免疫测定方法

暂无

本发明涉及的是采用特异性结合如免疫测定的测定方法。\n微颗粒固相免疫测定系统已为人们所熟知。它们通过免疫原（被测物）与一种或多种特异性结合物之间发生的免疫结合反应，对被测样品中的免疫原进行定性和/或定量的测定，其中至少有一种特异结合物与一种不溶性载体连接并与含试样的液相介质接触。生成的连在载体上的免疫复合物这一事实对于随后测定结合反应的进行程度是有利的。测定常在一个带标记的特异性结合物的参与下进行，结合反应可以是“竞争”反应或者“夹心”反应，这两种反应方式在本领域中目前已被广泛应用。\n典型的“竞争”反应中，与测定介质（通常是含水的）相互接触的固相载体上固定了一种对被测物具有特异性的结合物（如单克隆抗体），在测定介质中含有带标记的已知量的被测物（或其具有同样抗原决定簇的类似物）以及已知量的预期含被测物的试样。当试样中不含有被测物时，带标记被测物或类似物就与固相载体上的特异性结合物发生结合反应，其结合的程度通过标准实验可以确定。当试样中含有被测物时，它就与带标记的被测物或它的类似物竞争特异性结合物，结果使原来带标记的被测物与特异性结合物的结合程度下降。将此现象与标准状态作比较（即与不含被测物所得的结果比较）就可以推断出被测物在试样中的浓度。\n在典型的“夹心”反应中，对被测物有特异性的第一结合物与固相载体连接，其测定介质（通常也是含水的）还含有带标记的与被测物有特异性结合能力的第二结合物。当无被测物时，两个结合物间不会发生 结合。当试样中存在被测物时，它可以在固相化的和带标记的这两个结合物之间起“桥梁”的作用，而间接地使两者发生结合。结合的程度可用于测定试样中被测物的浓度。两个结合物对被测物的特异性可以不同，但如果被测物分子具有一个以上的相同抗原决定簇，那么同一个特异性结合物即可用作固定相，又可用作游离的带标记结合物。\n已知的微颗粒载体免疫测定系统有好几种。其中有一些包含复杂的测定系统以检测特异性结合反应而形成的复合体，和/或用物理方法使带有复合体的微颗粒载体与测定介质完全分离，该方法包括在测定前要将所有未结合物去除。本发明的一个实施例中，提出了一种不需要分离微颗粒载体的免疫测定系统，它对样品的测定简便而快速，特别是免疫测定仅需一步就能完成。\n许多专利文件已描述了各种涉及微颗粒固相载体在测定介质中定位的免疫测定。EP    0169434号文件中描述了一种免疫荧光测定法：它先将抗原附着在磁性颗粒上，在测定时，在磁场的作用下将颗粒拉向容器壁。当然要从这样一个测定系统得到分析结果，还必须用外加能量如用紫外线去激发荧光的产生。\nEP    0149565描述的免疫测定法是采用一个带标记的结合物和另一个与磁性颗粒联结的结合物，这种不溶性的颗粒悬浮在液相测定液中。当带标记的结合物以与样品中被测物浓度相应的比例在液相和颗粒载体间进行分配后，除去液相。之后将颗粒载体再悬浮在另一液相介质中并测定标记物的浓度。据称此法尤其适用在荧光和化学发生的标记系统，它便于在微量滴定板上操作，无论从井的上部或下部，都能对板上的井逐个地进行扫描观察。EP    0149565中特别提到如不将颗粒物从悬浮液中分离掉，就很难对光学讯号进行有效的测量。\n本发明与EP    0149565所述的发明在指导思想上截然相反，因为我们发现实际上对定位的固相作准确的观察要比对分散的固相更为优越。\n本发明提出了一个以载体为基础的测定系统，它采用一个带标记的特异结合物，这种标记又能参与化学反应产生化学“信号”，在这样的系统中，经过与试样共孵育以进行特异结合反应后，载体穿过测定介质被移到离化学“信号”检测器最近的测定介质中，在那里一种信号影响剂被释放到测定介质中，导致了可测信号的产生，这个信号的质和/或量则依赖于被测免疫原与挂在载体上的特异性结合物之间结合反应的程度。\n更确切地说，本发明提供了一种通过特异性结合而对试样中被测物的存在进行定性和/或定量测定的方法，在该方法中，样品与一种可移动的固相载体物质接触，在它上面固定着二个结合物，一是连接在载体上的对被测物有特异性的第一结合物，二是带有标记的结合物，当存在被测物时，它就会与第一种结合物发生“夹心”或“竞争”反应，在这一方法中，经过一段时间孵育使反应充分后，可移动的固相载体被移到离化学信号检测器很近的测定介质中，在这里一种信号影响剂被释放进来，从而使可测信号得以产生，这个信号的质和/或量则依赖于被测免疫原与颗粒载体上所携带的特异性结合物之间所发生的结合的程度。\n信号影响剂可以是一种可作为一个重要部分参与化学信号发生的化学反应的化学成份。在这个实施例中，例如化学信号有可能是由连在特异性结合物上的标记来产生时，则除非遇到信号影响剂，否则信号就不会产生。\n另外，信号影响剂也可以是一种能产生化学“信号”的化学反应效率增加的化学成份，因此，当带标记的特异结合物来到检测器近旁时，它就对信号产生起了放大的作用。\n在测定介质中要形成一个信号影响剂的浓度梯度，离检测器越近，其浓度越高。如果检测信号所需时间很短的话，既使在很小的试液体积中也能形成有效的浓度梯度，因为信号影响剂来不及扩散到整个测定介 质体系中，形成较高的浓度，本发明中有一选例就采用小体积试样孵育，在载体定位到检测器之前将样品稀释。稀释后样品体积很大的增加将有助于建立一个信号影响剂的浓度梯度。\n信号影响剂必要的局部释放可以通过以下方法实现，例如在信号检测器上或其附近，设一个向外扩散信号影响剂的来源。假如信号影响剂是水溶性固体，就可以将它以一定量固定在信号检测器上或其附近，让它逐渐溶解，使检测器附近的液相测定介质中具有高浓度的信号影响剂。另外也可将信号影响剂包被起来，或者用物理方法将其束缚在检测器上或附近并与液相测定介质想接触，使其缓慢地释放到测定介质中。例如将信号影响剂放在一层或一块凝胶中包着检测器或放在其附近，以逐渐地向测定介质中释放。\n与本发明相应的测定药箱应包括有：一个进行测定的容器，容器中有一个信号检测器以及位于信号检测器内或近旁的信号影响剂的来源。例如水溶性的信号影响剂就能以固体的形式，覆盖在信号检测器的内表面和/或离检测器较近的容器内壁上。也可以把信号影响剂包在可释放的囊中，然后把它们连检测器的内外及附近。\n净效应是在检测器近旁产生的化学信号将被增强，但在离检测器较远的测定介质区域中，由于不含有信号影响剂（或相对较少）因此就减少了由未参与结合反应的游离在测定介质中的被标记特异结合物所产生的任何“本底”化学信号的干扰。\n进一步降低本底信号的方法是向测定介质中加入掩盖剂或者淬灭剂，它们能抑制化学信号的产生或影响对信号的观察。掩盖剂或淬灭剂应均匀分布在测定介质中，但它们的浓度须经选择，以使在载体定位在检测器附近和信号影响剂被释放的同时，掩盖剂或淬灭剂不会影响到信号在那里被测出。在整个样品体积中信号抑制效应必须得到平衡，这样局部浓缩的标记产生了一个可测信号。在任何给定的系统中，信号抑制水平 要靠实验或者经验来判断。但这并不难办到。载体与结合的信号发生物以及游离的信号发生物的均匀分散的混和物，就代表了未定位样品中所期望的浓度，对均匀分散在混合液中的上述三者用适当的信号抑制剂进行“滴定”，例如用某种消耗剂，让信号抑制的水平正好达到一定值，使不存在结合的信号发生物时的信号产生量等于零。\n本发明主要从有关微颗粒载体免疫测定的方面作详细的说明，但从下面的叙述中明显可见，由于本发明意义广泛，也可影响到其它的实际应用。\n在本发明的叙述中，“信号”一词用来表示能被定性或定量地观察或测定的任何现象，“可测信号”一词则表示能观察到或测到的信号变化。例如一种化学成份的浓度可以是一种信号，而它的浓度从一个相对一致的“本底”信号（可以为零）的上升或下降则可以作为可测信号。某种化学成份积累速率的变化也可以作为可测信号。另外电磁辐射强度的变化也可以作为可测信号，例如从化学成份，如化学发光剂所放出的可见光等。\n因此，本发明中的免疫测定系统具以下特征：\na.如果介质中存在合适的辅粒昙俏锞陀谐中藕诺那蹦?\nb.带标记的结合物与其它结合物发生联结，本身不会显著改变标记物产生信号的潜能;\nc.只有当连有复合标记的载体定位在离信号检测器很近的小范围测定介质中，同时又有信号影响剂向这里释放的情况下，可测信号才得以出现。\n微粒载体等固相物质在刚进入到测定介质中时，会受到测定介质固有的任何抑制信号作用的影响。溶液中的信号抑制作用可能只是一个筒单的稀释效应，或者另处还存在一种或几种能干扰信号产生的理化因素。随后，固相物就抵达信号检测器的近旁，在这里载体与整个测定介质相 对游离，而受抑制信号效应的影响就小。为了产生出可测的信号，全部需要做的事只是将载体颗粒简单地用物理方法局部定位。\n对散布在溶液中的被标记结合物部份产生信号的抑制是本发明的优点。信号被抑制的机制则取决于信号发生系统本身的性质。下面举出的几个仅用作例子的不同机制，概括了所存在的可能性。\n一种能与底物作用生成新的化学产物的物质就可以作为标记。假如测定介质含有适当浓度的一种消耗剂时，它在化学产物刚形成时就使其全部或大部完全被破坏，只要标记物还分散在整个测定介质中，就能保持在一个稳定的本底信号（例如产物的绝对浓度值或浓度变化的速率）水平。但是，当与挂在载体上的特异结合物发生联结反应后，由于载体在检测器附近的测定介质中定位以及必要的底物向该小区域中的释放，就会导致化学产物在这里积累，其积累速率超过了它被消耗剂破坏的速率，这种化学产物在定位载体附近局部的增加就形成了一个可测信号。\n当微粒载体定位在测定介质的某一区域时，消耗剂必须是均匀地散布在整个测定溶液中。\n这种化学抑制可以非常容易做到，例如，当用葡萄糖氧化酶作为标记，葡萄糖作为可释放性底物，过氧化氢酶则作为测定介质中的消耗剂。可选择过氧化氢酶在反应介质中的浓度，使其在正常条件下，只要葡萄糖氧化酶均匀地散布在测定介质中，它与葡萄糖作用所产生的过氧化氢马上被过氧化氢酶破坏。这样过氧化氢的本底水平可维持恒定或者仅有缓慢而平稳的变化。但是当带有葡萄糖氧化酶标记的特异性结合体，随联结在载体上的复合物一起，在释放葡萄糖的检测器附近的测定介质中集聚时，生成的大量过氧化氢就积聚在这一局部的区域中，过氧化氢酶就无法解离它们，那么这种过氧化物积累速率的变化就能被测定。例如用一个合适的电极就能测定H2O2的量，颗粒载体在局部的定位将影响电极附近的区域。有一些干扰物，如抗坏血酸或4-乙酰氨基酚（扑热息痛） ，存在于样品中时造成假的类似过氧化物引起的电化学信号，从而干扰测定的结果，用另一电极就可消除这类干扰，这样就不必再用选择性透膜来保护工作电极了。\n再者，化学产物“信号”的检测可以利用它与另一定位于某个表面上的物质之间发生的进一步化学反应来实现。例如，联有复合物载体可以被定位在邻近某一表面（它可以是平板、纸张、胶片、膜或第二载体）的附近，此表面含有或带有一种化学试剂，能与“信号”产物相互作用，而造成某种结果，例如在表面上产生颜色的变化。就举刚才描述的过氧化氢生成系统为例，检测表面可含有或带有过氧化物利用酶，例如辣根过氧化物酶（HRP），它能氧化在测定表面上或测定表面内的N-四甲联苯胺（TMB）这类物质，导致发生颜色变化。\n另一方法采用改变测定介质PH的物质作标记，例如脲酶或青霉素酶。与标记酶相应的底物，在脲酶的例子中就是脲，可在PH检测器附近向测定介质中释放。在分散状态下，标记物的作用被测定介质中的PH缓冲液所掩盖或淬灭。一旦发生结合反应，并且复合物随载体定位后，在PH检测器的附近由于标记物浓度较高，超过了PH缓冲液的容量，将造成局部的PH变化。这种PH的变化可被测出，例如用PH电极或PH试纸来做为检测感受方式。\n还有一个实施例中，检测器有一个装在测试容器外部的气体检测装置。检测装置可以是一种能感受氨的化学场效应晶体管（Chemfet）。这种检测装置可安放在容器壁上透气性膜的附近，紧挨着载体。脲酶作标记物时，把在局部释放的脲转变成氨，而测定介质则含有左旋谷氨酸脱氢酶作为消耗剂。\n另一个系统在原理上相似，但细节上全然不同，它采用的标记是化学发光化合物，或是参与和一个或几个其它成份进行化学发光反应的化合物，这些成份中至少有一种被释放到检测器附近的测定介质中。假如 当被标记的特异结合体均匀分散在测定介质中时，测定介质不透光，或者至少透过的光弱到无法测到的程度，就测不出光学信号。但更好的办法是在测定介质中加入能与发光系统相互作用并使光学信号受到抑制或淬灭的物质。随后，含被标记特异结合体的复合体就与微载体一起被定位在检测器附近，使局部的光信号强度加大，达到能被测定的程度。载体可以被定位在测定容器的“小窗”附近，或者在光感受器附近。光感受器可采用光电倍增管。另处还可用一种“相机”装置，就象英国专利说明书第2169704B号上所描述的那样，把光信号记录在感光胶片上。为了推算或使测定规范化，在测定液中加入一个（第二种）光敏感受器以测定本底光强度可能是有用的。\n这样的系统可采用例如HRP等作为标记，测定介质中含有过氧化物（如H2O2），氨基苯二酰肼（鲁米诺）则被释放到离光检测器邻近的测定介质中。另一个系统可以用葡萄糖氧化酶作标记，鲁米诺分散在测定介质中，而葡萄糖则被释放到离光检测器邻近的溶液中。测定介质中也可以含有一种染料，它的化学惰性使它不受过氧化物反应的影响，这种染料使测定介质在合适的波长处具有很高的光密度（最好0.0值至少大约为2），使分散的标记物发出的光与在检测器附近定位的标记物发出的光比起来要弱得多。更好的方法就是使测定介质含有一种能干扰化学光产生的化学试剂。\n另一系统在测定介质中含有竞争剂，例如没食子酸或亚硫基二乙酸，HRP作为标记物与过氧化氢和鲁和米诺作用产生可见光，鲁米诺是从光检测器的附近被释放到溶液中的。\n另一个系统含一个检测区，例如用含鲁米诺的凝胶，它同时还包含结合的HRP以及作为底物的可释放的葡萄糖，还有作为标记的葡萄糖氧化酶。\n在本发明的叙述中，虽然特别倾向用鲁米诺（5，-氨基-2，3-二氢 -1，4酞嗪二酮）这种化学发光剂，但其它化合物或者化学反应也可采用。例如，2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮的其它衍生物（如6-氨基衍生物，即异氨基苯二酰肼）也可用，此外还可采用荧光素和吖啶醚。在GB    1552607，GB    2112779    A和GB    2095830    B这些专利中，就普遍地采用这些方法。在EP    87959，EP    87959，EP    116454和GB    2162946    A这三项专利中，则描述了采用对碘苯酚等物质增强发光反应进行的方法。\n本发明的一个重要的实施例，是一个微载体免疫测定系统，它利用一种特异性的能参加发光化学反应的物质，它用一种参加化学发光反应的试剂作为标记，一种或多种参与发光反应的其它化合物则被释放到检测器附近的测定介质中，当标记结合物均匀分布在全部溶液中时，它发出的光被掩盖或淬灭，发生结合反应后，在检测器的周围微载体相对集中，这样它所带的特异结合体复合体上的标记也形成在局部地浓缩，这时它足以克服测定介质在此局部的掩盖或淬灭作用，其发出的化学光形成可测的信号，而且光的质和量依赖于被测样品与载体上特异结合体之间结合的程度。\n本发明的另一个实施例的是一种微颗粒载体免疫测定，它利用：\na.第一种可定位微粒载体（例如“磁性”颗粒），它连着一个特异性的参与被测物结合的成份。\nb.不与微粒载体连接的另一个参与特异结合的成份，它们所带的化学标记能与底物作用产生一个发光化学反应的前体物。\nc.可选择一种分散在测定介质中的消耗剂，当带标记的特异结合体分散在测定介质中时，消耗剂能与前体进行有力的竞争，从而起抑制化学发光的作用。\nd.第二种可定位载体，可带有或内含一种能与前体物作用使化学光产生的物质。\ne.光检测器\nf.一个化学发光反应的底物来源，它能向检测器邻近的溶液中释放底物。\n在此方法中，两种载体都定位在检测器附近，使化学光的测定成为可能，并且产生的光量依赖于第一颗粒载体上参于特异性结合的成份与被测样品之间发生结合的程度。\n在前述实施例中，做为例子可把葡萄糖氧化酶作为标记物，它与被释放到检测器邻近的葡萄糖及测定介质中的氧一起作用，产生了前体物过氧化氢，同时可用过氧化氢酶作消耗剂;结合试剂可采用HRP，它能与测定介质中的鲁米诺反应。如果需要的话，这种结合物试剂可以带到第二种载体的表面上或包在它的里面。\n按一定顺序地向溶液中加入各个组份是有利的，例如在加入底物使标记物发生信号之前，要有一段合宜的“孵育”时间以使免疫结合反应充分。只有在加入必要的底物后，标记才能持续地发出信号，这一点是值得称道的。底物也总是在固相物再定位在检测区之前加入的。信号的产生至少在固相定位及对其测定的这段时间内必须持续。\n特异结合反应所需的孵育时间依赖于许多因素，例如试剂和被测物的性质，它们的相对或绝对浓度，还有温度等物理因素。熟悉免疫技术的人对这些参数了如指掌。一般说来，孵育时间不超过1小时，大多采用30分钟到1小时的范围。\n载体的定位可通过许多途径来实现。\n一个简单的实施例可采用重力下沉的办法，当然这需要用一些手段例如振荡，使得发生结合反应时，载体能保持在测定介质中均匀地悬浮。离心法可用来代替重力。另外，还可以将全部测定介质通过一透性膜或过滤器，把溶液中全部的颗粒集中到一个小体积中。此外，也可以用一种能在磁力等外力的作用下集中到溶液的某一部分的微粒载体，还可在超声驱动驻波的驱使下，使微粒载体在溶液中移动。\n固相可以由任何合适的载体材料制成。所谓的“磁性”颗粒（也即受磁场影响能在溶液中移动的颗粒）可以有不同的大小，如小到1μm，大至300μm，它们都已有商品。如用重力分离，基于材料的密度，颗粒大小最好选择在50-30μm之间。已成为商品的环氧乙烷丙烯酸颗粒就是很合适的材料，它尤其适合于采用标记半抗原的测定方法。将固相载体致敏或偶联到结合试剂（如免疫球蛋白）上去的技术，是本类方法中已熟知的标准方法，在本发明中不再提及。\n可用本发明分析的物质是范围极广的。下列数种仅是做为例子：类固醇激素，例如参与妊娠或影响受精过程的，如雌激素和孕酮尿中的代谢物，例如雌酮-3-葡糖苷酸和孕二酮-3-葡糖苷酸。人绒毛膜促性腺激素，促黄体素以及促滤泡素等多肽激素。蛋白质例如尿白蛋白，β-2-微球蛋白及视黄醇结合蛋白。高密度和低密度脂蛋白，它们在心血管监测中是有价值的，还有心肌的肌钙蛋白。传染病原的标志，例如风诊抗体和弓浆虫抗体。免疫球蛋白，例如单克隆抗体。\n测试对象可有多种来源，尤其是象尿、血清和血浆这类的体液均可被采用。\n采用的参与特异性结合的成份可以是多克隆或单克隆抗体，也可是抗原、凝集素或者是激素以及它们的受体。这些制剂在本类技术中都是众所周知的，许多并已成为商品，本发明不涉及它们的精细本质。\n假如预期含有被测物的样品性质不同（例如血清和尿）或者在样品中含有干扰特异结合反应和观测信号产生的物质，这时应对样品进行稀释，例如用水和缓冲液，从而使干扰物的作用在使用本发明中的方法进行测定前就受到削弱。\n根据本发明设计的测定药箱拥有一可重复使用的带有一个信号检测器（例如小电极）的检测池，或者是一种带有膜的一次使用性检测池，信号可以穿过这个膜到达可重复使用的检测器附近，或者是一整个带有 信号感受器的一次性使用的检测池。必要的话，固相载体以及其它重要试剂等也可供应。\n本发明的一个实施例，上文中已公布的一个方法中的设计包括：一顶部开口的测定介质的容器，一个能将容器封闭的盖子，盖子上带有含信号影响剂的水不溶性凝胶，当凝胶与测定介质接触时，影响剂就可从凝胶中释放到测定介质中，凝胶中也可以含有其它与产生可测信号有关的的试剂。\n本发明的进一步实施例是一种测定方法，它利用了上一段公布的设计，其测定介质由以下成份配成：\na）样品水溶液。\nb）一种能易于依靠重力将其从水溶液中分离的微粒固相载体，它上面接有对样品中的被测物特异的第一结合体。\nc）一种标记的特异结合体，当存在被测物时，它能与第一结合体共同参与“夹心”或“竞争”反应;在进行孵育使反应充分之前或之后，加入一定体积的测定介质，然后盖上盖子并将其倒置，让微载体沉到盖子的凝胶上，使测定得以进行。\n下面的例子从多方面对本发明加以概括。\n例1\n本发明原理在下述免疫测定法中得到阐明：\n附图1和附图2显示的是测试药箱采用的装置。\n图1所示的装置有一个可封闭的容器，它由圆柱体（11）、永久封闭的底部（12）以及敞开的顶部（13）这三部分组成。容器顶部可被一个盖（14）盖住。虽然不是本项发明中有意义的内容，但在本例中，图中所画的盖子的内径与圆柱体（11）的外径相等，在封盖时，盖上的螺纹（15）与圆柱体上的螺纹（16）可互相啮合。在盖子内侧的螺纹只占盖子内壁的一部分，在侧壁上仍留出了一部分光滑的表面（17），盖子与（14）最靠里的 空间（18）则充有一层覆盖盖内全长的凝胶（19）。图1中的容器与盖子是分开的，圆柱体则盛有一定量的样品液（20），液体中则含有许多分散的载体颗粒（21）。\n在图2中，显示了容器（11）用盖（14）封闭后，并倒置使样品（20）与凝胶（19）接触。同时图2还显示载体颗粒（21）也已不再是分散在液体中而落到了凝胶的表面（22）上。\n下面详细描述的是载体颗粒参与的微粒载体免疫测定法。根据本项发明，将凝胶做为感受手段，并与其它一种或几种成份协同，对在孵育时所发生的标记结合物与载体接触所产生的化学信号进行检测。凝胶也被用来贮存可释放的信号影响剂，当容器被倒置后，液体与凝胶相遇，这时信号影响剂就向液体样品中扩散。当标记的结合物随载体集中到凝胶表面上时，就产生了可测的化学信号并可在凝胶表面进行测定，假如产生的信号能向凝胶层中扩散，那么检测就能在凝胶内部进行。例如采用使凝胶颜色变化的方法进行信号测定。为了便于在不需取走盖子的条件下观察容器中凝胶的颜色反应，在制作盖子时可全部或局部地采用透明或者半透明的材料。例如在盖的顶部或侧面开一个透明的“小窗”，这样就能轻而易举地看到凝胶的颜色变化。\n凝胶中的PH与测定介质中的可能不同，这样就能在两种环境中分别采用最适PH值不同的酶。\n如果凝胶是热成型的，那么其成型温度就不宜太高，致使在药箱制作过程中凝胶所要包含进去的一些不稳定的试剂（例如酶）会因此而变性。一般成型温度最好不要低于30℃，但也最好不要高于40℃。琼脂糖凝胶就十分理想，因为它的凝固点正是在此范围内。\n采用上文中刚记叙过的测试药箱，可进行下列实验。\n例1a\n一套可封闭的透明小塑料样品管被用作基本的试验容器。每个管径 约1cm，高约3cm。每个管的基部加0.15ml的琼脂糖指示凝胶。每个管除了加入溶在PH6的磷酸缓冲液（PBS）中的液体样品之外，还含有：\n固相：商品的环氧树脂激活的环氧乙烷丙烯酸小珠（大小为100-200μm）每10克干重的颗粒用16mg从鸡蛋中提取的抗生物素蛋白处理致敏。联有抗生物素蛋白的小珠保存在PH    7.1的磷酸缓冲盐水（PBS）中。\n偶合物：与生物素连接的葡萄糖氧化酶的商品为冻干粉，大约1mg蛋白中含20nmols的生物素。临用前按说明用PBS配制并稀释。\n生物素：商品化的右旋生物素为固相晶体。先将准确称量的生物素溶在PBS中，然后以此为参比溶液，稀释成各种合适的浓度。其范围在5到100ng/ml之间。\n用PH6.0的PBS配制含1.5%（重量体积比，即W/V）琼脂糖的凝胶，并含有100mM的葡萄糖，60mM碘化钾，1%（W/V）的淀粉，以及0.005单位的HRP胶囊。这种HRP胶囊已成为商品，是直径20-80μ的聚酰胺小囊（直径，每mg湿重的固体中含0.656单位的HRP。这种囊的膜前胪感缘模琀2O2和KI等小分子可以穿过它，但却能留住分子量大于10，000的物质。\n在一系列含凝胶的管中加入各种不同浓度的过氧化物溶液，就可以测出上述配方的凝胶检测过氧化物的能力。发现1ml    50μm的过氧化物溶液，能在20分钟内使凝胶变兰。\n测定方法\n连有抗生物素蛋白的载体小珠经过离心，去除上清部分。加入含0.05%Keltrol的缓冲液，使载体形成50/50的悬浮液。将葡萄糖氧化酶与生物素的结合体用含0.05%Keltrol的缓冲液配成5μg/ml的浓度。用一批微离心管，每管中入100μl的载体悬浮液，500μl的结合体溶液以及500μl的生物素溶液，加盖后放在一个颠倒混匀器上，在室温不断混和2小时。\n经过这样的孵育后，从每管中取出50μl与1ml缓冲液混和后，加入到含凝胶的样品管中。这时载体颗粒马上落到凝胶表面，在不含生物素或含量很微的管子中的凝胶，在几分钟后就出现兰色的斑点，而游离生物素水平较高的管中颜色就很淡。随着反应的进行，所有管中出现颜色，但无游离生物素的管出现颜色又快又深。如果将此同一系统的稀释体积增大，则能提高测定的分辨率。\n例1b\n同样的实验可采用对PH敏感的试纸，将它放到盖子里的琼脂中，琼脂中含有脲作用可释性底物，并用脲酶做为生物素的标记。定位了的载体颗粒带着生物素与脲酶的结合物将与被释放的脲相互作用，由于产生氨造成的凝胶局部的PH变化则可在PH试纸上显示出来。如果测试样品是配制在缓冲液中，则在离凝胶远近外的溶液将不会有PH的改变。\n例1C\n此例中采用的载体小珠、结合体以及游离的生物素与例1a中相同，区别是它有一个能测化学发光的凝胶层。\n此凝胶是由1%（W/V）的琼脂糖溶在PH为8.5的0.1M    Tris缓冲液中配成，内含150mM葡萄糖，1.25mM的鲁米诺，1mM对碘苯酚和包在囊中的HRP（与例1a相同），每10ml凝胶中含1ml    HRP胶囊，相当于200个单位的酶活性。每个样品管中加0.15ml的凝胶。\n向每管中加入50μl携有葡萄糖氧化酶的小珠及2mlPBS缓冲液。这时载体就落在凝胶的表面，在不含或含微量游离生物素的管中，凝胶层就能发出明显的兰色化学光。