用于酒精发酵培养基的营养补充物

1.营养补充物，其用于从糖类原料开始的酒精发酵的培养基，所述营养补充物通过用霉菌发酵小麦麸皮而获得，并且包含以粗制或提取形式存在的、来自使用霉菌进行的发酵的活性成分，其中所述活性成分包括麦角固醇、N-乙酰葡糖胺、维生素、核酸和氨基酸；所述霉菌选自黑曲霉菌株ATCC 201202、ATCC 76060、ATCC 76061、MUCL 28815、MUCL 28816、NRRL 3112，或者选自米曲霉菌株ATCC 22788和ATCC42149；并且所述营养补充物具有至少一种下列酶活性：
■葡糖淀粉酶活性：至少500 GU/克干物质，
■蛋白水解酶活性：至少100 PU/克干物质，
■木聚糖酶活性：至少100 XU/克干物质。
2.根据权利要求1的营养补充物，其中所述糖类原料为含淀粉的原料。
3.根据权利要求1的营养补充物，其可以通过包括下列步骤的方法而获得：
i)取小麦麸皮，
ii)润湿，酸化至在4和5之间的pH，并热处理所述麸皮以对其进行巴斯德法灭菌或进行杀菌，
iii)用黑曲霉菌株或米曲霉菌株接种所得的小麦麸皮，所述黑曲霉菌株选自ATCC
201202、ATCC 76060、ATCC 76061、MUCL 28815、MUCL 28816、NRRL 3112，所述米曲霉菌株选自ATCC 22788和ATCC42149，
iv)在按时搅拌的反应器中发酵固体状态的小麦麸皮，其中温度为28℃至38℃，含水量保持在45重量％至65重量％，在为了避免小麦麸皮内部二氧化碳长久积累的通气条件下，直至发酵产物具有下列酶活性的最小值：
■葡糖淀粉酶活性：至少500GU/克干物质，和任选地
■蛋白水解酶活性：至少100PU/克干物质，
■木聚糖酶活性：至少100XU/克干物质。
4.根据权利要求3的营养补充物，步骤ii)中的热处理优选在所述润湿之后。
5.根据权利要求1的营养补充物，其中葡糖淀粉酶活性为至少750GU/克干物质。
6.根据权利要求5的营养补充物，其中葡糖淀粉酶活性为至少1500GU/克干物质。
7.根据权利要求1的营养补充物，其包含维生素B。
8.根据权利要求1的营养补充物，其包含一种或多种选自下列的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸。
9.从为含淀粉材料的糖类材料开始的乙醇制备方法，其包括在根据权利要求1至8中任一项的营养补充物存在下进行发酵的步骤，并且在液化步骤和任选的预糖化步骤之后包括在糖化-发酵培养基中的糖化-发酵步骤，所述糖化-发酵培养基中的葡萄糖含量在糖化-发酵步骤开始时至多等于相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量的95％，所述方法的特征在于，在所述糖化-发酵培养基中引入所述营养补充物。
10.根据权利要求9的方法，其中所述方法不包括预糖化步骤。
11.根据权利要求9的方法，其中葡萄糖含量在糖化-发酵步骤开始时至多等于相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量的3％。
12.根据权利要求9的方法，其中以粗制形式引入所述营养补充物，和其中所述营养补充物的量为大于或等于4kg干物质/吨淀粉，且小于或等于60kg干物质/吨淀粉。
13.根据权利要求9的方法，其中所述营养补充物构成糖化-发酵培养基中用于酵母的主要营养来源，和/或麦角固醇的主要来源，和/或氮和/或氨基酸和/或磷和/或硫和/或维生素的主要来源。
14.根据权利要求9的方法，其中糖化-发酵完全在缺乏空气或氧气供应下进行。
15.根据权利要求9的方法，其中糖化-发酵包括初始的需氧阶段。
16.根据权利要求9的方法，其中糖化-发酵在下列条件下进行：
-温度：30℃至35℃，
-pH：在糖化-发酵步骤开始时调整至在3.5和5之间，
6 8
-酵母接种物：10 至5×10CFU的酵母/毫升糖化-发酵培养基，
-20％至35％的干物质，
-停留时间：20小时至72小时。
17.来自根据权利要求9至16中任一项的乙醇制备方法的发酵粕，其包含多于5g的麦角固醇/吨发酵粕干物质。
18.根据权利要求17的发酵粕，其包含多于40％，按基于干物质的百分比计。
19.根据权利要求17的发酵粕，其包含多于50％的粗制蛋白质，按基于干物质的百分比计。
20.根据权利要求1至8中任一项的营养补充物的用途，所述用途为促进酒精发酵或促进用于制备酵母的预发酵。
21.酵母制备方法，该方法在预发酵罐中在需氧条件下进行，其特征在于，向所述预发酵罐中添加酒糟，所述酒糟是在施行根据权利要求9至16中任一项的方法时获得的。
22.根据权利要求21的方法，其中所添加的酒糟是澄清的和/或浓缩的酒糟。
23.根据权利要求9至16中任一项的乙醇制备方法，其中对于乙醇发酵使用通过根据权利要求21至22中任一项的酵母制备方法获得的酵母，所述酵母制备方法使用来自所述乙醇制备方法的酒糟。
24.根据权利要求23的方法，其中所述酒糟是澄清的和/或浓缩的酒糟。

用于酒精发酵培养基的营养补充物\n[0001] 本发明涉及促进通过酒精发酵来工业生产乙醇的营养补充物，所述酒精发酵尤其是依照同时糖化-发酵方法来进行，并且从可发酵成乙醇(任选地在糖化之后)的糖类原料，例如含淀粉的原料，特别是谷物，尤其是小麦，以及副产物(发酵粕( )、麸皮)开始。\n本发明还涉及来自该方法的发酵粕，和涉及在需氧条件下制备酵母的方法。\n[0002] 已知通过酶促过程从含淀粉原料开始来生产乙醇，所述酶促过程包括由α-淀粉酶对淀粉进行液化的步骤，以求溶解淀粉和将淀粉水解为糊精。常规地，该步骤之后为经由葡糖淀粉酶(也称淀粉葡糖苷酶)的糖化步骤，以求将糊精水解为葡萄糖。因此，在糖化结束时葡萄糖的含量显然为相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量(équivalent en glucose)的100％。换句话说，所使用的含淀粉材料的全部葡萄糖潜力均被转化成了葡萄糖。\n[0003] 然后，葡萄糖在发酵步骤的过程中被发酵，在所述发酵步骤期间它在厌氧条件下被酵母转化为乙醇。\n[0004] 为了改进这类酶促过程的一个研究方向在于尝试合并发酵步骤和糖化步骤。因此，研究者试图在称为“糖化-发酵”(“同时的糖化和发酵”)或SSF的单一步骤的过程中同时实现发酵和糖化。因此，在该单一步骤开始时，即在液化结束时，培养基中的葡萄糖含量通常低于相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量的3％。\n[0005] 还进行了一些尝试以限制糖化步骤的时间，从而使得在该步骤结束时葡萄糖的含量低于相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量的100％。因而，该糖化步骤被称为“预糖化”或“部分糖化”。\n[0006] 如将在说明书的后面部分中更详细地看到的那样，包括不完全糖化步骤，甚至没有糖化步骤的乙醇制备方法(本文中称为“具有不完全糖化的方法”)涉及一些特殊的限制。因此，可推断，于在发酵之前进行完全糖化的常规方法的情况下所采用的技术方案不能为这些方法所采用。\n[0007] 在具有不完全糖化的方法的情况下，“糖化-发酵培养基”指其中进行发酵和至少一部分的糖化的培养基。\n[0008] 存在对于提高乙醇生产方法的乙醇产率的永久需求，尤其是具有不完全糖化的乙醇生产方法。\n[0009] 本发明的目标在于满足这种需求。\n[0010] 根据本发明，这一目标通过一种营养补充物来达到，其在从含淀粉原料开始通过发酵的乙醇制备方法中用于糖化-发酵培养基，所述营养补充物包含来自使用霉菌进行的发酵的活性成分，和优选地由来自使用霉菌进行的发酵的活性成分组成。所述营养补充物可以是液体或固体的形式。\n[0011] 如将在说明书的后面部分中更详细地看到的那样，在糖化-发酵培养基中存在这样的营养补物被证实特别有利于酵母的生长和效力。由此导致从含淀粉原料开始的乙醇制备方法的产率显著提高。\n[0012] 优选地，根据本发明的方法包括一个，和更优选地几个下面的可选特征：\n[0013] ·营养补充物是所述活性成分和至少一种有用酶的固体或液体混合物。有用酶的概念尤其包括一种或多种具有淀粉酶尤其是葡糖淀粉酶活性、蛋白水解酶活性、木聚糖酶活性的酶，及其组合物。\n[0014] ·存在于根据本发明的营养补充物中的活性成分是粗制的形式(forme brute)，即其包含在用所述霉菌进行发酵时所使用的底物，或者是提取的形式(forme extraite)，即将其与所述底物相分离。任选地，其可以与另外的酶相混合。优选地，所述底物为小麦麸皮。\n[0015] ·所述活性成分选自麦角固醇、N-乙酰葡糖胺、维生素(特别是维生素B)、核酸、氨基酸，和优选地其混合物。在氨基酸中，尤其希望一种或多种，优选地全部的下列氨基酸：\n丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸。在维生素中，除了其他之外尤其注意了各种不同的维生素B，例如B1，B2，B3，B6和肌醇，维生素E的存在。\n[0016] ·当被引入糖化-发酵培养基中时，尤其是由于对于所述霉菌的适当选择，所述营养补充物表现出下列酶活性：\n[0017] ○葡糖淀粉酶活性：至少500GU/克干物质，优选地750GU/克干物质，更优选地\n1500GU/克干物质，和/或，优选地，\n[0018] ○蛋白水解酶活性：至少100PU/克干物质，优选地至少400PU/克干物质，和/或，优选地，\n[0019] ○木聚糖酶活性：至少100XU/克干物质，优选地至少400XU/克干物质。\n[0020] ·所述营养补充物是用霉菌对底物进行发酵(优选在固体培养基中)而产生的，所述底物优选为小麦麸皮，所述霉菌尤其选自黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，优选选自菌株ATCC 201202、ATCC76060、ATCC 76061、MUCL 28815、MUCL 28816、NRRL 3112，或者选自米曲霉(Aspergillus orizae)菌株，优选选自菌株ATCC 22788和ATCC 42149。\n[0021] ·所述营养补充物通过根据本发明的方法而获得，所述方法包括下列步骤：\n[0022] i)取小麦麸皮，\n[0023] ii)润湿；酸化至在4和5之间的pH，优选用硝酸(HNO3)；并热处理所述麸皮以对其进行巴斯德法灭菌或进行杀菌，所述热处理优选在所述润湿之后进行，\n[0024] iii)用黑曲霉菌株或米曲霉菌株接种所得的小麦麸皮，所述黑曲霉菌株选自ATCC 201202、ATCC 76060、ATCC 76061、MUCL 28815、MUCL 28816、NRRL 3112，所述米曲霉菌株选自ATCC 22788和ATCC 42149，\n[0025] iv)在按时搅拌的反应器中发酵固体状态的小麦麸皮，其中温度为28℃至38℃，含水量保持在45重量％至65重量％，优选50重量％至60重量％，在为了避免小麦麸皮内部二氧化碳长久积累的通气条件下，直至发酵产物具有下列酶活性的最小值：\n[0026] ■葡糖淀粉酶活性：至少500GU/克干物质，优选地750GU/克干物质，更优选地\n1500GU/克干物质，和优选地，\n[0027] ■蛋白水解酶活性：至少100PU/克干物质，优选地400PU/克干物质，[0028] ■木聚糖酶活性：至少100XU/克干物质，优选地300XU/克干物质。\n[0029] ·所述营养补充物为依照US 2002 037342中所描述的方法获得的酶复合物。\n[0030] 本发明还涉及从糖类材料(尤其是含淀粉材料)开始的乙醇制备方法，其在液化步骤、糖化步骤及随后的发酵步骤之后，或者在液化步骤和任选的预糖化步骤之后，包括在糖化-发酵培养基中的糖化-发酵步骤，所述糖化-发酵培养基中的葡萄糖含量在糖化-发酵步骤开始时至多等于相应于所述糖类材料(尤其是相应于所述含淀粉材料的淀粉)的葡萄糖当量的95％。根据本发明的方法值得注意之处在于，在发酵培养基或糖化-发酵培养基中引入根据本发明的营养补充物。该引入可以在发酵培养基或糖化-发酵培养基中直接进行，或在上游步骤时进行。\n[0031] 令人惊讶地，在发酵培养基或糖化-发酵培养基中存在根据本发明的营养补充物，和特别是存在用霉菌进行发酵的小麦麸皮，已被证实特别有利于提高酵母的效力。因而，酵母以更有利的动力学将更多量的葡萄糖转化为乙醇。\n[0032] 优选地，根据本发明的方法包含一个，和更优选地几个下面的可选特征：\n[0033] ·葡萄糖含量在糖化-发酵步骤开始时至多等于相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量的3％，优选至多等于2％，更优选至多等于1％。换句话说，所述方法既不包括糖化步骤也不包括预糖化步骤。\n[0034] ·以粗制形式引入所述营养补充物，所述营养补充物的量为大于或等于4kg干物质/吨淀粉，优选大于或等于14kg干物质/吨淀粉，和/或小于或等于60kg干物质/吨淀粉，优选小于或等于34kg干物质/吨淀粉，更优选小于19kg干物质/吨淀粉，优选为约\n17kg干物质/吨淀粉。\n[0035] ·所述营养补充物是通过这样的底物的发酵来制备的，所述底物与在其上应用了所述乙醇制备方法的糖类材料相同。\n[0036] ·所述糖化-发酵步骤完全在缺乏空气或氧气供应下进行(确切地说，没有需氧阶段)。\n[0037] ·所述糖化-发酵步骤包括初始的需氧阶段。\n[0038] ·将酵母用作乙醇发酵试剂，尤其是酵母属(Saccharomyces)的酵母，特别是酿酒酵(Saccharomyces cerevisiae)。优选地，所述酵母在乙醇浓度大于95g/l时是有功能的。\n[0039] ·在所述方法的过程中，所述营养补充物构成酵母的主要营养来源，和/或麦角固醇的主要来源，和/或氮和/或氨基酸和/或磷和/或硫和/或维生素的主要来源。优选地，其构成麦角固醇和/或氮和/或氨基酸和/或磷和/或硫和/或维生素的唯一来源。\n[0040] 根据本发明的方法还使得能够制备具有卓越的营养品质的发酵粕。因此，本发明还涉及来自根据本发明的乙醇制备方法的发酵粕，其包含多于5g，优选多于20g，和/或少于100g，优选少于35g，更加优选地约30g的麦角固醇/吨发酵粕干物质。\n[0041] 优选地，所述发酵粕还包含多于40％，优选多于50％的粗制蛋白质，按基于干物质的百分比计。如将在说明书的后面部分中看到的那样，通过在预发酵或糖化-发酵过程中消耗一部分半纤维素和纤维使得这样的蛋白质含量成为可能。\n[0042] 最后，一般地，本发明涉及根据本发明的营养补充物的用途，所述用途为促进用于制备乙醇的酒精发酵或用于制备酵母的预发酵。\n[0043] 进一步地，根据随后的描述以及对附图的查看将会出现本发明的其他特征和优点，其中图1显示了根据本发明的乙醇制备方法的一部分的示意图。\n[0044] 通过糖类材料(尤其是含淀粉材料)的发酵来制备乙醇的方法是本领域技术人员所熟知的，并且可以被改进以适于本发明。因此，本领域技术人员能够，在需要时，明确下面描述中的某些点。\n[0045] 下面描述的方法涉及从小麦开始制备乙醇，但可以应用于任何类型的含淀粉材料，特别是任何的谷物提取物。因此，下面描述的实施方案只是一些实例，可以对其进行修改，尤其是通过技术等效物的替代来进行修改，而不背离本发明的范围。\n[0046] 例如，根据本发明的从小麦制备乙醇方法可以包括下列步骤：\n[0047] a)小麦的温湿度调节(conditionnement)步骤，以便制备小麦淀粉的磨粉，[0048] b)淀粉的液化步骤，特别是在α-淀粉酶存在下，以便将淀粉水解为糊精。\n[0049] c)可选地，预糖化步骤，特别是用酶的组合来进行，以便将糊精水解为可发酵的糖(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖)和非淀粉的组分，以及\n[0050] d)糖化-发酵步骤，其在含有糊精和/或所述可发酵的糖以及酵母的糖化-发酵培养基中进行，以便生产乙醇。\n[0051] 这些不同的步骤显示在图1中。\n[0052] 步骤a)在于通过对所述小麦进行温湿度调节来制备小麦淀粉的磨粉，例如面粉。\n[0053] 因此，在混合器中将小麦面粉与水相混合，可选地使用酒糟、酸和液化酶，以形成“糊状麦芽汁( )”。\n[0054] 通常，所述糊状麦芽汁包含25质量％至35质量％的干物质，优选30％至35％。测定干物质的百分比以限制能量消耗，并同时保持令人满意的流动性。从经济上考虑，干物质的百分比尽可能地高，以便限制在该方法的随后步骤中酒糟蒸发的成本。提供给混合器的面粉的量通过计量器或者称量带(bande peseuse)来调节。\n[0055] 根据所使用的液化酶，应当用酸(例如硫酸)溶液来调整pH。根据所使用的酶，通常为细菌α-淀粉酶(尤其是热稳定的)，任选地可以采用钙盐。酸的流量通过安装在调浆机( )前的水/酒糟混合物上的pH探头来进行调节。根据所使用的酶，pH通\n常可在5和6.5之间变化。\n[0056] 然后，在80℃和95℃之间的温度下进行液化(步骤b))。糊状麦芽汁可通过往液化罐中经管道系统或喷射式煮浆锅(jet-cooker)直接注入蒸汽而加热至所述温度。在第二种情况下，在迅速冷却至80℃至95℃之前，通过往喷管中注入蒸汽，糊状麦芽汁在数秒钟之内被加热至100℃和150℃之间的温度。液化罐可以进行搅拌。\n[0057] 液化步骤的优选特征如下：\n[0058] ○温度：80℃至90℃\n[0059] ○pH：5.5-6.5\n[0060] ○干物质：30％至35％\n[0061] ○停留时间：30分钟至2小时\n[0062] 步骤b)导致淀粉水解为糊精。\n[0063] 在预糖化(步骤c))的情况下，液化的麦芽汁( )在板状交换器或管状交换器类型的热交换器中被冷却至50℃和60℃之间的温度。\n[0064] 在某些情况下，可用稀释剂，例如水或再循环酒糟或来自酒厂的回流液(flegmasses)来稀释液化的麦芽汁。\n[0065] 在步骤c)这一可选的步骤中，液化的麦芽汁优选地与具有所需酶活性的酶复合物相接触。\n[0066] 酶的流量优选地受控于进入的麦芽汁的流量、产生的葡萄糖的浓度和剩余的淀粉的含量。这种控制的目的是制备在发酵结束时无淀粉的溶液。\n[0067] 预糖化步骤c)的优选特征如下：\n[0068] ○温度：50℃至60℃\n[0069] ○pH：4至5\n[0070] ○停留时间：直至获得所需的葡萄糖含量，一般少于24小时。\n[0071] 预发酵罐经历机械搅拌，从而使得在糖化过程中麦芽汁能够更好地均质化，并因而促进酶和待水解的糊精之间的接触。\n[0072] 使用来自用霉菌对小麦麸皮所进行的发酵的酶复合物，有利地使得能够降低经糖化的麦芽汁的粘度并提高所述麦芽汁中的氮浓度。\n[0073] 根据本发明，糖化并不是一直进行到所有糊精被水解成葡萄糖为止，而是在只进行了部分水解时中止。根据本发明，在预糖化步骤结束时葡萄糖的含量低于95％，优选低于\n50％，更优选低于5％。因此，水解在糖化-发酵步骤期间继续进行。\n[0074] 如果根据本发明的方法不包括部分糖化步骤(或“预糖化”)，那么葡萄糖含量在糖化-发酵步骤d)开始时至多等于相应于所述含淀粉材料的淀粉的葡萄糖当量的3％，优选至多等于2％，更加优选至多等于1％。\n[0075] 在步骤d)中，麦芽汁在糖化-发酵培养基中与酵母接触。\n[0076] 其还与根据本发明的营养补充物接触。掺入酵母和补充物的次序不是重要的。\n[0077] 在施行步骤d)的整个过程中对整个体系进行搅拌。\n[0078] 可以使用所有用于乙醇生产的酵母，特别是酵母属的酵母。通常，在需氧条件下将酵母引入糖化-发酵培养基中。在这个阶段过程中，酵母完成一定次数的细胞分裂。因而，酵母不是将葡萄糖转化成乙醇，而是相反地消耗葡萄糖以用于其生长。为了改善这种细胞生长，已知需向糖化-发酵培养基中提供营养补充物。此外，为了限制细胞生长(与其有关的葡萄糖消耗降低了乙醇生产的产率)，优选的是在糖化-发酵培养基中接种一定量的酵母，从而通过所述酵母产生乙醇使得能够在培养基中快速达到抑制酵母细胞生长的乙醇浓度。\n[0079] 根据第一种方式，步骤d)在需氧环境下开始，并持续对于酵母的足够增殖而言所需的时间。\n[0080] 然后，将糖化-发酵培养基置于厌氧条件下。于是，酵母将葡萄糖转化成乙醇。\n[0081] 根据第二种方式，步骤d)完全在厌氧条件下进行。根据本发明的营养补充物的存在使得能够渡过初始的需氧阶段。\n[0082] 糖化-发酵步骤d)的优选特征如下：\n[0083] ○温度：30℃至35℃。\n[0084] ○pH：在步骤d)开始时用酸(例如硫酸)调整至约3.5至约5，优选约3.8至约\n5，更优选约4至约5，更佳地约4至约4.5。\n[0085] ○于在步骤d)开始时调整pH之后，由于营养补充物的缓冲效应，不用考虑在步骤d)的其余部分期间调节pH。\n[0086] ○酵母接种物：约106至约5×108CFU(集落形成单位)的酵母/毫升糖化-发酵\n7\n培养基，优选地约10CFU的酵母/毫升糖化-发酵培养基。\n[0087] ○20％至35％，尤其是20％至30％的干物质。\n[0088] ○停留时间：20小时至72小时，尤其是20小时至60小时。停留时间随干物质而增加。\n[0089] 根据本发明的糖化-发酵培养基包含根据本发明的营养补充物。所述补充物可以直接引入糖化-发酵培养基中，或在上游步骤时引入。令人惊讶地，在糖化-发酵培养基中添加这样的营养补充物(尤其是用霉菌进行发酵的小麦麸皮)被证实特别有利于提高酵母的效力。因而，酵母以更有利的动力学将更多量的葡萄糖转化为乙醇。另外，根据本发明的营养补充物使得能够减少在糖化-发酵步骤开始时的需氧阶段的持续时间，甚至取消该阶段。有利地，其产率得到提高。更有利地，与在所述营养补充物不存在下进行的相同培养相比较，根据本发明的营养补充物使得能够降低细胞的死亡率。最后，所述营养补充物的存在具有缓冲效应，从而避免了原本应当进行的pH调节。\n[0090] 根据本发明，优选地，就1000kg最初引入的淀粉而言，糖化-发酵培养基最初包含\n2.5kg至35kg的营养补充物(尤其是经发酵的小麦麸皮)，特别是8kg至10kg的营养补充物(尤其是经发酵的小麦麸皮)/1000kg淀粉。\n[0091] 因此，在糖化-发酵培养基中经发酵的小麦麸皮的存在使得能够显著减少糖化-发酵的时间。\n[0092] 看来所述营养补充物按最佳比例和以最佳形式提供了完全适合于酵母的营养物，特别是对于厌氧培养而言。\n[0093] 并不局限于某一理论，本发明的发明者用下面的方式解释了这些结果。他们发现，在根据本发明所使用的营养补充物中存在酵母所必需的氨基酸。因此，这些氨基酸以非常有效的方式对酵母的氮营养作出了贡献，尤其是以比迄今所使用的简单铵盐有效得多的方式，此外还减少了发酵副产物例如甘油的合成，并因此提高了乙醇的产率。\n[0094] 根据本发明的营养补充物中维生素的存在也使得能够解释酵母的较好的效力。\n[0095] 最后，本发明者发现，根据本发明的营养补充物包含麦角固醇和N-乙酰葡糖胺，它们是酵母的重要组成成分。它们在糖化-发酵培养基中的存在有助于在完全厌氧条件下的酵母的生长和良好的功能。在厌氧条件下，由酵母合成其是不可能的。因此，麦角固醇的存在有利地使得能够减少，甚至取消在糖化-发酵开始时的需氧阶段。\n[0096] 然而，下面表1的试验表明，添加所鉴定的营养物不能导致与添加根据本发明的营养补充物一样出色的糖化-发酵培养基。因此，正是所述营养补充物的全部组分的组合(以由用霉菌进行发酵而得到的比例)，和优选地它们以小麦麸皮形式的呈现，是所获得的非凡性能的原因。\n[0097] 所述营养补充物可能不表现出特殊的酶活性或最佳的酶活性。因此有必要添加一些酶。\n[0098] 然而，优选地，在乙醇发酵制备方法的情况下，根据本发明的营养补充物也表现出某些有用的酶活性。特别地，所述营养补充物优选地表现出大于500GU/克干物质的葡糖淀粉酶活性。更优选地，所述营养补充物表现出大于100PU/克干物质的蛋白水解酶活性和/或至少100XU/克干物质的木聚糖酶活性。\n[0099] 因此，尽管可以考虑使用其他的酶如纯化的酶或纯化的酶的复合物，但根据本发明优选的是，在使其能够表现出所述酶活性的条件下使用经发酵的营养补充物。那么优选地，在步骤d)中，和/或在需要时，在步骤c)中，作为酶复合物引入这种营养补充物。\n[0100] 优选地，所述营养补充物为经发酵的小麦麸皮，其依照下面的根据本发明的方法而制得或者可以依照下面的根据本发明的方法来获得：\n[0101] i)取小麦麸皮，\n[0102] ii)润湿并热处理所述麸皮以对其进行巴斯德法灭菌或进行杀菌，所述热处理优选在所述润湿之后进行，\n[0103] iii)用黑曲霉菌株或米曲霉菌株接种所得的小麦麸皮，所述黑曲霉菌株选自ATCC 201202、ATCC 76060、ATCC 76061、MUCL 28815、MUCL 28816、NRRL 3112，优选地选自ATCC 76061和NRRL 3112，更优选地菌株ATCC 76061，所述米曲霉菌株选自ATCC 22788和ATCC42149，\n[0104] iv)在按时搅拌的反应器中，优选地以厚度大于10cm的层的形式，发酵固体状态的小麦麸皮，其中温度为28℃至38℃，含水量保持在45重量％至65重量％，优选50重量％至60重量％，在为了避免小麦麸皮内部二氧化碳长久积累的通气条件下，直至发酵产物具有下列酶活性的最小值：\n[0105] ■葡糖淀粉酶活性：至少500GU/克干物质，优选地750GU/克干物质，更优选地\n1500GU/克干物质，和优选地，\n[0106] ■蛋白水解酶活性：至少100PU/克干物质，优选地400PU/克干物质，和更优选地，[0107] ■木聚糖酶活性：至少100XU/克干物质，优选地400XU/克干物质。\n[0108] 在步骤i)中，优先如此选择小麦麸皮，即使得具有至少40质量％的比例的小于\n1mm的颗粒。\n[0109] 在步骤ii)中，小麦麸皮应当进行润湿和热处理，以便对其进行巴斯德法灭菌或进行杀菌。有利的是，热处理不在润湿之前进行，因为在润湿麸皮之前对其进行热处理的情况下观察到中等的发酵结果。\n[0110] 所述热处理可以由加热组成，例如在高压釜中。在高压釜中于120℃至121℃处理\n20分钟经证明是非常令人满意的。较低的条件，在烘箱中于105℃巴斯德法灭菌15分钟的较温和的条件也是合适的。也可以通过往其中注入水蒸汽来对麸皮进行热处理，这使得能够同时进行麸皮的润湿。\n[0111] 优选地，在润湿时将pH调节在4至5.5的范围内(优选用硝酸)，以便改善热处理的巴斯德法灭菌效果和所希望的发酵的起动。使用硝酸是特别有利的，因为硝酸也可以用作霉菌的氮源。\n[0112] 除了其杀菌功能外，热处理的效果还在于促进包含于小麦麸皮中的淀粉的胶凝化，并因此促进对于真菌黑曲霉和米曲霉而言该底物的利用率，这使得发酵能够更加有效。\n[0113] 麸皮的润湿很重要，因为水分的含量会影响发酵的成效。其如此来确定，即使得麸皮的水分含量在发酵步骤iv)开始时位于麸皮和水分总质量的50-60％范围内，优选\n50-55％。\n[0114] 在步骤iii)中，用任何合适的接种物对小麦麸皮进行接种。本领域技术人员知道\n7\n很多从所选择的菌株开始来制备合适接种物的方式。有利地，接种量为至少10 个孢子/克初始干物质。\n[0115] 在步骤iv)中，发酵可以在任何合适的反应器中进行。可使用的反应器的例子为在发表于Agro-Food-Industry Hi-Tech(5-6月，1997年，39-42页)中的A.DURAND等人的文章中所描述的那些。\n[0116] 发酵应当进行到葡糖淀粉酶活性为至少500GU/克麸皮干物质，优选至少750GU/克麸皮干物质，更优选至少1500GU/克麸皮干物质时为止，也就是说，一般进行1至3天，优选30至60小时的时间。少于1天，发酵太不完全。3天后，发酵已经完成或几乎完成，从而进一步延长发酵时间就不经济了。\n[0117] 培养基的温度保持在28℃至38℃，优选32℃至36℃，这相应于所使用的菌株的已知最佳活性范围。有利地，为此目的，在发酵的前几个小时中将空气温度调节到34℃至\n38℃，以促进孢子萌发，随后在发酵的其余时间中降低到28℃至32℃，以有助于调节培养基的温度。\n[0118] 小麦麸皮的含水量一般为50％至60％。然而，在两次连续的湿度水平调整之间相对较短的时间段内或者在发酵结束时，湿度水平可以偏离50-60％的区间+/-5个单位％。\n合适的是，在任何情况下，湿度水平不要降到45％以下。培养基的湿度水平在培养过程中趋于降低，这是由于在因真菌生长产生的温度升高的影响下的蒸发而引起的，所述培养基为热的不良导体。因此，在发酵过程中应当维持含水量，例如，通过按时提供水以补偿培养基的水分的损失。所用的水的品质也起着不可忽视的作用。可以使用良好品质的自来水或蒸馏水。\n[0119] 发酵培养基的pH通常不用调节。如前面所解释的那样，pH优选地在起始时被调整到4至5。\n[0120] 如果其开始的值接近6.0-6.4，则在培养过程中，pH下降至3.8-4.2，接着在最后阶段又升高。该回升通常与真菌的孢子形成阶段有关。监测pH的变化构成了培养物状态的一个良好指示。\n[0121] 发酵罐应当是通气的，优选连续地进行通气，以便提供发酵所需的氧气和避免由发酵产生的二氧化碳的过多积累。此外，通气有助于控制培养基的温度和湿度。为了限制培养基变干的趋势，显然，空气优选是用水饱和的。难以对通气的流量给出定量的指标，因为涉及很多变量，特别是反应器的尺寸和几何形状、加载的麸皮的量等。尽管如此，简单的常规试验使得本领域技术人员能够容易地确定在每个实际情况下合适的通气流量，一般地，1\n3\n至2m/小时/千克干物质的空气流量是合适的，过压优选为0.5至1巴。\n[0122] 在发酵过程中，应当借助于搅拌工具例如搅拌臂、桨叶或刮铲或者蜗杆按时搅拌发酵罐内的麸皮负载物，以避免形成不可渗透的团块，和以便通气能尽可能均匀地遍及麸皮物料的所有部分。令人惊讶地，所用的菌株可以耐受搅拌。尽管如此，应当避免过分剧烈的搅拌。\n[0123] 在根据本发明的方法中所使用的经发酵的小麦麸皮可以是干的或冷冻的以便对其进行保存，如果需要，或者是冷却的且可不经另外的转变而使用。\n[0124] 干燥优选在温和的温度下进行以免影响酶的活性。已证明在40℃的烘箱中进行加热是合适的。在工业水平上，根据所用的霉菌，优选通35℃至45℃的干燥空气。冷冻，就其自身而言，可以在低温例如-20℃下在湿产物上进行。\n[0125] US 2002 037342公开了通过用曲霉属(Aspergillus)的菌株发酵小麦麸皮而获得的酶复合物，它具有葡糖淀粉酶、蛋白水解酶、木聚糖酶活性。该复合物可以用作根据本发明的营养补充物。\n[0126] 一般地，在包括至少部分地与发酵同时进行的糖化步骤的方法的情况下，无法预见已知在具有分开的糖化步骤和发酵步骤的情况下使用的酶或多酶组合物的效果。特别地，当组合物的添加，如US 2002037342的组合物一样，牵涉掺入诸如在发酵过程中可能提高粘度的半纤维素的物质时，证实了这一点。\n[0127] 该文献描述了使用这种组合物来改善糖化步骤的条件。但其根本没有暗示所述组合物对于不包括糖化步骤或只包括预糖化步骤的方法可能具有好处。\n[0128] 这是因为，糖化的最佳条件和发酵的最佳条件是非常不同的。具体而言，糖化经常在约60℃下进行，即在对于发酵中通常使用的酵母不适合的温度下。相反地，如US 2002 \n037342的图7中所示的，US 2002037342的组合物的酶在糖化的温度下具有最佳的酶活性，但是，完全在意料之中，在同时糖化-发酵的情况下表现出受损的酶活性。\n[0129] 此外，已知US 2002 037342的组合物的酶在糖化温度下降低糖化培养基的粘度(见图8)，但本领域技术人员可以预期这种粘度的降低不会在发酵温度下再现，无论如何，也在使糖化-发酵培养基的粘度为可接受的程度之内。\n[0130] 因此，在不包括糖化步骤或只包括预糖化步骤的乙醇制备方法中，本领域技术人员不会尝试使用US 2002 037342的组合物。因为如下事实更不会使用它，即取消糖化或者限制其持续时间，有时可能导致糖化-发酵培养基被严重地污染，除非加入大量的抑菌剂。\n这是因为，糖化的温度使得能够保护培养基免受细菌污染。\n[0131] 因此，本发明还涉及根据前面描述的方法获得的或者与US 2002037342中描述的小麦麸皮相符的小麦麸皮的用途，所述用途为促进糖化-发酵培养基中的酒精发酵。优选地，在步骤d)开始时，糖化-发酵培养基中存在大于4kg的这种麸皮，就1000kg淀粉而言。\n[0132] 有利地，在本发明的优选实施方案中，营养补充物是通过用霉菌发酵小麦麸皮而获得的多酶复合物，并且：\n[0133] ○构成再利用麸皮的手段，所述麸皮来自制备小麦面粉的步骤a)，[0134] ○同时提供多种有用的酶，因而简化了方法，和\n[0135] ○是酵母的极好的营养补充物。\n[0136] 然而，就后一项效果而言，多酶复合物的以质量计的量应当比根据先前技术所得的高得多。\n[0137] 当前的研究倾向于制备越来越浓缩的多酶复合物，以便限制所引入的以质量计的量。因此简化了方法。\n[0138] 与这一倾向相反，本发明者因而发现，每吨起始淀粉引入多于4kg干物质，和优选多于14kg干物质，更优选约19kg干物质的经发酵的小麦麸皮，使得能够提高乙醇制备方法的总体效率。\n[0139] 在步骤d)结束时，在通过热交换器之后，来自糖化-发酵的麦芽汁或“酒”进料至蒸馏塔。\n[0140] 在塔底部离开的酒糟被送至发酵粕分离车间，从而通过离心类的传统方法进行澄清，以便将可溶性物质和不溶性物质分开。\n[0141] 在该分离步骤后获得的湿的发酵粕由约35％的干物质组成，澄清的酒糟由约7％至10％的干物质组成。\n[0142] 澄清的酒糟在真空下蒸发浓缩，从而获得干物质比例接近35％的浆液或者“浓缩的酒糟”。\n[0143] 然后，所获得的浆液可以与湿的发酵粕相混合。随后，干燥该混合物，并获得约\n350kg的经如此干燥的发酵粕/吨小麦，这些发酵粕的干物质比例为约90％。\n[0144] 干燥后所得的发酵粕具有明显的营养特征，特别对于牲畜，并且也是本发明的一个目标。这是因为，350kg根据本发明获得的发酵粕包含2g至35g，优选约10g的麦角固醇。既然麦角固醇是维生素D2合成的前体，因此对健康有益，以及对酵母有营养益处，尤其是在厌氧条件下。\n[0145] 此外，在所述营养补充物为根据下述的本发明方法发酵的小麦麸皮的情况下，所获得的发酵粕包含剩余的蛋白质。\n[0146] 蒸馏塔的酒精蒸汽在热交换器中被冷凝。在塔顶回收的共沸混合物通过传统方法进行干燥，例如通过使用分子筛。\n[0147] 对于1000kg小麦的初始量，根据本发明的方法使得能够获得约375升至390升的乙醇。即，令人注目地，对于包含约60％的淀粉的小麦，得到直至91％的通过发酵将葡萄糖转化为乙醇的化学计量的产率。\n[0148] 并不束缚于这个理论，本发明者通过用游离的氨基氮替代外源氮供应(例如以硫酸铵的形式)来解释这些结果。有利地，这种替代减少了发酵副产物，特别是甘油的合成，并因此提高了产率。\n[0149] 本发明还涉及在需氧条件下制备酵母或者“增殖酵母”的方法，特别地，它可用于预发酵中，以制备在将葡萄糖经酒精发酵成乙醇的方法的发酵培养基或糖化-发酵培养基中使用的酵母。\n[0150] 在这种背景下，预发酵步骤一般具有提高预发酵培养基中酵母浓度的目的，从\n6 7 8\n约10-10CFU/毫升预发酵培养基提高到至少约10CFU/毫升预发酵培养基，优选至少约\n8\n5×10CFU/毫升预发酵培养基。\n[0151] 预发酵在预发酵罐中进行，其内的温度被严格地控制或调节，例如通过冷却板系统，其中冷却液在预发酵罐的内部或外部进行循环。这是因为，微生物的任何繁殖都会导致温度的升高，这可以对酵母的增殖造成抑制。预发酵罐中的温度通常保持在30℃至35℃。\n[0152] 提供氧气，例如以压缩空气的形式，对酵母的增殖是必不可少的。\n[0153] 为了促进酵母的发展，已经知道在营养培养基中添加：\n[0154] ○以各种形式例如尿素、氨、铵盐提供的氮，\n[0155] ○以各种形式例如磷酸、磷酸盐提供的磷，\n[0156] ○以各种形式例如硫酸、硫酸盐提供的硫，\n[0157] ○必需矿物质。\n[0158] 根据现有技术，还向营养培养基中添加来自液化、糖化或预糖化步骤的麦芽汁。因而，该麦芽汁提供了可发酵的糖但却导致酒精发酵的总体产率的下降。因此存在对于在需氧条件下制备酵母的方法的需要，其能被用于预发酵，以制备在将葡萄糖经酒精发酵成乙醇的方法的发酵培养基或糖化-发酵培养基中使用的酵母，并且该方法限制了产率的这种下降。\n[0159] 根据本发明，通过下列方式来达到此目的：在预发酵罐中添加至少一部分澄清的酒糟，即在分离阶段结束时获得的酒糟，和/或在施行通过酒精发酵来制备乙醇的方法时获得的浓缩的酒糟，所述酒精发酵从糖类原料开始，尤其是含淀粉的和/或根据本发明的原料。\n[0160] 酒糟可以由包括糖化-发酵步骤的乙醇制备方法或者其中糖化步骤和发酵步骤完全分开的乙醇制备方法产生。\n[0161] 优选地，酒糟由根据本发明的乙醇制备方法产生，在所述乙醇制备方法中引入了根据本发明的营养补充物。\n[0162] 因此，本发明还涉及如下定义的乙醇制备方法，其中，对于乙醇发酵使用通过如下定义的酵母制备方法而获得的酵母，所述酵母制备方法使用来自所述乙醇制备方法的酒糟。\n[0163] 使用由根据本发明的乙醇制备方法(其中引入了根据本发明的营养补充物)产生的酒糟用于在预发酵罐内生产酵母，是特别有利的，因为这使得能够将一方面的通过酵母的乙醇生产和另一方面的酵母的细胞生长分开。这是因为，由根据本发明的乙醇制备方法产生的酒糟构成了这样的营养培养基，其使得酵母能够生长至与发酵或糖化-发酵培养基的高接种量相容的水平，这导致酵母将在发酵或糖化-发酵培养基中存在的可发酵的糖主要用于乙醇生产而不是用于细胞生长，如前面已经指出过的那样。由此，来自起始糖类底物的可发酵的糖主要用于乙醇生产，而不可发酵的糖则主要用于细胞生长。因此发现，与其中可发酵的糖被酵母同时用于乙醇生产和细胞生长的方法相比较，从起始糖类底物开始的乙醇生产的总体产率得到了提高。\n[0164] 在图2中描述了此类方法的一个具体实施方案。\n[0165] 优选地，预发酵的营养混合物包含酒糟，并且没有在施行通过从含淀粉原料开始的酒精发酵来制备乙醇的方法时获得的中间产物，特别地，酒糟不与来自通过从含淀粉原料开始的酒精发酵来制备乙醇的方法的中间阶段的麦芽汁相混合。\n[0166] 根据其他优选方式，预发酵营养培养基包含或由酒糟和液化的麦芽汁(任选地，还有水)的混合物组成。\n[0167] 进一步根据其他优选方式，预发酵营养培养基包含或由酒糟和根据本发明的营养补充物(特别是发酵的小麦麸皮)(任选地，还有水)的混合物组成。\n[0168] 最后，还可以形成由全部上述元素组成或包含它们的营养培养基。\n[0169] 根据本发明的预发酵营养培养基优选地包含一定量的干物质，即使得培养基的搅拌和/或通气足以维持最佳的乙醇生产，例如包含15％至20％的干物质。\n[0170] 对于根据本发明的酵母制备方法，根据本发明的营养补充物可以是发酵的小麦麸皮。来自发酵或糖化-发酵培养基的酒糟具有这样的在需氧条件中可被酵母利用的糖的组成(尤其是含量)，所述组成或含量特别有利于预发酵罐中酵母的发展。可以用外源的营养元素例如甘油或甘油溶液以及用从湿的发酵粕开始获得的水解产物来补充预发酵培养基。\n有利地，这使得能够节省根据本发明的麦芽汁的葡萄糖，并因此限制所述的产率下降。\n[0171] 优选地，至少一部分酒糟可以通过掺入预发酵营养培养基中而得到循环利用。也优选的是，循环利用浓缩后的酒糟，以便限制预发酵罐中营养培养基的稀释。\n[0172] 优选地，存在于预发酵营养培养基中的酒糟完全替代来自液化、糖化或预糖化步骤的麦芽汁。然而，这种替代可能只是部分的。\n[0173] 添加根据本发明的营养补充物，特别是发酵的小麦麸皮，还使得能够改善预发酵，尤其是通过使营养培养基富含下列物质：\n[0174] -氮，以氨基酸的形式提供，\n[0175] -磷，\n[0176] -硫，\n[0177] -必需维生素和矿物质，\n[0178] -蛋白质。\n[0179] 可以在预发酵营养培养基中直接进行所述添加，或者在与来自液化步骤的麦芽汁混合后进行所述添加，其中所述混合物在任选的稀释之后添加至预发酵罐中。\n[0180] 有利地，使用从来自根据本发明的乙醇制备方法的酒糟开始进行了预发酵的酵母还使得能够大大地使干的发酵粕富含蛋白质，所述干的发酵粕在根据本发明的乙醇制备方法结束时得到。因而，所述发酵粕可以包含多于40％的蛋白质，和优选地至少50％的蛋白质，基于干物质的质量计。\n[0181] 在本说明书和权利要求书中所述的各种酶活性已经通过以下方法进行了测量：\n[0182] 葡糖淀粉酶活性\n[0183] 葡糖淀粉酶(GA)制剂对于可溶性淀粉溶液的作用导致还原糖的释放。在3，5-二硝基水杨酸(DNS)存在下加热至100℃，这些组成成分呈棕色，其在分光光度计(Kontron Instruments，Milan，Italy)上于540nm处测量。\n[0184] 反应介质包含：\n[0185] ○1.5％(在黑曲霉的情况下)和2％(在米曲霉的情况下)的淀粉溶液 \n1000μl\n[0186] ○0.1M的柠檬酸盐缓冲液，pH4.5 900μl\n[0187] ○酶溶液： 100μl\n[0188] 在黑曲霉的情况下，反应在60℃下进行20分钟，在米曲霉的情况下，反应在50℃下进行5分钟。在黑曲霉的情况下，每4分钟收集100μl的反应介质样品，和在米曲霉的情况下，每分钟收集100μl的反应介质样品，并与500μl的DNS和400μl的pH4.5的柠檬酸盐缓冲液混合。然后在100℃加热该混合物5分钟，迅速冷却，接着相对于空白在540nm处进行测定，所述空白为500μl的DNS和500μl的pH4.5的柠檬酸盐缓冲液的混合物。\n[0189] 在研究了温度和pH对于GA制剂的活性的影响之后建立起了这些测定条件。采用来自Merck(Darmstadt，Germany)的可溶性淀粉作为该酶促水解的底物。DNS根据在Method in Enzymology，1，149-158(1955)中由P.Bernfeld所提出的如下方案来制备：\n[0190] ◆首先溶解：\n[0191] ○10g 3，5-二硝基水杨酸，\n[0192] ○200ml 2M氢氧化钠，\n[0193] ○200ml蒸馏水。\n[0194] ◆然后加入：\n[0195] ○300g酒石酸钠钾\n[0196] ◆在全部溶解后用蒸馏水补充体积至1升。\n[0197] 一旦制备好，该反应试剂就应当避光保存。使用葡萄糖作为参照产物来建立标准曲线以用于测定葡糖淀粉酶活性或者监测液化-糖化反应，和使用木糖作为参照产物来建立标准曲线以用于测量木聚糖酶活性。\n[0198] 一个葡糖淀粉酶活性单位(GU)相当于在以葡萄糖作为参照进行测定的条件下，每分钟释放一微摩尔的还原末端所需的酶的量。根据下面所示的公式来计算的葡糖淀粉酶活性是与初始干物质(MSI，matière sèche initiale)的量相关联的：\n[0199] \n-1 -1 -1\n[0200] ◆A相应于以GU·gMSI (μmol·分钟 ·gMSI )表示的GA活性，\n-1\n[0201] ◆P相应于以μmol·分钟 表示的葡萄糖等价物释放的速率，\n[0202] ◆Venz表示以ml计量的酶溶液的体积，\n[0203] ◆Vferm是以ml计量的用于提取酶溶液的蒸馏水的总体积，\n[0204] ◆Mferm，以MSI的克数表示，相应于从中提取出酶溶液的干产物的初始质量。\n[0205] 蛋白酶活性\n[0206] 这种测定是在根据Béinon的方法的偶氮酪蛋白上发展起来的，所述方法描述在“Proteins Purification Methods-a PracticalApproach”一书中，Harris E.L.V和Angel，S(编辑)，IRL-Press，Oxford University Press，1-66(1989)。蛋白酶对该底物的降解导致偶氮基团的释放，其在340nm的UV中有光吸收。在这种蛋白质的水解动力学过程中吸光度的变化表明了反应的程度。\n[0207] 反应介质包含：\n[0208] ○1％的偶氮酪蛋白溶液，pH5.0： 1000μl\n[0209] ○酶溶液： 200μl\n-1\n[0210] 将偶氮酪蛋白(Sigma，Saint-Louis，US)溶解于0.1mol.L 的乙酸盐缓冲液(pH5.0)中。在此pH下测定蛋白酶的活性，因为偶氮酪蛋白在较低pH下的乙酸盐缓冲液中是不溶的。酶促反应在60℃下进行。在20分钟内每5分钟取一份样品，并与5％的三氯乙酸(TCA)混合以终止反应。\n[0211] 一个蛋白酶活性单位(PU)相当于每分钟增加0.01个单位的A340nm所需的酶的量，所述增加是通过在前面所述的条件下偶氮基团的释放而产生的。根据下面所示的公式来计-1 -1\n算的该活性，是与初始干物质(PU.gMSI )或与葡糖淀粉酶活性(PU.GU )相关联的：\n[0212] \n-1\n[0213] ◆A相应于以PU·gMSI 表示的蛋白酶活性，\n-1\n[0214] ◆P相应于以“增加0.01个单位的A340nm.分钟 ”来表示的偶氮基团释放的速率，[0215] ◆Venz表示以ml计量的酶溶液的体积，\n[0216] ◆Vferm是以ml计量的用于提取酶溶液的蒸馏水的总体积，\n[0217] ◆Mferm，以MSI的克数表示，相应于从中提取出酶溶液的干产物的初始质量。\n[0218] 木聚糖酶活性\n[0219] 为了证明该酶活性，让GA制剂作用于可溶性木聚糖的溶液，并通过DNS方法来测量释放的还原糖。\n[0220] 反应介质由下列组成：\n[0221] ○2％的木聚糖溶液，pH4.5： 1900μl\n[0222] ○酶溶液： 100μl\n[0223] 在0.1M的柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中制备落叶松木聚糖的溶液(Sigma，1％)，并且在黑曲霉的情况下，反应在60℃下进行，和在米曲霉的情况下，反应在50℃下进行。在10分钟之内每2分钟取出200μl反应介质样品，并与500μl的DNS和300μl的pH4.5的柠檬酸盐缓冲液混合。然后在100℃加热该混合物5分钟，迅速冷却，接着相对于空白在540nm处进行测定，所述空白为500μl的DNS和500μl的pH4.5的柠檬酸盐缓冲液的混合物。\n[0224] 一个木聚糖酶活性单位(XU)相当于每分钟释放一微摩尔还原糖所需的酶的量。\n-1 -1\n该活性是与初始干物质(XU.gMSI )或葡糖淀粉酶活性(XU.GU )相关联的。为了计算该活性，我们再次采用对于计算GA活性所定义的公式，其中：\n[0225] ◆A相应于以XU·gMSI-1(μmol·分钟-1·gMSI-1)表示的木聚糖酶活性，[0226] ◆P相应于以μmol·分钟-1表示的木糖等价物释放的速率，\n[0227] ◆公式的其余项目不变。\n[0228] 给出了下面的非限制性的试验，其目的在于举例说明本发明，特别是说明在同时糖化-发酵方法的情况下，使用根据本发明的经发酵的小麦麸皮所带来的优点。\n[0229] 实施例1：氮补充的效应\n[0230] 以比较的方式研究了在糖化-发酵步骤的过程中产生的乙醇的量，其中引入商业的酶制剂( Fuel)，或者具有非限制性的氮补充的相同酶制剂，或者根据本发明的营养补充物。\n[0231] 在这些试验中，发明者在处于搅拌下的1升反应器中制备了小麦面粉的麦芽汁750g，其含有32％的干物质。在85℃和pH5.5下液化2小时后，将麦芽汁分配到3个\n0.5升的锥形瓶中(每个锥形瓶含有200g麦芽汁)，并补充以如下的葡糖淀粉酶等活性(isoactivité)：\n[0232] 瓶1： Fuel(纯化的葡糖淀粉酶溶液，Novozymes)；\n[0233] 瓶2： Fuel和氮补充，即磷酸二铵和硫酸二铵：每种产品3g/L；\n[0234] 瓶3：由黑曲霉菌株ATCC 76061发酵的小麦麸皮，按照US 2002037 342中描述的方法。\n[0235] 三个瓶中麦芽汁的初始pH已经调整为4.5，而温度为32℃。\n[0236] 在瓶2中掺入氮产品产生pH6.2的碱化作用，需要另外提供浓盐酸以使麦芽汁的初始pH重回至4.5以便用于糖化-发酵。麦芽汁用107CFU的酵母/ml麦芽汁进行接种。\n在所述实施例中使用的酵母为酿酒酵母。\n[0237] 在淀粉全部酶促水解之后，麦芽汁中理论上的最大葡萄糖浓度为303g/L。\n[0238] 如表1所示，在72小时处使用发酵的小麦麸皮获得了最好的乙醇生产。采用\n Fuel，甚至在使用氮补充物的情况下，在96小时处最大只产生59％的乙醇。\n在没有氮掺入时，乙醇的生产非常低，并且我们观察到非常高的葡萄糖浓度。\n[0239] 因此，对于从小麦生产乙醇而言使用用霉菌进行发酵的小麦麸皮具有显著的优势，甚至在同时糖化-发酵的反应器的温度下。与Spirizyme Fuel的比较表明，非限制性的氮补充只能部分地解释性能的提高。\n[0240] 表1\n[0241] \n[0242] 这些试验确证了，经发酵的小麦麸皮适合于通过同时糖化-发酵方法来从小麦生产乙醇。\n[0243] 实施例2：根据本发明的营养补充物的缓冲效应\n[0244] 本实施例举例说明了使用根据本发明的营养补充物来促进酒精的糖化-发酵的优点。本实施例具体涉及根据本发明的营养补充物对于糖化-发酵培养基的缓冲效应。\n[0245] 在这些试验中，发明者在处于搅拌下的1升反应器中制备了小麦面粉的麦芽汁\n750g，其含有32％的干物质。在85℃、pH5.5和以250rpm进行搅拌下液化1小时30分钟后，将麦芽汁分配到2个250ml的锥形瓶中。每个锥形瓶含有100g含32％干物质的液化麦芽汁和40g的无菌水，以获得含23％干物质的麦芽汁。然后在每个麦芽汁中加入：\n[0246] 瓶1：0.5g的用黑曲霉菌株ATCC 76061进行发酵的小麦麸皮，按照US 2002 037 \n342中描述的方法；\n[0247] 瓶2：16.7μl的 Fuel(纯化的葡糖淀粉酶溶液，Novozymes)。\n[0248] 两个瓶中麦芽汁的初始pH已经调整为4。麦芽汁用5×106CFU的\n酵母(Lesaffre)/ml麦芽汁进行接种。\n[0249] 在瓶2中，加入外源的氮，以氨的形式，依照1克氮/千克小麦。\n[0250] 在所述试验的整个期间内，麦芽汁保持于30℃的温度，并在100rpm的搅拌下。\n[0251] 所希望的乙醇浓度为87g乙醇/升麦芽汁(11％v/v)，这相当于81％的将淀粉转化为乙醇的产率。\n[0252] 表2显示了根据糖化-发酵的持续时间，麦芽汁中的乙醇浓度和麦芽汁的pH的变化。\n[0253] 以与表1相同的方式，表2举例说明了，在糖化-发酵培养基中使用根据本发明的营养补充物使得能够比使用常规的酶(尽管提供了外源氮)在更短的时间内获得更大的乙醇浓度。\n[0254] 此外，表2举例说明了，在瓶2中掺入氨导致pH降至2.8左右。\n[0255] 为了获得较好的乙醇产率，麦芽汁的pH保持在3.5至5是至关重要的。这是因为，糖化-发酵是在约30℃进行的，太高的pH，尤其是大于5的pH，会造成麦芽汁被污染的危险。太低的pH值，尤其是低于3.5的pH，会造成酒精发酵产率的下降。\n[0256] 在糖化-发酵培养基中使用其中添加了外源氮源的酶制剂，需要调节pH的装置，以便保持pH值在3.5和4.5之间。\n[0257] 表2\n[0258] \n[0259] 根据本发明的营养补充物对于糖化-发酵麦芽汁的pH具有缓冲效应，因此有利地，使得能够摆脱用于调节pH的装置。\n[0260] 实施例3：生物刺激作用\n[0261] 这个实施例证明了根据本发明的营养补充物的生物刺激效应。该实施例的试验举例说明，补充氮以及稳定麦芽汁pH在4左右的效果，只部分解释了当在糖化-发酵培养基中引入酵母时，酵母生产乙醇的性能得到提高的原因。\n[0262] 在这些试验中，发明者制备了含32％干物质的小麦面粉麦芽汁。在85℃、pH5.5和以250rpm进行搅拌下液化1小时30分钟后，将麦芽汁分配到2个4升的生物反应器中，每个生物反应器包含1.7kg含29.8％干物质的麦芽汁。在每个生物反应器中得到的麦芽汁是通过与含32％干物质的麦芽汁混合而获得的，所述含32％干物质的麦芽汁来自用含27％干物质的酒糟进行的液化。\n[0263] 用于稀释麦芽汁的酒糟是在小麦的酒精发酵方法结束时获得的酒糟。\n[0264] 含29.8％干物质的1.7kg麦芽汁如下进行补充：\n[0265] 生物反应器1：199μl的 Fuel(纯化的葡糖淀粉酶溶液，\nNovozymes)和 59μl的 Viscozym (Novozyme)( 降 低 粘 度 的 酶 (enzyme déviscosifiante))；\n[0266] 生物反应器2：5.7g用黑曲霉菌株ATCC 76061进行发酵的小麦麸皮，按照US \n2002 037 342中描述的方法。\n[0267] 两个生物反应器中麦芽汁的初始pH已经调整为4.1，和温度为30℃，然后将麦芽汁经历100rpm的搅拌。\n6\n[0268] 然后，用5×10CFU的酵母(Ethanol Lesaffre)/毫升麦芽汁来接种麦芽汁。\n[0269] 将外源氮(以氨的形式)分批添加入生物反应器1中，以达到1克氮/千克小麦的含量。\n[0270] 来自经发酵的谷物麦芽汁的酒糟包含一定量的纤维。通过与麦芽汁混合，获得了缓冲麦芽汁的pH的效果。\n[0271] 所希望的乙醇浓度为87g乙醇/升麦芽汁，这相当于81％的将淀粉转化为乙醇的产率。\n[0272] 表3显示了根据糖化-发酵的持续时间，麦芽汁中的乙醇浓度和麦芽汁的pH的变化。\n[0273] 分批提供外源氮以及使用酒糟使得生物反应器1中的pH稳定在4左右。\n[0274] 如表3所显示的，在具有根据本发明的营养补充物的生物反应器中，所希望的乙醇浓度差不多在28小时内就能达到，然而在具有所述酶制剂的生物反应器中为了达到等同的浓度要等44小时。此外，在68小时后，在具有根据本发明的营养补充物的生物反应器中的乙醇浓度仍然高于在具有所述酶制剂的生物反应器中的乙醇浓度。\n[0275] 表3举例说明了使用根据本发明的营养补充物相对于传统的酶制剂而言的显著优势。这些试验的结果表明，补充氮和控制pH只能部分解释根据本发明的营养补充物的性能。\n[0276] 这些试验证明了酵母的生物刺激效应，其与根据本发明的营养补充物的组成有关。\n[0277] 表3\n[0278] \n[0279] 实施例4：酒糟的需氧发酵\n[0280] 本发明者以比较的方式研究了预发酵培养基中酵母浓度随着所述培养基的干物质含量而发生的变化。\n[0281] 这些试验是在250ml带挡板的瓶中的100g预发酵培养基上进行的。使预发酵培\n7\n养基恒温在30℃，置于以130rpm进行的搅拌下，并用2.5×10 的酵母(Bthanol )/ml培养基进行接种。培养基的初始pH为4.2至4.4。\n[0282] 各个预发酵培养基的组成如下，以质量百分比计：\n[0283] 瓶1：1.2％的含28％干物质的酒糟，和约98.8％的水；\n[0284] 瓶2：10％的含28％干物质的酒糟，和约90％的水；\n[0285] 瓶3：20％的含28％干物质的酒糟，和约80％的水；\n[0286] 瓶4：40％的含28％干物质的酒糟，和约60％的水；\n[0287] 瓶5：对照培养基(葡糖糖和酵母提取物)。\n[0288] 对瓶实施搅拌，以便使培养基充氧并允许酵母进行增殖。\n[0289] 本发明者测量了各个预发酵培养基中的酵母浓度的变化。\n[0290] 所述瓶中的培养基组成和酵母浓度的变化总结于下面的表4中：\n[0291] 表4\n[0292] \n[0293] 如表4所示的，包含40质量％的含28质量％干物质的酒糟的预发酵培养基，即包含11.2质量％的干物质的培养基，使得酵母的量在5个小时内扩增16.6倍。作为比较，对照培养基中在相同时间段内的扩增倍数为大约2。\n[0294] 在24小时的需氧培养之后，在包含40质量％的酒糟的培养基中的酵母浓度为对照培养基中的酵母浓度的2.5倍。\n[0295] 并不束缚于某个理论，本发明者通过在酒糟的干物质中存在可被酵母同化的除了葡萄糖之外的其他碳源来解释这些结果。发明者证明，酒糟的干物质包含约10％的可发酵的糖，其基本上以葡萄糖或剩余淀粉的形式。酵母的初始浓度相当于0.62g酵母/升培养基，而最终的浓度相当于13.8g酵母/升培养基。因此，形成了约13.2g酵母/升培养基，这相当于消耗约26.4g的葡萄糖。然而，在第4号瓶中，葡萄糖的初始浓度为约11.2g/升培养基。因此，所获得的酵母的量与除了葡萄糖之外的其他碳源有关，例如，酒糟中甘油的存在。\n[0296] 当然，本发明并不限于已描述的和代表性的实施方案，它们是作为举例说明性的和非限制性的实例而提供的。