调节到50～60wt％并且在发酵期间保持不变， 在适当的通风条件下发酵以免对发酵有害的二氧化碳在反应器中积 累，并且避免由于发酵致使温度升高超出指定范围，直到发酵产物具 有如下酶活性最低值为止：
—葡糖淀粉酶：每克干物质至少1670nkat，
—蛋白水解酶：每克干物质至少100PU，
—木聚糖酶：每克干物质至少5010nkat。
8.权利要求6的方法，其特征在于该黑曲霉菌株为菌株ATCC 76061。
9.权利要求6-8中任何一项的方法，其特征在于包括使在步骤(d) 中得到的产物进行冷冻或干燥的另外步骤。
10.权利要求1-3中任一项的产物在由小麦制备乙醇方面的应用。
11.权利要求3-5中任一项的产物作为单胃动物饲料添加剂的应用。

技术领域\n本发明涉及具有葡糖淀粉酶、蛋白水解酯和木聚糖酶活性的多酶 产物以及借助黑曲霉(Aspergillus niger)通过麦麸固态发酵制备该 产物的方法。\n背景技术\n借助酶方法由玉米淀粉制备乙醇属于已知内容，该方法包括采用 α-淀粉酶使淀粉液化旨在使淀粉水解为糊精的步骤、然后用葡糖淀粉 酶(也称作淀粉葡糖苷酶)进行糖化旨在将糊精水解为葡萄糖的步骤， 以及最后是将葡萄糖发酵成为乙醇的步骤。\n当以通过湿法研磨玉米得到的比较纯的淀粉乳液为原料时，使用 α-淀粉酶和葡糖淀粉酶一般是令人满意的，但当希望用小麦淀粉或面 粉代替玉米淀粉时，使用这两种单独的酶就不能得到令人满意的结果， 其原因在于半纤维素的存在使糖化面粉汁的粘度增大至无法实施该方 法的程度。在糖化步骤中，应该使用辅助性的酶如纤维素酶和半纤维 素酶以降低粘度和解决此问题。另外，在糖化过程中还希望使用蛋白 酶以使面粉的蛋白质水解，这样就使汁液中富含可溶性氮以供后面的 乙醇发酵步骤使用。这样便可以降低在此发酵的过程中以传统方式进 行酵母生长所需氮源的供应。\n所有这些酶在市场上都是以纯品的形式单个获得的，但缺点是比 较昂贵，因而提高了由生产小麦乙醇的成本。另外，应该由单个的酶 配制组合物，这就使该方法复杂化。\n因此，需要一种廉价并且具备葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和半纤维 素酶活性的多酶产物，使得能够以较低的成本由小麦面粉制备乙醇。\n本发明的目的就是满足此需要。\n发明内容\n本发明涉及一种具有葡糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶活性的 多酶产物，其特征在于它由借助黑曲霉菌株发酵的麦麸构成，所述葡 糖淀粉酶、蛋白水解酶和木聚糖酶的酶活性具有如下最低值：\n—葡糖淀粉酶：每克干物质至少100GU，\n—蛋白水解酶：每克干物质至少100PU，\n—木聚糖酶：  每克干物质至少100XU，\n条件是，葡糖淀粉酶活性是每克干物质至少750GU和/或木聚糖酶 活性是每克干物质至少300XU。\n葡糖淀粉酶活性优选是每克干物质至少1500GU和/或木聚糖酶活 性优选是每克干物质至少400XU。\n同样地，蛋白水解酶的活性优选是每克干物质至少400PU。\n本发明还涉及此多酶产物的制备方法，其特征在于包括步骤(a) 选取麦麸；(b)对所述麦麸加湿并进行热处理以便灭菌；(c)用黑曲 霉菌株接种得到的麦麸；(d)麦麸形成至少10cm厚的一层，在定期通 风和搅拌的反应器中在28～38℃、优选32～36℃下固态发酵1～3天， 调节所述麦麸的初始湿含量在50～60wt％并在发酵过程中基本上保持 不变，发酵在适当的通风条件下进行，以免对发酵有害的二氧化碳在 反应器内聚集并且避免由于发酵而导致温度升高超过指定的范围，直 至发酵产物具有如下的酶活性最低值为止：\n—葡糖淀粉酶：每克干物质至少100GU，\n—蛋白水解酶：每克干物质至少100PU，\n—木聚糖酶：每克干物质至少100XU，\n条件是，葡糖淀粉酶活性是每克干物质至少750GU和/或木聚糖酶 活性是每克干物质至少300XU。\n葡糖淀粉酶活性优选是每克干物质至少1500GU和/或木聚糖酶活 性优选是每克干物质至少400XU。\n同样地，蛋白水解酶活性优选是每克干物质至少400PU。\n黑曲霉菌株优选自菌株NRRL 3112、菌株ATCC 76061以及在寻求 高葡糖淀粉酶活性时由所述这些菌株通过选择或突变而得到的菌株。 特别优选菌株ATCC 76061。\n当寻求高葡糖淀粉酶活性时，用作原料的麦麸应该是未脱淀粉的 麸皮。除了这个限制以外可以使用任何麦麸。但该麦麸优选含有大量 (至少40wt％)小于1mm的颗粒。\n下面以说明和非限定的方式给出两种适当的麦麸的特征。\n特征                           麦麸A         麦麸B\n湿度(％)                       12.3          19.5\n蛋白质含量(％MH*)             13.8          14.8\n淀粉含量(％MH*)               24.6          21.3\n粒度测定\n＞1.25mm                       53.9          0.7\n1.0～1.25mm                    8.1           1.3\n0.5～1.0mm                     33.3          68.2\n0.25～0.5mm                    3.7           24.6\n0.16～0.25mm                   0.3           2.6\n＜0.16mm                       0.7           2.6\n％MH＝相对于湿物质的％\n此麦麸应该被加湿和进行热处理以便灭菌。热处理最好不在加湿 以前进行，因为在加湿前热处理麦麸的情况下，观察到不良发酵结果。 热处理可以包括在比如高压釜中加热。在120～121℃下于高压釜中处 理20分钟结果非常令人满意，但是苛刻程度较低的条件(在105℃下 于烘箱中灭菌15分钟)同样适用。还可以通过向麦麸注入水蒸气来进 行热处理，这可以同时进行麦麸的加湿操作。\n在加湿时，最好将pH值调节到4～5.5，以改善热处理的灭菌效果 和启动所希望的发酵过程。\n除了有灭菌功能以外，热处理还有助于使麦麸中所含的淀粉发生 胶凝化，因此有助于获得黑曲霉真菌的培养基，使得更有效地进行发 酵。\n麦麸的加湿是很重要的，因为水含量能够影响到发酵的性能。麦 麸的初始水含量开始时被调节到麦麸和水的总质量的50～60％，优选 50～55％，在整个发酵过程中通过比如定期供应水以补充介质中水的损 失，使得湿含量基本上保持在此范围内。“基本上保持”的意思是指在 两次相继调节湿含量之间或者在发酵结束时一段比较短的时间内，可 以允许湿含量略微偏离数值范围50～60％(±5％个单位)。在各种情况 下湿含量最好不降低到低于45％。在培养过程中，在通过真菌生长所 引起的温度升高的影响下造成的蒸发，使得培养介质的湿含量趋于降 低，所述的介质是热的不良导体。使用的水的质量也起着不可忽视的 作用。可以使用优质的自来水或蒸馏水。\n可以用各种适当的接种物进行麦麸的接种。本领域技术人员都知 道由选择的菌株制备适当的接种物的多种方法。接种量最好为每克初 始干物质至少1×107个孢子。\n可以在各种适当的反应器中进行发酵。在《农业食品工业的高技 术》(Agro-Food-Industry Hi-Tech)(1997年5～6月刊第39～42 页)刊载的A.Durand等人的文章叙述适用的反应器实例。\n发酵进行的时间为1～3天，优选30～60小时。短于1天时发酵 过分地不完全。3天后，发酵已完成或接近完成，再延长将不经济。 介质温度一般保持在28～38℃，优选在32～36℃，这对应于有待在本 发明中使用的黑曲霉菌株的已知的最佳活性范围。为此，在发酵的前 几个小时最好将空气温度调节在34～38℃以便有助于孢子的萌发，然 后再发酵的其余时间内将该温度降低到28～32℃，以有助于控制介质 温度。\n对发酵介质的pH值一般不进行调节。如果其初始值接近6.0～ 6.4，在培养的过程中pH值降低到3.8～4.2，然后在结束时重新升高。 此回升一般与真菌的孢子化期有关。监视pH值的演变构成对培养状 态的良好指征。\n此发酵罐应该通风，优选被连续通风，以供应发酵所需的氧气并 避免由发酵所产生的二氧化碳过分积累。另外，通风参与培养介质的 温度和湿度控制。空气优选基本上被水饱和，以抑制介质变干的倾向。 对通风的流量很难给出定量的指标，因为存在许多变量，特别是反应 器的尺寸和几何形状、麦麸的装填量等。但是，通过简单的常规试验， 本领域技术人员能够容易地确定在每种实际情况下所适用的通风流 量。\n在发酵过程中，应该借助搅拌装置如臂式搅拌器、刮片或刮刀， 或者蜗杆定期地将麦麸加入发酵罐中以免形成不透水的料层并且以便 于在整个麦麸层上尽可能均匀地进行通风。尽管如此，还是应该避免 可能对真菌产生有害作用的过于剧烈的搅拌。\n本发明的产物是一种特别适用于由小麦制备乙醇的固态产物。它 可以被直接加入在液化步骤中得到的液化淀粉(糊精)中，以进行糖 化反应。对于此应用，葡糖淀粉酶的活性才是最重要的因素。因此， 优选使用葡糖淀粉酶活性例如为每克干物质至少750GU，优选至少 1500GU的本发明产物。\n本发明产物的其它可能的用途涉及以小麦为基础制造单胃动物如 家禽和猪的饲料。在这样的应用中，木聚糖酶的活性成为最重要的因 素。因此，在这样的应用中将优选使用具有例如每克干物质至少400XU 的高木聚糖酶活性的产物。\n如果必要，可以将本发明产物干燥或冷冻以将其保存。\n应该在适中的温度下进行干燥以便不对酶的活性产生不利影响。 比如在40℃的烘箱中进行加热被证实是合适的。冷冻能够在低温如-20 ℃下对湿产物进行。\n在实施例中，用如下的方法测定不同的酶活性。\na)葡糖淀粉酶活性\n在淀粉溶液中葡糖淀粉酶(GA)制剂的作用导致释放出还原糖。 在3，5-二硝基水杨酸(DNS)存在下在100℃下加热，这些组合物在 540nm下用分光光度计(意大利，米兰的Kontron仪器公司)测量显 示棕色。\n反应介质含有：\n—1％淀粉溶液：             500μl\n—pH值为4.5时0.1柠檬酸盐缓冲液        450μl\n—酶溶液                              50μl\n反应在60℃下进行30分钟(对于米曲霉的葡糖淀粉酶是55℃)。 每5分钟取样一次，与DNS混合，放在冰浴中。然后在100℃下加热5 分钟，迅速冷却，然后在540nm下计量。\n在研究了温度和pH值对我们的GA制剂活性的影响后，已经确定 了计量的各项条件。使用Merck(德国Darmstadt)可溶性淀粉作为这 种酶水解的底物。按照P.Bernfeld在《酶学方法》(Methods in enzymology)，1，149～158(1955)中建议的操作程序制备DNS，该 程序如下：\n—预先溶解：\n*10g3，5-二硝基水杨酸，\n*200ml 2mol氢氧化钠，\n*200ml蒸馏水，\n—然后添加：\n*300g酒石酸钾钠复盐，\n—在完全溶解以后用蒸馏水将体积补足到1升。\n一旦制备完毕，此试剂就应该保存在避光处。用葡萄糖作为参照 化合物确定标定曲线，以测定葡糖淀粉酶活性或者监视液化-糖化反应 的进程，而用木糖测定木聚糖酶活性。\n葡糖淀粉酶活性单位(GU)对应于以葡萄糖作为参考，在计量的 条件下，每分钟释放1μmol的还原端所必需的酶的量。借助下列公式 计算葡糖淀粉酶活性，与单位初始干物质(MSI)的量相关联：\n              A＝(P/Venz)*(Vferm/Mferm)\n*A对应于用GU·gMSI-1(μmol·分钟-1·gMSI-1)表示的葡糖淀粉酶活 性，\n*P对应于用μmo l·分钟-1表示的葡萄糖当量的释放速度，\n*Venz表示以ml为单位的被计量的酶溶液的体积，\n*Vferm是以ml为单位的用于萃取酶溶液的蒸馏水的总体积，\n*Mferm以MSI的克数为单位，对应于萃取成酶溶液的干产物的初始 质量。\nb)蛋白水解酶活性\n此计量是按照Béinon在其著作《蛋白质的提纯方法—实用的方法》 (Proteins Purification Methods-a Practical Approach)，Harris E.L.V和Angal，S出版，IRL-Press，牛津大学出版社，1～66(1989) 中叙述的方法，用偶氮酪蛋白完成的。由蛋白水解酶使此底物分解， 导致释放出偶氮基团，此基团在340nm处吸收紫外线。此蛋白质水解 动力学中吸光度的变化表明此反应的进度。\n反应介质中含有：\n*pH值为5.0的1％偶氮酪蛋白溶液：      1000μl\n*酶溶液：                            200μl\n将偶氮酪蛋白(美国，Saint-Louis的Sigma公司)溶解于0.1MpH 值为5.0的醋酸盐缓冲液中。在此pH值下进行蛋白水解酶活性的计量， 因为在pH值低的醋酸盐缓冲液中酪蛋白是不溶的。在60℃下进行酶 反应。在分钟内每隔5分钟取样一次，与5％三氯乙酸(TCA)混合使 反应终止。\n蛋白水解酶活性的单位(PU)对应于在上述条件下通过释放偶氮 基团导致每分钟增加0.01单位A340nm所必需的酶的量。此活性用下面 指出的公式计算，与初始干物质(PU·G-1MSI)或葡糖淀粉酶活性 (PU·GU-1)相关联：\nA＝(P/Venz)*(Vferm/Mferm)\n*A对应于用GU·gMSI-1表示的蛋白水解酶活性，\n*P对应于用每分钟增加0.01A340nm单位表示的偶氮基团释放速度，\n*Venz表示以ml为单位的被计量的酶溶液的体积，\n*Vferm是以ml为单位的用于萃取酶溶液的蒸馏水的总体积，\n*Mferm以MSI的克数表示，对应于萃取成酶溶液的干产物的初始质 量。\nc)木聚糖酶活性\n为了证实木聚糖酶的活性，让葡糖淀粉酶制剂与可溶性木聚糖溶 液反应，并用DNS法测量释放的糖还原物。\n反应介质的组成如下：\n*pH值为4.5的1％木聚糖溶液：    900μl\n*酶溶液：                      100μl\n在pH值为4.5的柠檬酸盐缓冲液中制备1％落叶松的木聚糖(Sigma 公司)溶液并在60℃下进行反应。在20分钟内，每隔5分钟取样一 次，与DNS混合并放入冰浴中。然后用木糖作为参照物，按照与测量 葡糖淀粉酶活性时相同的操作程序进行计量。\n木聚糖酶活性单位(XU)对应于每分钟释放1μmol蔗糖还原物所 需的酶量，此活性与初始干物质量(XU·g-1MSI)或葡糖淀粉酶活性 (XU·GU-1)相关联。为了计算此活性，我们再次采用用于计算葡糖淀 粉酶活性的公式，其中：\n*A对应于木聚糖酶的活性，用XU·gMSI-1(μmol·分钟-1·gMSI-1)表示，\n*P对应于木糖当量的释放速度，以μmol·分钟-1表示，\n*公式的其它项没有改变。\n下面给出非限定性的实施例以说明本发明。\n实施例1—曲霉菌株的选择\n以对比的方式研究7种市售不同曲霉菌株通过在麦麸固体介质中 发酵制备葡糖淀粉酶的能力。\n用在锥瓶中的50克发酵介质进行试验。此介质含有21.5克麦麸、 27.5克水和1克小麦淀粉。此介质的初始pH值为6.0～6.5。此介质 在120℃的高压釜中灭菌20分钟。\n每种介质在每克初始干物质上接种上2×107个待测试的菌株的孢 子。孢子龄是3天。发酵40～50小时，将锥瓶放入35℃的烘箱。在 发酵结束时，将发酵介质与150ml蒸馏水混合，以便将得到的酶制成 溶液，然后过滤回收酶溶液。将此溶液进行离心处理，除去孢子和残 留颗粒，然后在100ml的瓶中调制该溶液，将其保存在-20℃，直至分 析其葡糖淀粉酶活性为止。\n下面的表1汇总了被测试的菌株和得到的结果：     菌株种保藏编号 发酵时间   (小时)   葡糖淀粉酶活性     (GU·g-1MSI) 黑曲霉ATCC 76060     50     627 黑曲霉ATCC 76061     50     943 黑曲霉MUCL 28815     40     710 黑曲霉MUCL 28816     40     631 黑曲霉NRRL 3112     50     1056 黑曲霉ATCC 22788     50     903 黑曲霉ATCC 42149     50     861\n我们看到，菌株黑曲霉NRRL 3112、黑曲霉ATCC 76061和米曲 霉ATCC 226788在制备葡糖淀粉酶时都呈现出最佳活性。\n然而，要考虑的另一个重要性能是制备的葡糖淀粉酶的稳定性。 因此通过在55～60℃下将酶溶液进行30分钟热处理并且在此期间结 束时测定葡糖淀粉酶活性来测试热稳定性。此处理接近于淀粉糖化的 使用条件。业已发现黑曲霉ATCC 76061和黑曲霉NRRL 3112能给出 最稳定的葡糖淀粉酶(在55℃下30分钟后，残留活性为100％，在 60℃下30分钟后，残留活性为大约50％)，而米曲霉菌株ATCC 22788 和ATCC 42149所给出的葡糖淀粉酶，在60℃下30分钟后的残留活 性为0％，而在55℃下30分钟后的残留活性为46％。因此我们就选 择了黑曲霉菌株ATCC 76061和NRRL 3112。此外，黑曲霉菌株NRRL 3112已经被证实一般是很不稳定的(在几个繁殖周期以后就失去活 性)，因此最优选的菌株就是黑曲霉菌株ATCC 76061。因此，在下面 的实施例中就使用这个菌株。\n实施例2-用50升未灭菌的INRA供应的中试槽制备葡糖淀粉酶： 麦麸预处理的重要性\n按照A.Durand等人的文章所述的方法(图1)采用未灭菌的50 升发酵罐和BCE麦麸(由法国Provins的Brie香槟乙醇酒厂提供) 进行试验。实施两种麦麸制备模式得到5kg湿含量为55％的培养介质：  \n—干麦麸：麦麸在105℃下在高压釜中处理1小时，然后与水混合 (试验F4C3)；\n—湿麦麸：麦麸在和面缸中被加湿至45％并且在121℃下在高压釜 中处理20分钟(试验F4C4)。\n在这两种情况下，用2×107个孢子/克干物质接种，将介质的水含 量调节到大约55％。然后在通风槽中在10cm高的层上发酵。在此培养 的过程中，借助刮刀间断在介质上划刻条痕以降低温度。在发酵期间， 通过其温度、湿度和流量都如表中所示的调节空气恒定地更新气氛。\n在表2(试验F4C3)和表3(F4C4)中给出了结果。\n这些数据导致得出几条结论：\n—对于制造有效的葡糖淀粉酶，在热处理之前加湿麦麸是必要的。 除了净化作用以外，麦麸的热处理确实有利于淀粉的胶凝化；\n—pH值表现为真菌葡糖淀粉酶生长和产生进展情况的良好的定性 指标，但并不能以此来估计所得到的葡糖淀粉酶数量；\n—介质的轻微扰动(划痕)不会改变酶的产生；\n—在这两种发酵过程中水含量的变化表明培养介质明显地变干， 这将有害于真菌的生长。\n实施例3：用Fujiwara公司供应的中试发酵罐生产葡糖淀粉酶： 在发酵的过程中保持介质湿度的重要性\n用日本冈山的Fujiwara公司销售的中试发酵罐和BCE麦麸进行此 试验。与在实施例2中使用的发酵罐的差别尤其是此罐的直径为 0.66m，而INRA罐的直径是0.35m。在此发酵罐中，需要按照实施例2 中所述的湿麦麸模式制备的20kg含水55％的介质，在12cm的厚度上 进行培养。用三根恒速转动的垂直蜗杆来保证搅拌，这将在转动(5～ 10转/分钟)的罐中混合介质。在发酵的过程中，象在实施例2的INRA 罐一样，要通过其温度、湿度和流量如在表4所示的调节空气恒定地 更新气体氛围。\n在被称作FII的此试验过程中，研究了调节湿度的时机。利用使 用红外线的设备进行培养物湿度的瞬时测定，以及进行介质质量的瞬 时测定，用此来确定为了将介质的水含量保持在高于50％所须加入的 水量。\n此试验FII的结果报道在表4中。得到的结果得出如下的评论：\n—FII明显地指出，将水含量保持在50～55％有利于酶的产生，在 发酵44小时后释放出1600GU/gMS，这是在未受益于这种调节方法的 实施例2的F4C2试验过程中得到的活性的两倍以上；\n—从培养44小时起，与真菌孢子的显现相关的酶产生的稳定化过 程表明，从这个时期以后就不必再继续进行培养；\n—通过将对空气进行调节与对介质进行搅拌良好地结合就能够令 人满意地将介质温度控制在35℃左右；\n—培养物经受得了由Fujiwara发酵罐的搅拌系统所进行的间断混 合而不会造成损害。\n实施例4：在50升带有搅拌器的INRA中试发酵罐中生产葡糖淀粉 酶：用蒸汽进行麦麸的预热处理和在“灭菌条件”进行培养的效用\n此中试发酵罐与WO-A-94 18306中和上述A.Durand等人的文章 中图4上的发酵罐相似。这种发酵罐能够以工业规模优选的制备模式 用蒸汽直接处理在发酵罐中的麦麸。除了取样以外，也是在灭菌的条 件下进行培养物的制备、接种和培养，这使得此试验是半灭菌的，并 且不同于前面两个实施例。\nA)试验条件\n在发酵罐中装入9kgBCE麦麸，用1.5升水进行预湿化，然后在121 ℃下就地进行灭菌20分钟，同时每隔5分钟定时搅拌5秒钟。此处理 能够使湿含量达到46％，随后在接种时调节到55％。\n用酒曲类制剂将此麦麸接种。\n将180克在35℃下已经发酵4天的BCE麦麸(初始湿含量55％) 与3升灭菌水混合，得到组成接种物的孢子悬浮液。\n发酵的初始条件如下：\n18.3kg湿含量为55％、初始pH值为5.7的培养物；\n层厚40cm；\n通风流量：314升/分钟；\n空气进口温度：35℃；\n在进口处空气的相对湿度：95％。\nB)对发酵的监控\n除了测量pH值、介质温度、干物质百分比和葡糖淀粉酶产量外， 还要连续记录在搅拌的50升发酵罐中培养物质量的变化，而对于未灭 菌发酵罐，在发酵21小时和42小时分别称量培养物的重量。\n对培养物进行这些测量具有两重意义：\n通过估计干物质的百分比保持培养过程中的湿度\n在发酵过程中，有两个现象会促使培养物质量减少，这涉及到：\n—一方面是介质干涸，希望通过添加水进行补偿，\n—另一方面是干物质的损失，这与真菌生长有关。\n此干物质的损失是不能忽略的，在培养40小时时会损失20％干物 质，如果近似地认为损失是线性的话，对应于每小时损失0.5％干物质。\n由此可见，知道在每个瞬间的培养物的质量M(t)，就能够通过如下 关系式推算时刻t的理论干物质的百分比：\n％MS理论(ι)＝MSI(MSI，0.5％)t/M(t)\n这里MSI是初始干物质的量。\n当如此计算的此MS％超过50％时，就加入灭菌水，使此百分比回复 到45％。\n用初始干物质的克数表示结果\n测量到的质量变化和干物质百分比的变化使计算培养过程中实际 的干物质损失(PMS用％表示)成为可能。这样一来，由下式就可以把刚 才用GU·g-1MS表示的葡糖淀粉酶的数量表示为以GU·g-1MSI表示。\n(GU·g-1MSI)＝(GU·g-1MS)·(100-PMS)/100\nC) 结果\n表5和6概括了操作条件和在对麦麸蒸汽搅拌的发酵罐中得到的 结果。\n尽管采用被水饱和的空气通风培养物，但是介质还是会干涸，使 得当水含量降低到低于50％时，必须两次重新调节水含量，如表5所 示。\n由于入口处空气的下降使得能够将温度保持在平均值35℃，但尤 其是通过间断搅拌来实现。\n在这些培养条件下，在60小时内真菌都保持生长，这可以通过测 量pH值来跟踪，这样就能在44小时内生产1436GU·g-1MS和在63小时 内生产1990GU·g-1MS。换算到初始干物质，葡糖淀粉酶的产量分别是 1160和1540GU·g-1MSI。为了进行比较，在实施例3中，在44小时内 培养的1605GU·g-1MS对应于1067GU·g-1MSI。此信息是有意义的，因 为它表明这两个试验的产率相同，但实施例4的试验条件使得酶的生 产甚至在层高为40cm的情况下得到延长。\n因此，采用水蒸气处理麦麸、然后在50升带有搅拌的INRA反应 器中发酵延长了真菌的培养和酶的生产。\n当转换成初始干物质时，葡糖淀粉酶的产量是1540GU·g-1MSI。\n对同样的试样，计量木聚糖酶和蛋白水解酶活性。得到的结果非 常令人满意，在发酵50小时后的平均最大值\n对于木聚糖酶是350XU·g-1MSI\n对于蛋白水解酶是400PU·g-1MSI\n由于对培养物连续地记录，能够计算出在培养过程中干物质的损 失。在培养60小时结束时大约损失23％(考虑到称量精度，有2％的误 差)。\n实施例5：使用在实施例4中制造的发酵麦麸进行小麦面粉的水解\n采用实施例4中得到的发酵麦麸对预先经过传统酶液化处理的小 麦面粉进行一系列糖化反应。用NOVO公司出售的葡糖淀粉酶制剂AMG 300L作为对照物。这些试验用通常的45型小麦面粉进行。对于750 克汁液，操作条件汇总在表7中。\n                                      表7     产物   AMG300L(NOVO)     发酵麦麸     干发酵麦麸     编号     AMG300升     实施例4     实施例4     外观     液体     湿麦麸     干麦麸     保存方式     +5℃     -20℃     环境温度     面粉     45型商品     45型商品     45型商品     用量(g)     300     300     300     介质中干物质     (％)     35     35     35     液化条件     1小时/88℃/pH6.1     1小时/88℃/pH6.2     1小时/88℃/pH6.2     酶     125μl透阿米尔     120L     125μl透阿米尔     120L     125μl透阿米尔     120L     糖化条件     44小时/58℃/pH4.6     40小时/58℃/pH4.55     44h/60℃/pH4.52     对应于3500GU     的数量     205μl     4.3g     2.1g\n在小麦面粉的水解过程中，每次提取三个介质试样。表8表示在 糖化过程不同瞬间糖还原物(S.R.)的浓度结果是这三次取样的平均 值。按照DNS技术进行的这些计量是用离心处理的试样的上清液进行 的。也测量了糖化产物的最终粘度。\n                                         表8     测量     AMG300L     (NOVO)     发酵麦麸   干燥发酵麦麸 S.R.浓度(初始g/l)     180.9±4.6     185.0±3.1     171.5±4.5 最终S.R.浓度(g/l)     327.5±18.5     325.0±22.5     348.3±19.1 粘度(mPa·s)     6.80     2.82     2.80\n另外，证实在由于发酵麦麸中蛋白水解酶的作用导致的糖化作用 后汁液中可溶氮的含量增加。\n这些结果表明，在实施例4中得到的发酵麦麸不管其储存方式如 何，能够以与葡糖淀粉酶的标准制剂同样功效水解小麦面粉。 与通常的酶制剂相比，用发酵麦麸水解面粉还导致粘度明显降低。\n实施例6\n此实施例说明用黑曲霉菌株制备大量木聚糖酶和少量葡糖淀粉酶 的可能性。\n此试验在Fujiwara中试发酵罐中使用BCE麦麸和已知能够制备木 聚糖酶的编号ATCC 201202的黑曲霉菌株进行。中试发酵罐的操作已 在实施例3中详细叙述过。在此实施例中使用了20kg如在实施例2中 制备的湿含量为55％的介质。如在实施例3中所示，在发酵过程中， 保持介质的湿含量高于50％，介质的温度控制在35℃左右。\n最后，在这些发酵条件下经过37小时以后，ATCC 201202黑曲霉 菌株产生具有727XU/gMS和162GU/gMS的发酵麦麸。\n实施例7：将本发明发酵麦麸加入到用于肉用仔鸡的基于小麦的家 禽饲料中的意义\n已知小麦面粉中的半纤维素部分溶解于水，可以增加肠内容物的 粘度，因而减少了营养物的释放和吸收。\n已经证实，加入半纤维素酶能够引起半纤维素降解，这样就能够 降低肠内容物的粘度并且改善采用其中唯一的谷物是小麦的饲料喂养 的单胃动物如肉用仔鸡的畜牧行为。\n用1200只Ross肉用仔鸡进行试验，通过与不含酶的饲料和含有 作为标准木聚糖酶源的Avizyme产物的饲料进行比较，以显示使用半 纤维素酶(木聚糖酶)载体发酵麦麸的意义。制备含有酶或不含有酶 的饲料喂养4批各300只雏鸡。这些饲料的组成如表9所示。饲养的 前21天使用生长饲料(AL CR)，然后在18天内代之以精细饲料(AL FI)。\n                表9 饲料     AL CR     AL FI 湿度(％)     10.6     11.4 蛋白质(％)     21.3     19.1 脂肪质(％)     6.1     6.4\n饲料1不含有任何酶。每吨饲料2和3分别添加3kg和5kg发酵 的麦麸。每吨饲料4添加0.6kg Avizyme.\n在喂养39天后将此测试结果汇总在表10中。\n                                    表10 饲料     1     2  3  4 本发明的发酵麦麸(kg/吨)a     -     3.0  5.0  - Finfeed的Avizyme(kg/吨)b     -     -  -  0.6 木聚糖酶活性(XU/kg饲料)     -     1,700  2,840  1,620 39天的消耗指数c     1.775     1.748  1.738  1.745 消耗指数减少率(饲料1％)d     -     1.52  2.08  1.69 死亡率     2.3     2.0  3.0  2.3\na.此发酵麦麸的葡糖淀粉酶活性为1000GU/gMS，蛋白水解酶活性 为125PU/gMS而木聚糖酶活性为600XU/gMS；\nb.Avizyme是由芬兰的Finfeed公司供货；\nc.所消耗的饲料重量与获得的重量之比\nd.这是饲料消耗重量相对于饲料1(不含酶)的消耗重量的降低百 分数；\n在家禽饲料中添加发酵麦麸(3或5kg/吨)能够明显地降低消耗 指数。在此试验条件下，使用高于3kg/吨的发酵麦麸用量似乎没有实 际的意义。所观察到的改善与使用对照商品Avizyme(0.6kg/吨)所 得到的结果是相当的。但是，使用此发酵麦麸的优点是成本低于使用 商品酶产物。\n不言而喻，所叙述的实施模式只是实例，可以对其特别是通过等 同技术替换在不偏离本发明范围的条件下进行改进。\n表5-经过水蒸气处理的麦麸在带有搅拌的50升发酵罐中FMS的物理-化学参数   培养时间   (小时)   入口空气温度     (℃)   空气流量   (升/分钟)   空气相对湿度     (％) 介质平均温度     T   平均pH值   总质量     处理   0     35.0     314.0     94.6     5.70     18.30   13     36.1     312.7     92.6     38.8     4.72     18.00   13(搅拌后)     471.0     38.6     4.68   搅拌   16     29.8     448.6     94.6     32.4     4.60     17.50   搅拌   18     33.2     466.5     77.2     31.0     4.37     17.10   20.33     32.6     466.5     93.7     34.3     4.20     16.80   23.66     34.2     4.13     15.80   26     29.8     467.5     94.6     32.9     4.17     15.10   26     29.8     467.5     94.6     33.3     3.81     17.30   搅拌+2.5升水   36.75     29.0     467.5     94.6   搅拌   36.75     27.0     467.5     94.6     29.9     3.71     14.30   40.58     27.0     467.5     94.6     31.0     4.20     13.10   40.66     27.0     467.5     94.6     31.7     3.60     15.10   搅拌+2.1升水   44.58     448.6     33.6     3.71     14.10   47.17     467.5     34.8     4.04     13.30   50     27.0     303.3     94.6     32.0     4.09     12.80   搅拌   63.33     28.7     303.0     31.0     5.75     10.30\n表6：经过水蒸气处理的麦麸在带有搅拌的50升发酵罐中FMS的结果综合 培养时间 (小时)   水含量    (％) 干物质损失     (％)   干物质损失     ％(平滑)   平均   GU/gMS     平均   GU/gMSI    XU/gMS  XU/gMSI     PU/gMS    PU/gMSI     0   54.50     -2.07     0.00   0.00     0.0     0.0     0.0     0.0     13   57.52     7.78     0.4     92.69   85.48     16.1     16.0     131.0     130.49     16   53.72     2.11     1.0     170.53   166.92     19.2     19.0     196.2     194.15     18   55.23     7.21     1.8     129.25   222.01     27.9     27.4     103.9     102.02     20.33   51.90     1.91     3.1     429.36   421.18     35.0     33.9     193.7     187.63     23.66   50.88     5.57     5.9     551.93   521.21     51.0     48.0     283.4     266.81     26   49.06     6.15     8.2     651.45   611.36     75.4     69.2     296.5     272.14     26   57.76     10.57     8.2     548.42   490.44     54.1     49.7     262.1     240.57     36.75   49.27     10.75     18.4     1127.09   1005.88     203.5     166.2     359.1     293.20     40.58   51.14     20.55     20.5     40.66   58.72     22.54     22.0     1278.58   990.35     227.3     180.7     347.9     276.52     44.58   54.10     19.21     22.6     1436.16   1160.27     408.3     318.6     367.1     286.45     47.17   54.01     23.07     23.2     1535.69   1181.43     511.5     395.7     496.8     384.30     50   54.66     26.67     24.4     1742.78   1277.91     429.8     330.1     628.2     482.48     63.33   44.69     22.62     22.6     1989.07   1539.07     410.3     310.1     478.3     361.5\n表2 培养时间   (小时) 空气入口 温度(℃)    空气流量    (升/分      钟) 空气流量 (米/秒) 空气相对   湿度％ 平均介质   温度T   平均   pH值   湿度     ％     平均    GUA/gMS   培养时间   (小时)     F4C3     0.0     35     174.4     8.0     96     25.0     0.0    干麦麸    划痕(17小    时)    划痕(18小    时)     3.0     35     174.4     8.0     95     33.8   6.33     3.0     11.0     32     174.4     8.0     94     34.6   5.13     54.53     20.56     11.0     14.0     30     174.4     8.0     95     35.4   4.38     54.19     71.13     14.0     16.0     30     174.4     8.0     94     33.3   4.36     52.17     123.12     16.0     18.0     28     174.4     8.0     92     37.4   4.51     51.31     85.78     18.0     20.0     28     174.4     8.0     96     31.8   3.79     49.54     132.81     20.0     22.0     28     174.4     8.0     95     34.7   4.12     45.17     188.0     22.0     25.0     28     174.4     8.0     37.6   4.34     45.13     181.03     25.0     28.0     28     174.4     8.0     94     32.6   4.63     36.47     129.58     28.0     31.0     28     174.4     8.0     32.8   5.05     30.68     198.10     31.0     40.0     28     174.4     8.0     95     31.9   5.69     23.96     246.86     40.0\n表3 培养时间   (小时) 空气入口 温度(℃)  空气流量   (升/分     钟) 空气流量 (米/秒) 空气相对   湿度％ 平均介质   温度T   平均   pH值   湿度     ％     平均    GUA/gMS 培养时间   (小时)    F4C4   0.0   35     174.4     8.0     96     25.0     5.96     0.0    湿麦麸        划痕(14小    时)       划痕(18小    时)   3.0   35     174.4     8.0     95     33.8     6.12     3.0   11.0   32     174.4     8.0     94     35.1     5.06     53.93     135.77     11.0   14.0   30     174.4     8.0     95     39.9     4.66     53.04     121.02     14.0   16.0   30     174.4     8.0     94     33.1     4.59     51.53     182.96     16.0   18.0   28     174.4     8.0     92     38.0     4.48     50.80     327.41     18.0   20.0   28     174.4     8.0     96     34.3     3.72     51.76     360.25     20.0   22.0   28     174.4     8.0     95     36.9     3.70     47.65     618.00     22.0   25.0   28     174.4     8.0     36.3     4.15     41.68     658.05     25.0   28.0   28     174.4     8.0     94     30.9     4.53     35.73     660.03     28.0   31.0   28     174.4     8.0     30.8     5.18     33.98     583.62     31.0   40.0   28     174.4     8.0     95     30.2     4.88     30.02     702.74     40.0\n表4 搅拌     搅拌+3升 水   搅拌+2升 水   搅拌+6升 水   时间  (小时)  通风速度  转/分钟   空气湿   度(％) 空气入口温     度℃   介质温度     T℃   介质湿度％     pH值    GU/gMS    GU/gMSI    时间    (小时)     0     15     99.0     35.0     25.0     54.0     6.36     4.3     4.3     0     10     15     98.5     35.0     34.7     53.7     5.95     23.9     10     12     33.0     12     15     15     98.6     33.0     34.5     51.6     4.92     133.3     15     18     15     98.8     33.0     37.3     49.7     4.18     304.8     273.1     18     21     15     98.3     30.0     30.7     54.7     3.83     472.1     21     24     15     98.2     30.0     31.9     52.4     3.76     709.2     24     28     15     97.9     30.0     33.4     46.6     4.08     1198.0     28     29     25     98.0     30.0     51.6     1054.0     29     38     15     98.6     32.0     31.5     39.2     5.00     1469.7     976.1     38     39     15     99.0     32.0     60.6     1338.0     39     42     15     99.2     32.0     33.9     59.7     5.28     1514.8     42     44     15     98.1     32.0     34.1     54.8     5.76     1605.1     1067.6     44     46     15     96.8     32.0     33.7     52.6     6.33     1601.0     46     66     15     99.0     32.0     32.4     34.0     7.28     1594.4     1161.7     66