基于微粒的信号扩增法及其在分析物检测中的应用

1.一种用于检测分析物的信号扩增微粒，其特征是其包含：
含有信号分子的信号扩增微粒，其中信号分子含有与信号扩增核心微粒表面相连的第一结合区和与大量信号发放基团相连的信号结合区；和
分析物结合分子，其由分析物结合区和第二结合区组成，该分子通过第二结合区与核心微粒表面相连，所述分析物结合区用于和分析物结合。
2.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中第一和第二结合区至少有一个与信号扩增核心微粒表面的功能团交联。
3.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中第一结合区通过第一连接基团和信号扩增核心微粒表面功能团的连接固定在信号扩增核心微粒表面；第二结合区通过第二连接基团和信号扩增核心微粒表面功能团的连接固定在信号扩增核心微粒表面。
4.如权利要求3所述的信号扩增微粒，其中第一和第二连接基团至少有一种由寡核苷酸构成。
5.如权利要求3所述的信号扩增微粒，其中第一和第二连接基团均由寡核苷酸构成。
6.如权利要求3所述的信号扩增微粒，其中第一连接基团和第二连接基团中至少有一种由第一寡核苷酸序列组成，另一种由与第一寡核苷酸序列互补的第二核酸序列组成。
7.如权利要求3所述的信号扩增微粒，其中第一连接基团由第一寡核苷酸序列构成，第一结合区由与第一寡核苷酸序列互补的第二核酸序列构成，第二连接基团由第三寡核苷酸序列构成，第二结合区由与第三寡核苷酸序列互补的第四核苷酸序列构成。
8.如权利要求7所述的信号扩增微粒，其中第一寡核苷酸序列与第三寡核苷酸序列不同。
9.如权利要求7所述的信号扩增微粒，其中第一寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列相同。
10.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中信号分子的信号结合区由多聚物构成，可供选择的多聚物包括：聚核苷酸、多氨基糖类、精胺、亚精胺以及含大量氨基侧链或大量羧基侧链功能团的多肽。
11.如权利要求10所述的信号扩增微粒，其中所述的多聚物选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸和聚组氨酸。
12.如权利要求10所述的信号扩增微粒，其中信号分子进一步由第一核酸序列构成，其中第一核酸序列形成的第一结合区与第一连接基团相连，第一连接基团是由一种与第一核酸序列互补的寡核苷酸序列构成。
13.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中信号分子含有形成第一结合区的第一核酸序列，其中第一结合区与第一连接基团相连，第一连接基团是一个与第一核酸序列互补的寡核苷酸序列，信号分子还进一步含有形成信号结合区的第二核酸序列。
14.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中信号分子的信号结合区由多聚物组成，可供选择的多聚物包括：聚葡糖酸以及含有大量羧基侧链功能团的多肽。
15.如权利要求14所述的信号扩增微粒，其中所述的多聚物选自聚谷氨酸和聚天冬氨酸。
16.如权利要求15所述的信号扩增微粒，其中信号分子进一步由第一核酸序列构成，第一核酸序列形成的第一结合区与第一连接基团相连，第一连接基团是由一种与第一核酸序列互补的寡核苷酸序列构成。
17.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中可供选择的信号发放基团包括：化学发光基团、磷光基团、电发光基团和荧光基团。
18.如权利要求17所述的信号扩增微粒，其中信号发放基团在第一种情况下不能发放信号，在与第一种情况不同的第二种情况下可以发放信号。
19.如权利要求18所述的信号扩增微粒，其中第一种情况和第二种情况中至少有一种相对于第二种情况和第一种情况中的另一种情况是氧化状态。
20.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中的信号发放基团由吖啶基团构成。
21.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中的信号结合区由一个核酸序列构成，信号发放基团由一种与信号结合区上的核酸序列相连的吖啶基团构成。
22.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中的信号发放基团由荧光基团构成。
23.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中每个信号分子的信号结合区至少与10个信号发放基团相连。
24.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中每个信号分子的信号结合区至少与50个信号发放基团相连。
25.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中每个信号分子的信号结合区至少与100个信号发放基团相连。
26.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中每个信号分子的信号结合区至少与150个信号发放基团相连。
27.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中分析物结合分子由一个可与分析物结合的抗体构成，其中分析物含有抗原。
28.如权利要求27所述的信号扩增微粒，其中抗体与一个形成第二结合区的寡核苷酸相连。
29.如权利要求27所述的信号扩增微粒，其中抗体是由一个单克隆抗体构成。
30.如权利要求27所述的信号扩增微粒，其中抗体是由一个多克隆抗体构成。
31.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中分析物结合分子含有抗原，其中抗原可与抗体构成的分析物结合。
32.如权利要求31所述的信号扩增微粒，其中抗原与形成第二结合区的寡核苷酸相连。
33.如权利要求31所述的信号扩增微粒，其中抗原与载体分子相连，同时载体分子与形成第二结合区的寡核苷酸相连。
34.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中分析物结合分子包括一个与分析物相连的第一核酸序列，第一核酸序列与构成分析物的目标核酸序列互补。
35.如权利要求34所述的信号扩增微粒，其中分析物结合分子进一步含有形成第二结合区的第二核酸序列。
36.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中信号分子与分析物结合分子之间的比至少为3∶1。
37.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其中信号分子与分析物结合分子之间比至少为10∶1。
38.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其直径小于2微米。
39.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其直径小于1微米。
40.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其直径在0.001-1.0微米之间。
41.如权利要求1所述的信号扩增微粒，其直径在0.01-0.5微米之间。
42.如权利要求1所述的信号扩增微粒，还进一步包含载体分子，其中信号分子和分析物结合分子结合在载体分子上，载体分子与核心微粒表面直接相连，信号分子和分析物结合分子通过与载体分子结合而与核心微粒表面间接相连。
43.如权利要求42所述的信号扩增微粒，其中载体分子的载体分子连接基团是一段核酸序列，该核酸序列与另一段互补核酸序列结合，该互补核酸序列包含与核心微粒结合的第二连接基团。
44.权利要求42所述的信号扩增微粒，其中的载体分子由聚赖氨酸构成。
45.如权利要求44所述的信号扩增微粒，其中信号分子的信号结合区由聚赖氨酸构成。
46.权利要求42所述的信号扩增微粒，其中信号分子的第一结合区由一段可以和聚赖氨酸通过互补寡核苷酸结合的寡核苷酸构成。
47.用于分析物检测的信号扩增微粒，其组成包括：
直径小于2微米的信号扩增微粒，该微粒包含
与核心微粒表面相连的大量信号分子，每个信号分子含有一个第一寡核苷酸结合区和一个信号结合区，第一寡核苷酸结合区通过第一寡核苷酸连接基团与核心微粒表面相连；
信号结合区由与吖啶基团相连的大量功能团构成；
与核心微粒表面相连的大量分析物结合分子，每个分析物结合分子含有一个第二寡核苷酸结合区和一个分析物结合区，第二寡核苷酸结合区通过第二寡核苷酸连接基团与核心微粒表面相连。
48.用于分析物检测的试剂盒，其组成包括
作为第一微粒的如权利要求1所述的微粒，其中所述第一微粒中的分析物结合分子和分析物结合区分别为第一分析物结合分子和第一分析物结合区；
具有不同物理特性的第二微粒，该微粒与第二分析物结合分子相连，第二分析物结合分子含有一个与第二微粒相连的第三结合区和一个与分析物相连的第二分析物结合区。
49.如权利要求48所述的试剂盒，其中第三结合区与第二微粒表面的功能团交联。
50.如权利要求48所述的微粒，其中第三结合区通过第三连接基团与第二微粒表面相连，第三连接基团交联在第二微粒表面的功能团上。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其中第三连接基团由一个寡核苷酸序列构成，第三结合区由一个与第三连接基团上寡核苷酸序列互补的核酸序列构成。
52.如权利要求48所述的试剂盒，其中，利用第二微粒的物理特性可以将其与第一微粒分开，除非第一微粒已经通过分析物的结合与第二微粒相结合。
53.如权利要求48所述的试剂盒，其中第二微粒具有体积大于第一微粒的物理特征。
54.如权利要求48所述的试剂盒，其中第二微粒具备铁磁性的物理特性，而第一微粒不具备铁磁性。
55.如权利要求48所述的试剂盒，其中第二微粒的物理特性包括，与第二微粒连接的分子具有荧光性。
56.如权利要求48所述的试剂盒，其中第一和第二分析物结合区与分析物的不同区域相连。
57.如权利要求48所述的试剂盒，其中第一和第二分析物结合分子中至少有一个是抗原。
58.如权利要求48所述的试剂盒，其中第一和第二分析物结合分子中至少有一个是抗体。
59.如权利要求48所述的试剂盒，其中第一和第二分析物结合分子均为抗体。
60.如权利要求48所述的试剂盒，其中第一和第二分析物结合分子中至少有一个是核酸。
61.如权利要求48所述的试剂盒，其中第一和第二分析物结合分子均由一个核酸序列构成，其中第一分析物结合区由一个第一核酸序列构成，它与分析物上的第一目标序列互补，第二分析物结合区由第二核酸序列构成，它与分析物上的第二目标序列互补。
62.分析物检测方法，其包含以下步骤：
将含有分析物的样本与作为第一微粒的如权利要求1所述的微粒混合；
将分析物样本与第二微粒混合，所述第二微粒的物理特性与第一微粒不同，第二微粒通过第二分析物结合分子上的第三结合区与之相连，第二分析物结合分子通过其第二分析物结合区与分析物相连；
将样本培养足够长时间以保证第一、第二微粒与分析物相连形成复合体；
将混合样本分成含有结合复合体的第一部分和含有未与复合体结合的第一微粒的第二部分；
保留第一部分；
测量第一部分中信号发放基团释放出的信号强度。
63.如权利要求62所述的方法，还进一步包括对含有结合复合体的第一部分进行冲洗以除去部分包含在第一部分中但未与复合体结合的第一微粒，然后重复上述冲洗步骤。
64.如权利要求62所述的方法，其中第二微粒具备铁磁性物理特性。
65.如权利要求62所述的方法，其中第二微粒具有荧光物理特性。
66.如权利要求62所述的方法，其中第二微粒具有体积大于第一微粒的物理特性。
67.如权利要求62所述的方法，其中培养时间为15分钟或者更少。
68.如权利要求62所述的方法，其中培养时间为10分钟或者更少。
69.如权利要求62所述的方法，其中的培养时间为5分钟或者更少。

基于微粒的信号扩增法及其在分析物检测中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及应用于分析物检测的微粒、试剂盒和方法，特别是涉及对能发放信号的微粒，这种微粒与大量信号发放分子相连，而且可通过分析物结合分子与分析物结合。该方法涵盖了将不同种类的分析物结合微粒进行组合，进行快速而灵敏检测的技术。\n[0002] 发明背景\n[0003] 在各种疾病和环境条件中，对生物学分析物的检测(例如细菌、抗原、抗体、受体、配体和核酸)不仅是诊断学试验的中心环节，也在科学研究、法医学以及风险评估应用中发挥着极其重要的作用。典型的检测方法是将生物学目标分析物与相对应的分析物结合分子特异性结合，从而形成一个容易检测的复合体。例如，通过将特殊卵磷脂或者抗体与细菌表面抗原结合来完成对细菌的检测。通过将抗原与特异性抗体结合可以进行对可溶性抗原的检测；反过来，通过将特异性抗体与相应抗原(或者抗原偶联物)结合也可以进行对特异性抗体的检测。通过配体与代表特殊细胞类型的受体的结合，不仅可以进行对细胞表面受体的检测，反过来也可以进行对配体的检测。通过与序列互补的核酸进行结合可以进行对核酸的检测。所有这些检测方法的核心就是对目标分析物和分析物结合分子相结合形成的、有别于其他非结合物的复合复合体进行检测。以下是三种典型的复合复合体基本检测技术。\n[0004] 第一种检测技术主要依据分析物与分析物结合分子结合后改变了它们单独存在时的物理状态。一种常见的例子就是抗体凝聚，即一种抗体或者一种与微粒(例如乳胶微粒)相连的抗体通过交叉结合彼此连接形成足够大小的光散射网格结构，从而区别于未与分析物结合的抗体。凝聚试验的常见形式是先将抗体吸附在微量滴定板表面，然后以同样的方式将分析物和含有与乳胶颗粒相连的第二抗体的试剂也吸附在浓度测定板表面。经过长时间培养，测定板表面就形成了一个由乳胶微粒和分析物共同组成的光散射网格结构，光散射网格结构的大小由光线的分散或吸收测定。对于凝聚试验和基于相似物理原理的试验，它们存在的一个缺点就是敏感性较低，常常耗费大量的分析物样本才能保证对复合复合体检测的可靠度。\n[0005] 第二种检测分析物复合复合体的技术是ELISA试验，主要依据生化酶与抗体结合形成酶标抗体。酶标抗体分别与分析物和另一种固定于表面的抗体(或者抗原)相连，从而形成了一种夹心复合体。然后对复合体进行冲洗，除去未与生化酶结合的分子。将复合体置于酶作用底物上培养，复合体中的生化酶可以把酶作用底物催化成有色产物，这种有色产物可以通过传统的光谱分析技术或者化学发光技术测定。ELISA方法的优点是具有相对较高的敏感度，但是需要较长时间才能达到最高敏感度。在典型的ELISA试验中，抗原抗体的结合有时候可能需要几个小时(典型的需要整夜)才能达到平衡(即100％结合率)，而10分钟培养时间只可能达到3％结合率。因此，ELISA方法并不适用于短期快速检测，比如对患者或献血者疾病的快速筛查。同时ELISA试验的另一个缺点就是酶标抗体的不稳定性，相对昂贵的酶作用底物和多步操作程序，这些都导致了ELISA试验的高成本。\n[0006] 第三种分析物检测技术是标记法，即通过检测与分析物结合的分析物结合分子上的标记物来进行的。通常，首先把分析物样本固定在基质上，将其与标记过的分析物结合分子共同培育，然后用洗去未结合的分子。标记法常和核酸检测方法联合使用，这时分析物结合分子是一个核酸探针，由于它与待测核酸的序列互补，因此可以彼此结合。在此多种标记种类可供使用，比如放射性标记、荧光素标记、化学发光标记和电化学发光标记等。同时也有多种可供使用的基质，从简单的过滤膜到复杂的核酸芯片装置。在临床上，核酸结合试验最常用于HIV、HCV和HBV等病毒的血液筛查中，也用于对血液HIV病毒含量的检测试验中。\n血液HIV病毒含量的检测试验是指在抗病毒药品治疗和疾病预防的过程中，对血浆中病毒的浓度进行测量。核酸标记技术经常与电泳联合应用或者在依据分子大小的分离法中用以确定特殊大小的待测分析物。\n[0007] 常规标记技术的主要缺点之一，特别是在核酸检测的应用中，是它们的相对复杂性，需要一定的技术和培训。其次，同ELISA试验相似，另一个缺点就是标记试验也需要较长的培育周期，使其杂交后达到一定的水平以保证标记物检测。还有一个缺点就是与探针结合的标记数目会受到探针大小的影响，而且需要在杂交过程中对氢键结合区提供保护。\n这就限定了检测的灵敏度，尽管可以通过分析物扩增技术，比如聚合酶链式反应(PCR)对待测分析物核酸进行倍增，但是聚合酶链式反应(PCR)的可靠性对其使用的生化酶，试剂和操作程序的复杂性和可变性有很高的要求。此外另一个缺点是为了达到最灵敏检测所需的仪器都是十分昂贵的。以上这些缺点都强有力地阻碍了常规标记技术在快速廉价现场检测(比如临床上)的应用。\n[0008] 所以，在技术上就需要一种既能够提高检测速度和灵敏度，又能够简化检测过程的技术和方法，特别是可以灵活适用于各种分析物检测的技术和方法。\n[0009] 发明综述\n[0010] 以下是对有关微粒扩增技术(MBA)及其使用方法的描述，它可以广泛应用于各种检测领域中，达到提高分析物检测速度和灵敏度、简化检测程序的目的。应用微粒扩增技术(MBA)，在1mL的分析物溶液中，低达3％与分析物结合的分析物结合分子在10-20分钟内就可以被检测到。以微粒扩增(MBA)技术为基础的方法包括三步：首先将两种不同微粒(比如一种信号扩增微粒和一种分离微粒)与分析物结合；然后将这两种微粒的复合体从未结合的信号扩增微粒中分离出来；最后对由其中一种微粒发放的信号进行检测。这样比其他的分析物检测技术可以节约大量时间和成本。\n[0011] MBA技术是通过信号扩增微粒来实现放大信号的目的，信号扩增微粒含有大量信号分子和分析物结合分子，它们通过信号扩增微粒表面的多个连接位点与信号扩增微粒相连。同时，每个信号分子含大量信号发放基团。此方法一个特点是将信号扩增微粒与分离微粒结合，由于分离微粒与信号扩增微粒的物理特性明显不同，因此很容易将其从其它信号扩增微粒中分离出来。分离微粒表面也连有一种分析物结合分子。因此含有信号扩增微粒、分析物和分离微粒的混合物就形成了一个复合体，复合体中信号扩增微粒既与分析物结合又与分离微粒结合。在这里复合体的形成也可以通过其他方式，例如先将分析物和分离微粒结合形成初级复合体，除去未结合的非分析物，然后再将初级复合体与信号扩增微粒结合形成最终复合体。根据分离微粒的分离特性，结合后的复合体很容易从未结合的信号扩增微粒中分离出来。分离后，复合体中检测到的信号强度就直接反应了复合体中信号扩增微粒的数目，同时也反应出样本中分析物的数量。尽管一个分析物只能与一个信号扩增微粒结合，但是一个信号扩增微粒上有大量的信号分子，每个信号分子还可以有很多信号释放基团，因此检测到的信号数目是分析物实际数目的许多倍。\n[0012] 信号扩增微粒中的信号分子可以由一个聚合物组成，它含有一个与微粒表面相连的结合区(第一结合区)和一个信号结合区，信号结合区上含有大量与信号发放基团相连的功能团。在一些具体应用中，信号分子是一种寡核苷酸，其第一结合区上的核酸序列与信号扩增微粒表面对应的寡核苷酸结合部分的序列互补；信号结合区含有一系列可与大量吖啶(acridinium)基团相连的胺基基团。此类吖啶化合物可以进行化学发光，其10位氮上往往为烷基等取代基所取代。在不同具体应用中，分析物结合分子可以是抗体、抗原、受体、配体或者核酸。分析物结合分子也含有一个与微粒表面相连的结合区(第二结合区)和一个与分析物相连的分析物结合区。在一些具体应用中，第二结合区是一种寡核苷酸，它与信号扩增微粒表面对应的寡核苷酸结合部分的序列互补。在另一些具体应用中，信号分子和/或分析物结合分与信号扩增微粒直接连接。\n[0013] 象信号扩增微粒和第一分析物结合分子连接一样，分离微粒可以与第二分析物结合分子相连。因此第二分析物结合分子可以含有一个寡核苷酸结合区(第三结合区)，第三结合区的核苷序列与分离微粒表面的第三寡核苷酸结合部分的序列互补。第二和第三寡核苷酸结合部分的序列可以是相同的，也可以是不同的。第一和第二分析物结合分子的类型可以是相同的，也可以是不同的。同样的，第二分析物结合分子也可以与分离微粒直接连接。\n[0014] 一些实施方案中，第一和第二分析物结合分子的成分是与抗原结合的抗体，特别是与细菌表面抗原结合的抗体。其他具体应用中，第一和第二分析物结合分子的成分是与样本中抗体结合的抗原，比如与HIV抗体结合的抗原。除此之外，还有一些第一和第二分析物结合分子的成分是核酸，这些核酸序列分别与目标分析物核酸分子上的第一和第二核酸互补。\n[0015] 以下是对基于扩增微粒(MBA)的试剂盒和方法的描述。一些实施方案中，试剂盒包括信号扩增微粒和分离微粒。信号扩增微粒与特异性抗体分析物结合分子相连并与含有大量吖啶基团的发放信号的寡核苷酸分子相连；分离微粒是一种与同类抗体分析结合分子相连的磁性颗粒。利用该组成和试剂盒对分析物进行检测的方法包括：将信号扩增微粒、磁性分离微粒和分析物混合，将混合物培育足够长时间以保证第一和第二分析物结合分子与分析物充分结合；然后用磁铁将混合液分离出含有磁性分离微粒的样本溶液，对分离微粒进行冲洗，将冲洗过的微粒置于使连接的信号扩增微粒发光的环境中，对发光信号进行检测。\n[0016] 通过使用一种价廉且容易携带的光度计，这种检测方法可适合用于10-20分钟测试中。由这些分子和光度计共同组成的细菌检测系统可适用于临床现场，比如医院，因为这个试验不仅可以在15-30分钟内完成，而且具有很高的可信度和敏感度。因此，在输血前，常常用此试验来测量血小板中细菌的污染程度。在某些的实施方案中，对于至少五个菌株的检测敏感度(检测极限)是5000细菌/毫升甚至更高。典型的过程中结合反应时间为\n10-20分钟，冲洗时间为4-5分钟，化学光反应时间为1分钟。\n[0017] 对于这里所描述的组成和方法，它的检测速度、敏感度和简易性使其适合用于自动化检测和处理大量待测样本中。\n[0018] 附图简要描述\n[0019] 图1是根据发明的一个方面对信号扩增微粒的描述。图1A所示为信号扩增微粒中的核心部分，图1B所示为一个完整的信号扩增微粒具体形式。\n[0020] 图2所示为发明中信号扩增微粒的一种形式。\n[0021] 图3A所示为发明中信号扩增微粒的一种形式。图3B所示为发明中信号扩增微粒的另一种形式。图3C所示为发明中信号扩增微粒的第三种形式。\n[0022] 图4是根据发明的另一个方面，对使用信号扩增微粒和分离微粒的试剂盒的描述。图4A所示为分离微粒的一种形式。图4B所示为分离微粒的另一种形式。\n[0023] 图5所示为发明的另一个方面，即方法流程图。图5A所示为复合体一步形成过程，图5B所示为复合体两步形成过程。\n[0024] 图6所示为该发明中对为细菌的分析物的检测。\n[0025] 图7所示为该发明中对为抗体的分析物的检测。\n[0026] 图8所示为该发明中对为抗体的分析物的另一种检测。\n[0027] 图9所示为该发明中对为抗体的分析物的另一种检测。\n[0028] 图10所示为该发明中对为核酸的分析物的检测。\n[0029] 图11所示为该发明中信号扩增微粒和分离微粒的另一种形式。\n[0030] 图12所示为该发明中信号扩增微粒的寡核苷酸组成。图12A所示为一些特定实施方案中使用的寡核苷酸A-D。图12B所示为一些具体情况下信号分子中寡核苷酸C的组成。\n[0031] 图13所示为阴性对照平行试验中的检测结果的预期分布模型，可根据平均值和标准差(SD)对截止RLU值进行设定。在这里，截止RLU值可设定为平均值+3×标准差。\n[0032] 图14所示为该发明中细菌检测理想敏感度的测定。\n[0033] 图15所示为一种抗体浓度检测方法。\n[0034] 发明详细描述\n[0035] 在本发明中，图1阐明了用于MBA技术中的信号扩增微粒11的基本特征。如图\n1A所示，信号扩增微粒11由核心微粒2装配而成。核心微粒2包括一个第一微粒10，第一微粒10的表面15存在大量功能团20，功能团20上连有第一连接基团25和第二连接基团\n28。典型地，第一连接基团25和第二连接基团28通过功能团20以共价键的方式与第一微粒10结合。\n[0036] 图1B阐明了核心微粒2如何装配形成信号扩增微粒11。信号分子30通过第一连接基团25与第一微粒10表面相连形成信号扩增微粒11。信号分子30由一个结合区(第一结合区32)和一个信号结合区34共同组成，它通过第一结合区32与核心颗粒2上的第一连接基团25相连，通过信号结合区34与大量信号发放基团36相连。信号扩增微粒11通过第二连接基团28与分析物结合分子40相连。分析物结合分子40含有一个结合区(第二结合区35)和第一分析物结合区41，它通过第二结合区35与核心微粒2上的第二连接基团28相连，通过第一分析物结合区41与分析物50相连。后面我们将对其进行更为详细的说明，在这里适用的分析物结合分子包括，但不仅仅限于核酸、抗原、抗体、蛋白质、受体和配体；与其相对应的分析物分别为核酸，抗体、抗原、酶作用物、配体和受体。一些实施方案中，第一结合区32和/或者第二结合区35与第一连接基团25和第二连接基团28之间可以通过非共价键(例如核酸互补序列之间的氢键)结合。另一些实施方案中，第一结合区\n32和/或者第二结合区35与第一连接基团25和第二连接基团28可以通过它们功能团之间化学交联形成的共价键结合。还有一些实施方案中，第一结合区32和/或者第二结合区\n35也可以通过共价键与微粒直接相连。\n[0037] 信号分子30可以是一种聚合物，它由结合区32和信号结合区34组成，结合区32含有一个与微粒上第一连接基团25相连的分子结构，信号结合区34含有与信号释放基团\n36相连的大量功能团33。在这里，“结合”是指不同种类分子之间的化学结合，包括共价键或者非共价键。在一个典型的实施方案中，结合区32通过氢键与连接基团结合，信号结合区34通过功能团33以共价键的形式与信号发放基团36结合。信号分子30上信号结合区\n34的种类包括，但不仅仅限于含有大量胺基的聚合物，比如聚核苷酸，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚组氨酸、聚氨基糖类、精胺、亚精胺和含有大量氨基侧链功能团的多肽。信号分子30上信号结合区34的其他种类也包括，但不仅仅限于含有多羧酸基团的聚合体，比如聚谷氨酸、聚天(门)冬氨酸、聚多糖以及由大量羧基侧链功能团组成的多肽。但是最好选用多氨基和多羧酸构成的聚合物作为信号分子30的信号结合区34，因为在技术上，将这些功能团33与信号发放基团36上最常见的功能团交联的化学法已广为人知。但是，任何一种能与信号发放基团36进行交联结合的、含有大量功能团33的聚合物都是适用的。\n[0038] 因为这些功能团能够与信号发放基团36通过化学交联相连，因此含有这些功能团或者具有类似化学功能的特定序列的寡核苷酸常被用于信号分子30的信号结合区34。\n由于通过互补序列杂交，特定序列的寡核苷酸能够较容易地与第一连接基团25相连，因此它也常被用于信号发放分子30的结合区32。在信号发放分子30的混合例子中，结合区32可以由寡核苷酸序列组成；而信号结合区34可以由非核酸聚合物组成，比如聚赖氨酸或者聚谷氨酸。技术上，寡核苷酸和非核酸聚合物上功能团之间的共价键交联的方法已经广为人知。相应地，只要信号分子30至少保留一个功能团残余物作为结合区32和大量功能团作为信号结合区34，那么信号分子30的化学形成就可以是各种形式的。\n[0039] 信号发放基团36可能由任意一种能发放信号的化学基团构成，这些发放出来的信号可以通过适当的仪器检测到。在典型的实施方案中，信号发放基团36发放的信号可以很容易地被光度计检测到。在一些实施方案中，信号的发放来自于信号发放基团36在特定物理/化学环境中的暴露，例如，在化学发光中，信号发放基团36通过与反应物之间的化学反应，改变了原来的氧化/还原状态从而发放出信号；或者在荧光和磷光中，信号发放基团\n36经辐射激活后发出信号；或者在电化学发光中，信号发放基团36经电刺激作用后发出信号。在这里，可供选用的电致发光材料包括(但不仅仅限于)：美国专利中的6,333,122、\n6,329,083、6,277,503、6,271,626、6,180,267、6,143,434、5,747,183和5,706,224。一例化学发光的信号发放基团36是上述吖啶酯衍生物，这种吖啶衍生物很容易与胺基，特别是信号分子30中信号结合区34上的伯胺进行交联。在一些氧化物比如过氧化氢中，被氧化吖啶衍生物发放的化学光可以通过光度计检测到。另一例信号发放基团36是荧光素，这种荧光素是一个荧光分子，它发放的荧光可以通过荧光计检测到。在技术上，将荧光素与胺基和寡核苷酸进行交联的方法已经广为人知。其他一些实施方案中，信号发放基团36促进有色信号的产生。\n[0040] 信号扩增微粒11中的第一微粒10可能由任何一种大分子结构构成的微粒构成，包括(但不仅限于)固体小球、多孔小球和磁性小球等等种。从技术角度讲，这些小球最好是微粒、纳米颗粒、纳米小球，或者是微球。在大多数实施方案中，信号扩增微粒11中第一微粒10的平均直径小于2微米，最好小于1微米。在一些特殊实施方案中，第一微粒10的直径介于0.001-1.0微米之间，最典型的是介于0.01-0.5微米之间。任何一种与样本中待测分析物种类可共存的材料都可以用做微粒10，在这里可用做微粒10的材料包括(但不仅仅限于)：苯乙烯聚合物、硅酸物、硅或炭基气凝胶，硅树脂、乳胶、碳水化合物、甲基丙烯盐、以及丙烯胺等等，或者任何一种能满足颗粒大小要求、并且可转化成含有微粒10表面大量功能团20的材料。与材料体积相比，微粒最好(但非一定)拥有一个较大的孔隙体积，这样微粒在样本中可具有与溶液中相同的密度，从而保持悬浮状态而不下沉。\n[0041] 信号分子30和分析物结合分子40按照一定比例与微粒10的表面连接，典型地(但并非必须的)是信号分子30的数量大于分析物结合分子40的数量。通常，信号分子\n30与分析物结合分子40之间比例至少为3∶1，5∶1，最好是10∶1，并且越大越好。该比例的选择取决于分析结合分子40与分析物50之间的亲和力，相对于给定样本为了达到理想敏感度检测时所需要的信号扩增。通常，随着分析物结合分子40与分析物50之间亲和力的增加，在给定样本中就不再需要为了有效结合而消耗大量的分析物结合分子40，因此选用较高的信号分子30/分析物结合分子40比例即可。也可根据实际经验，适度提高信号分子30/分析物结合分子40的比例，直到信号结合分子40的数量太少，不足以与样本中的分析物分子50有效结合时为止。例8中阐述了如何根据实际经验判断信号分子30/分析物结合分子40比例的方法。\n[0042] 此发明中，由信号分子30和分析物结合分子40组成的信号扩增微粒11在微粒扩增(MBA)过程中起着非常重要的媒介作用。一部分信号的扩增来源于含有大量功能团的微粒10通过第一连接基团25与大量信号分子30的相互连接。例如，一个重量为1克的直径为1-2微米的磁性微球(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)表面含有240微moles胺\n9\n基，或者每个微球上含有3×10 个胺基。如果只有0.01％胺基与信号分子30相连，每个信号分子30又含有一个吖啶信号发放基团37的话，那么通过一个普通光度计就可以检测到一个信号扩增微粒11。相应地，即使只有一个分析物结合分子40与信号扩增微粒11相连，\n10\n就相当于它与信号扩增微粒11上的3×10 个信号发放基团36相连。因此，信号扩增的第一级就是大量信号分子30与信号扩增微粒11的连接。相比来说，通过使用传统标记技术，一个单个的分析物结合分子40仅可以被几个信号发放基团36标记。\n[0043] 信号扩增(MBA)的第二级是将已经连接到信号扩增微粒11上的信号分子30与大量信号发放基团36相连。信号分子30上的信号结合区34最好是一个至少含有10个、20个、50个或者100个功能团33的聚合物，信号分子30可以通过这些功能团33与信号发放基团36相连。因此，如果将信号扩增微粒11与大量信号分子30相连，每个信号分子30再与信号发放基团36相连，那么就至少可以将信号扩增10-100倍。例如，将含有大约50个吖啶基团36、直径为0.5微米的信号扩增微粒11与每个信号分子30相连，分析物分子50通过分析结合分子40与微粒10相连，假设只有分析物结合了的信号扩增微粒11可以从未与分析物结合的信号扩增微粒11中分离并且保留下来，其他背景信号都可以除去，那么通过使用传统光度计就可以容易地检测到分析物分子50。如这里所描述的，通过使用含有分析物结合分子的第二微粒，可以将结合了分析物的信号扩增微粒11从未结合分析物的信号扩增微粒11中容易地分离出。\n[0044] 图2是信号扩增微粒11的一种实施方案，该信号扩增微粒11含有由寡核苷酸构成的第一、第二连接基团和信号分子。微粒10是一个直径为0.1-0.5微米、表面含有胺基功能团21的塑料珠。这种塑料珠可以通过商业途径获得，比如Bangs实验室(Fishers，Ind)可以提供各种大小、外周包裹不同功能团的球形珠，功能团的类型包括(但不仅仅限于)：\n氨基、羧基、羟基、巯基，肼基，酰氨基化合物，氯甲基，醛基、环氧基，磺酰基，同时他们还在提供的TechNote#205资料中描述与之相应的共价键结合技术。第一连接基团26是一个长度适当(比如30对碱基)并且含有特定核酸序列的寡核苷酸。第二连接基团29(例如第二寡核苷酸)，也是一个大约30对碱基长度并且含有特定核酸序列的寡核苷酸。对于相关领域的人员而言，第一附属基团26和第二附属基团29的长度和序列可为任何核苷酸序列中只要它们的互补碱基对提供了稳定快速的结合条件。典型地，碱基对选择的长度和序列应该保证至少50度的熔点，更经典的至少为70度。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的5’末端通过交联反应与微粒10表面的胺基功能团21相连。一种适用于这种交叉反应的试剂是N-羟基琥珀酰亚胺-辛二酸酯，一种双功能基N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。\n[0045] 信号分子30是一种寡核苷酸31(例如第三寡核苷酸)，它的长度至少含有20，50个、100个或者200个核苷。在一种实施方案中，典型的第三寡核苷酸31含有两个区域和大约250个核苷。第一个区域是位于第三寡核苷酸31的5’和3’末端上的结合区32，它由一个与第一寡核苷酸连接基团26互补的核苷酸序列组成。第二个区域是含有大量功能团33的信号结合区34，它由第三寡核苷酸31上剩余的核苷酸序列组成。一种常见的用于寡核苷酸合成中的功能团33是伯胺。第三寡核苷酸31上的大量功能团33通过与吖啶酯分子37交联，从而形成第三寡核苷酸31中信号结合区34上的信号连接基团36。在寡核苷酸合成过程中，可用于结合初级胺和寡核苷酸的方法包括(但不仅仅限于)：使用含有伯胺的核苷磷酰胺或者用于将伯胺引入寡核苷酸的非核苷磷酰胺。这些磷酰胺可以与寡核苷酸有效地结合，也容易从商业途径获得，比如由Glen Research(Sterling，VA)提供伯胺衍生的dT/dC phosphoramidite和由Clontech(Palo Alto，CA)提供伯胺衍生的非核苷磷酰胺(名为UniLinkTM AminoModifier)。通常进行寡核苷酸合成时，磷酰胺中的伯胺受到保护，当寡核苷酸完成合成时保护取消，伯胺又重新释放出来。当信号分子31和附属的吖啶信号发放基团37的制备完成后，信号分子31通过其结合区32上的核苷与寡核苷酸连接基团26上互补核苷之间的杂交反应与第一连接基团26相连。\n[0046] 分析物结合分子40包括第二结合区35，它是一个与第二连接基团29互补的寡核苷酸序列，可以通过传统的化学交联与分析物结合分子40相连。通常情况下，第二结合区\n35可以通过其5’末端的功能团与分析物结合分子40相连。这些功能团包括(但不仅仅限于)伯胺、巯基基团和羧酸，它们与分析物结合分子40上的功能团交联；对于典型的蛋白质分析物结合分子(比如抗体、受体、或者其他含多肽物质)，它的功能团可能是伯胺、巯基基团、羰基和羧酸等等。\n[0047] 图1中的信号扩增核心微粒2为各种信号扩增微粒11的制备提供了一个方便平台。图3A中，每个第一连接基团26和第二连接基团29都是寡核苷酸连接基团。核心微粒\n2是由固定的寡核苷酸连接基团26和29共同组成。由于寡核苷酸连接基团26和29通过相同的反应与微粒10表面上的功能团20连，从而很容易形成一个含有相同寡核苷酸连接基团26和29的核心微粒2。反应中寡核苷酸26和29之间的摩尔比率决定了它们与微粒\n10之间的连接比率。同样，在另一个状态下，核心微粒2与不同的第三寡核苷酸信号分子\n31和/或分析物结合分子40相连。在不同的实施方案中，第一寡核苷酸连接基团26和第二寡核苷酸附着物29之间的序列可以是相同或者不同，但是为了使核心微粒2可以应用在许多不同检测方法中，第一寡核苷酸连接基团26的序列应不同于第二寡核苷酸附着物29。\n在这种方式中寡核苷酸信号分子31与分析物结合分子40之间的连接可以通过高效高重现性的杂交条件完成。这样可以将核心微粒2与同一批寡核苷酸信号分子31相连先形成非特异性信号扩增微粒11，然后在以后步骤中再将其转化为特异性信号扩增微粒。\n[0048] 图3B和3C中，第一寡核苷酸连接基团26和第二寡核苷酸连接基团29通过另外两种方法与微粒10相连从而形成信号扩增核心微粒2。在这两种方法中，含有大量功能团的载体分子23(比如多聚赖氨酸)作为载体与大量寡核苷酸以共价键方式相连。在图3B的具体体现中，至少有三种不同的寡核苷酸与载体信号23相连。其中一种寡核苷酸是与寡核苷酸38序列互补的寡核苷酸39，寡核苷酸38通过共价键与微粒10相连。在图3C的实施方案中，载体分子23本身含有大量与信号发放分子37(比如吖啶)直接相连的功能团，因此就不再需要通过第一寡核苷酸26与信号分子30相连了。在这些实施方案中，与载体分子23相连的第二种寡核苷酸是寡核苷酸连接基团29。\n[0049] 在某些实施方案中，如在图3D-3G中表现的，信号发放分子37(比如吖啶)被信号产生分子43所取代(比如碱性磷酸酶)，其本身并不产生信号，但在催化特定底物产生信号(如发光或颜色)的反应。如同连接信号发放分子37一样，信号产生分子43也可以同样的被连接到信号扩增微粒上。信号产生分子43可以被直接的(图3E)或间接的通过核酸杂交(图3D)连接到载体分子23上。或者，信号产生分子43可以被直接的(图3G)或间接的通过核酸杂交(图3F)连接到信号扩增微粒上。\n[0050] 为了特异性识别分析物，所需的仅是信号扩增微粒11通过第二寡核苷酸结合区\n35与特殊分析物结合分子40相连。在图2的实施方案中，分析物结合分子是一种与寡核苷酸结合区35交联的抗体41。抗体41上的分析物结合区44是一个含有抗体分子可变区的普通抗体结合区。因为抗体41具有分析物特异性，所以一组组装了信号分子30的核心微粒2可以与不同类型的抗体相连形成各种特异性信号扩增微粒11，从而简化了信号扩增微粒11有效制备的控制步骤。在这里，“抗体”这一术语可以理解为任何一种从动物身上获取的抗原识别多肽，或者其他含有各种结合区的氨基酸序列，这些结合区中的DNA编码由动物免疫系统的不同成分编辑而成。它包括但不仅限于多克隆性抗体、单克隆性抗体、噬菌体显示抗体序列、T细胞受体以及任何种类的免疫球蛋白。在这里它还包括功能性抗原结合片段，比如Fab、Fab1’或者含有任何抗原结合区的嵌合分子。\n[0051] 在检测系统中，我们使用信号扩增微粒11对特定分析物进行检测。图4所示为一个使用信号扩增微粒11对分析物进行检测的系统51。该分析物检测系统除了包括由第一微粒10组装而成的信号扩增微粒11之外，还包括一个由二级微粒60组装而成的分离微粒\n73。由于二级微粒60与第一微粒10在物理结构上存在很大差异，因此可以很容易地将信号扩增微粒11与分离微粒73分开，除非它们已经通过与分析物50结合形成复合体65，在这种情况下，也可以将复合体65与未结合的信号扩增微粒11分离。影响复合物65与未结合的信号扩增微粒1分离的物理结构差异包括(但不仅仅限于)大小差异、密度差异、电、磁和荧光的特性差异。在一种实施方案中，分离微粒60的体积比信号扩增微粒11大得多。\n第二种具体体现中，由于单独微粒60含有铁磁性成分62，所以利用磁铁就可以将含有铁磁成分分离微粒60与非铁磁性信号扩增微粒11进行分离。第三种实施方案中，分离微粒60既具有铁磁性，体积又比信号扩增微粒11大很多。还有一种实施方案是将第二微粒60与荧光标签连接，然后使用一种荧光流式细胞仪(FACS)根据微粒的荧光性对其进行分类，从而将第二微粒60从样本溶液中分离出来。在其他一些实施方案中，分离组分是处于非流动固态，比如用微量滴定板代替分离微粒。\n[0052] 在一些实施方案中，第二微粒60的直径最少为0.1微米，典型的是为10微米，最典型的是1-5微米之间。所以很容易理解在这里推荐的任何一种微粒，比如微粒10和/或微粒60，尽管它们被命名为纳米球体或者微球体，但是它们在形状上不需要是球体。事实上，微粒10或者微粒60可能是不规则形状。因此，这里“直径”被定义为微粒群中最大长度的平均值。如果分离微粒73是由一种具有铁磁性的第二微粒60组成，那么可以通过磁铁将混合物中的分离微粒73吸附到容器壁上，而此时信号扩增微粒11在混合物中处于悬浮状态，然后通过冲洗的方法可以将信号扩增微粒11与分离微粒73分离，除非信号扩增微粒已经与分离微粒73相连形成复合体65。\n[0053] 分离微粒73通过第二分析物结合分子70与分析物50相连。如同第一微粒10，第二微粒60表面也含有大量功能团61(比如第三功能团)。如图4A所示，这些功能团61可以与第二分析物结合分子70直接相连，也可以通过第三连接基团65与第二分析物结合分子70相连，如图4B所示一些实施方案中，第三连接基团65是一个第三寡核苷酸连接基团\n66，它相似于信号扩增微粒11上面的第一寡核苷酸连接基团26和第二寡核苷酸连接基团\n29。第二分析物结合分子70由结合区71(比如第三结合区)和第二分析物结合区74共同组成，第二分析物结合区74相似与信号扩增微粒11相连的第一分析物结合分子40中的第二结合区35和第一分析物结合区44。分离微粒73中第二分析物结合分子70和第一分析物结合分子40的类型可以是相同或者不同。例如在一种实施方案中，第一分析物结合分子\n40和第二分析物结合分子70可能是用抗原分析物50免疫动物得到的单克隆抗体。另一些实施方案中，第一分析物结合分子40和第二分析物结合分子70可能是不同杂交瘤细胞排列的单克隆抗体。\n[0054] 第一信号结合分子40和第二信号结合分子70最好与分析物50上的不同结构特征结合，因为这样有助于大量信号扩增微粒11与分离微粒73之间相连形成复合体65。为了清楚说明，图4A中只描述了一个信号扩增微粒11与一个分离微粒73形成的复合体65，但是在实际过程中，我们知道会有大量信号扩增微粒11与大量分离微粒73相连，所以准确地说复合体65是一种集合网格结构。复合体65的组成至少包括一个分析物分子50，一个信号扩增微粒11和一个分离微粒73。复合体65的形成类似于抗原抗体聚集反应或者抗体通过抗原与小珠之间发生的聚集反应。当分析物体积较大比如细菌，病毒或者是高分子时，会有大量的分离微粒73和信号扩增微粒11与其相连。在这种情况下，由于大量的信号扩增微粒11与分析物相连，所以复合体65的形成就更好地提高了检测灵敏度。基于分离微粒73具有独特的分离特性，因此可以将复合体65与未复合的信号扩增微粒11轻易分离，大大减少了未复合信号扩增微粒11引起的背景噪音。\n[0055] 典型的复合物65的沉积速度比信号扩增微粒11快，因此在某些实施方案中，利用一些方法比如离心技术就可以将分析物65从悬浮液中分离出来。复合物65的形成会使其体积结构比信号扩增微粒11或者单独微粒73大得多，因此在一些实施方案中，通过过滤法也可以将其分离。另外一些实施方案中，聚集而成的复合体65可以通过其本身含有的分离微粒73与微量滴定板表面相连。尽管离心法、过滤法或者吸附法可应用于对少量分析物的快速而经济的检测中，但是与这里的MBA技术相比，它们增添了附加步骤。\n[0056] 因此，最好尽可能用简单的技术将复合体65和未复合的信号扩增微粒11分离。如前面所提到的，通过引入铁磁性分离微粒73(比如一个磁性小珠)可以将未与分离微粒60连接的信号扩增微粒11冲洗掉。将信号扩增微粒11、分离颗粒73和分析物共同进行培养，然后使用磁铁将分离颗粒73吸附到特定位置比如试管壁上，因此所有的信号扩增微粒11，除了那些与分离微粒73相连的，都可以从反应混合物中除去，而大部分的分离微粒73保留下来。将磁铁从试管附近移开释放分离微粒73，用适当的洗涤液进行冲洗，然后再将磁铁移近试管，倒掉洗涤液。经过一至三次冲洗后，分离微粒73被保留在试管中，其中一些分离微粒73通过第一分析物结合分子40和第二分析物结合分子70上的第一结合区44和第二分析物结合区74与信号扩增微粒11相连形成复合物65。所以保留下来的复合物65中信号扩增微粒11的数量将直接反映出分析物的数量。\n[0057] 因此，发明的另一部分是关于信号扩增微粒11与分离微粒73的结合对分析物进行检测的方法说明。图5所示为检测方法的一种实施方案。这个方法是将含有分析物50的样本溶液与含有第一分析物结合分子40和信号分子30组成的信号扩增微粒11接触。同时也将样本溶液与含有第二分析物结合分子70的分离微粒73接触从而形成混合物。如图\n5A所示，样本溶液同分离微粒73和信号扩增微粒11之间的接触可以同步进行，也可以如图\n5B所示分两步完成。将混合物培育足够长时间，从而使第一分析物结合分子40和第二分析物结合分子70与分析物50相连形成复合体65。典型地，混合物需要培养不超过20分钟，或者不超过10分钟，或者不超过5分钟。由于复合体65中的分离微粒73具有不同的物理特性，因此通过将复合体65与未复合的信号扩增微粒11分离，就可以除去未复合的信号扩增微粒11。最好对保留下来的复合体65至少再冲洗一遍，这样能进一步清除未复合的信号扩增微粒11。然后将保留下来的复合体65置于能使信号扩增微粒11中信号发放基团36发放信号的环境中。最后对发放的信号数目进行测量，它直接反映出复合体65中分析物50的数量，也反映出样本溶液中分析物50的数量。最好整个方法不超过30分钟、20分钟或者\n15分钟。\n[0058] 图6是实施样本细菌检测方法时所需试剂盒的一个实施方案。在这个实施方案中，分析物50是一种表面含有大量抗原的细菌53。信号扩增微粒11包括寡核苷酸信号分子31，它由大量吖啶基团37标记并且与信号分子31中信号结合区34上的核苷酸结合。信号微粒31通过第一结合区32与第一寡核苷酸结合基团26之间的碱基对互补，进而与第一微粒10相连。细菌53表面抗原产生的特异性单克隆抗体通过第二寡核苷酸连接基团29和抗体41的第二寡核苷酸结合区35之间的碱基对互补，进而与第一微粒10相连。反过来，抗体41与抗原54表面的抗原54在第一结合位点相连。分离颗粒73包括一个与铁磁性分离微粒60相连的单克隆抗体41。如图4B所示，单克隆抗体41是第二分析物结合分子70，它与形成第三结合区的第三寡核苷酸71相连，其中第三结合区通过第三寡核苷酸连接基团66和第三寡核苷酸71之间的碱基对互补，进而与微粒60相连。将信号扩增微粒11与含有细菌53和分离微粒73的样本溶液混合后，通过前面描述的磁铁吸附和冲洗就可以将复合体65分离出来。对洗涤后的复合体65中吖啶基团发放的光量进行检测，并且将其与标准曲线进行比较即可以得到样本中细菌53的数量，或者将其与定量对比试验中的发光数量进行比较。\n[0059] 图7所示为抗体分析物79检测试验盒的一种实施方案，其中分析物结合分子是抗原81和82。抗原81和82分别与信号扩增微粒11和分离微粒73的表面相连。在一种实施方案中，抗原81和82是人体免疫缺陷病毒(HIV)抗原，比如HIV颗粒的包膜蛋白或者从裂解病毒而来的病毒蛋白。如图7中信号扩增微粒11所示，抗原81和82的其中一种或者两种都可以通过寡核苷酸结合区(比如结合区35)和寡核苷酸连接基团29的连接从而与微粒相连。同样，如图7中分离微粒73所示，抗原81和82中至少有一种或者两者与一种微粒直接相连。由于抗体79通过抗原与信号扩增微粒11和分离微粒73相连，因此可以对样本中的目标抗体79进行检测。如前面所述，当对分离微粒73进行分离和洗涤后，将同分离微粒75相连而保留下来的信号扩增微粒11数目与标准曲线作比较，就可确定样本中抗体83的数量。\n[0060] 图7中抗原81和82是一种高分子结构微粒比如HIV包膜蛋白，本领域技术人员可以通过常规技术将任何一种抗原决定物与信号扩增微粒11和分离微粒73相连。如图8所示，抗原81和82中一种或者两种都是小分子抗原决定基，比如多肽或者其他半抗原，它们很容易与适当的载体分子84相连，比如小孔帽贝型花色素，BSA，E.coli毒素，卵清蛋白及其类似物等等。在这种情况下，载体分子84就成为分析物结合分子40和/或者71的一部分，而且载体分子84的一个区域中含有连接结合区35和/或者71，另一个区域含有交联的抗体81。信号扩增微粒11和分离微粒73中抗原81和82的结构可以是相同或者不同。\n[0061] 在各种实施方案中，不同类型的分析物结合分子之间可以进行相互组合。如图9所示，信号扩增微粒11与含有抗原决定基的抗原81相连，其中抗原决定部位检测可以通过对目标抗体79的检测而完成。另一方面，分离微粒73也可以与一个抗异种抗体42相连，例如同所有人类IgG分子结合的兔抗人IgG。在这个例子中，由于分离微粒73通过分析物结合抗体42与所有人类抗体79之间发生非特异性结合，所以信号检测只有通过对信号扩增微粒11上同抗原81分析物结合分子特异性结合的抗体79的测量来完成。\n[0062] 图10所示为特定序列核酸作为分析物90检测的一种实施方案。在这个实施方案中，第一分析物结合分子40是一个核酸序列89，它的结合区91不仅包括一个与第二寡核苷酸连接基团29互补的核酸序列，还包括一个与核酸分析物90上第一目标序列94互补的核酸序列所组成的分析物结合区92。第一核酸序列89不仅通过结合区29与信号扩增微粒\n11相连，还通过与分析物结合区92的碱基互补而与目标核酸分析物90上的目标序列94相连。分离微粒73包括一个第二核酸序列95，它含有一个与分离微粒73上第三寡核苷酸连接基团66的序列互补的结合区。第二核酸序列95也包括一个第二分析物结合区97，它是一个与目标核酸分析物90上第二目标核酸序列互补的核酸序列。当为了促进杂交，混合后的目标核酸90上的第一核酸序列94和第二核酸序列98分别与信号扩增微粒11和分离微粒73相连从而形成复合体65。将复合体65中的信号数目与标准曲线进行比较从而可以得到样本溶液中目标核酸分析物90的数量。图10所示为信号扩增微粒11和分离微粒73的结合位点，由此可看到分析物分子上不止一个可供连接的结合位点。同时也容易理解分析物结合分子89和/或者95不一定需要是第一核酸序列。在这种情况下，它可能只包含分析物结合区，与微粒10或者分离微粒60直接相连。\n[0063] 在上述实施方案中，各种连接基团25/28/65分别是指寡核苷酸26/29/66。以前已提到寡核苷酸连接基团使用的灵活性。但是这个发明不仅仅限于使用寡核苷酸作为连接基团。如上面所述，在一些实施方案中，信号分子30和/或者分析物结合分子40和70通过与功能团20和61的直接连接，或者通过与插入化学基团(比如载体分子84)的连接，进而连接到微粒10和/或者60上。\n[0064] 图11展示一种直接化学交联的实施方案。这种直接化学交联的办法用于连接信号分子30及分析物结合分子40到信号扩增微粒11上。这种办法也可用于连接分析物结合分子70到分离微粒73上。在该实施方案的例子中，R代表连接基团25，28或者65，这些R基团用于连接残基32/35/71到功能团20/61(在信号扩增微粒或分离微粒上)。这样，结合区32和35(在信号分子30上)以及71(在分析物结合分子70上)便与相应的功能能团20/61连接。这种一一相应的价键连接是通过残基32/35/71-R连接基团-功能团20/61而实现的。\n[0065] 实施例1\n[0066] 应用基于微粒的信号扩增法对细菌的检测\n[0067] 细菌的制备：首先将实验室中携带卡那霉素抗性基因的E.coli，M15细菌涂在LB平板上，加入4mL、浓度为25微克卡那霉素/mL的成年牛血清。然后将其置于30℃温度中振荡培养20-24小时(250rpm)。取2mL所得培养液与300mL 25微克卡那霉素/mL牛血清进行混合，然后将其置于30℃温度中振荡培养一整夜或者15个小时(250rpm)。倒出40mL培养液，加入10mL丙三醇，并且将所得混合物分成1mL每小份，作为标准和阳性对照样本溶液。最后将25微克样本溶液以1∶500和1∶1000比例进行稀释并且涂抹在琼脂培养基上，将其置于37℃温度中培养一整夜，计算丙三醇中所存的生物群数量即可完成对细菌浓度的测定。\n[0068] 对300mL混合液中残留下来的细菌细胞首先进行6000xg离心5分钟并且将其悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。然后用250mL磷酸盐缓冲液(PBS)对细菌悬浮物进行稀释、离心、冲洗和再离心，并将其悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。随后将细胞悬浮物置于90℃温度中间歇振荡培养90分钟，使其丧失活性。最后把50mL培养后的悬浮液涂到卡那霉素LB平板上，以判定确实无活细菌存在。\n[0069] 多克隆抗体的生成：可以通过各种已知方法对兔或者其他动物进行免疫，从而生成抗灭活细菌多克隆抗体。同时也可以通过商业途径获得多克隆抗体，比如ProSci Inc.，(Poway，CA)就是一家致力于生产此类抗体的公司。由于弗氏完全佐剂(Complete Freund′s Adjuvant)含有细菌成分，因此在非活性细胞的免疫机制中我们使用弗氏不完\n8\n全佐剂(Incomplete Freund′sAdjuvant)对兔进行免疫，大约使用10 细菌进行免疫。兔每两周接受两次免疫增强，抗菌血清由从兔取血获得并出去血细胞。\n[0070] 抗体的亲和纯化：在多克隆抗体的亲和纯化过程中，以细菌为亲和基质使用。在1升含3克葡萄糖的牛血清中，细菌培养至晚期指数期。通过6000xg离心5分钟，收集细菌并悬浮在250mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。再次离心后，，细菌沉淀物在250mL洗提液(0.5M醋酸盐，0.15M摩尔氯化钠，pH 2.4)中再次分散。再次沉淀后用250mL磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。最后将细菌完全悬浮在10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。\n[0071] 首先用10X磷酸盐缓冲液(PBS)将20-40mL抗菌血清调整成为1X磷酸盐缓冲液(PBS)，然后将1XPBS稀释到1-2mg蛋白质/毫升，最后与细菌混合。将其置于室内温度下，轻微振荡培养30-40分钟。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)将混合溶液稀释到250mL。沉淀后用250mL磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次，然后将其悬浮与30mL洗提液中。将其置于室内温度下培养10分钟，再次离心沉淀并收集上清液。再将细菌悬浮于20mL洗提液中，在室内温度下培养10分钟，再次离心沉淀并收集上清液。将所有上清液在2-4L含0.1％聚山梨醇酯的磷酸盐缓冲液(PBS)于2-8℃温度下透析整晚。将所得溶液12,000xg离心30分钟和通过超滤作用浓缩为2-5mg蛋白/mL。已纯化的抗体中的IgG分子还可以通过蛋白A层析柱或者羊抗兔IgG层析柱得到进一步纯化。\n[0072] 抗体滴度测定：由于抗体的制备采用类似的方法但不同的样品，此处应用一种常用的抗体定量滴度测定方法以有助质量管理和重现性。在这里，滴度测定是指对试验背景中释放可检测信号的抗体浓度或者其稀释后浓度的检测。下面是一例抗体滴度的测定方案：\n[0073] 将2000个热灭活的细菌混合到六个1.0mL的结合缓冲液中(含有10％牛血清的磷酸盐缓冲液PBS)。用两个不含细菌的1.0mL结合缓冲液作为阴性对照组。另外含有细菌的六个试管中分别加入：10微升抗体(1∶100最终稀释液)，5微升抗体(1∶200最终稀释液)，2.5微升抗体(1∶40最终稀释液)，1∶10稀释的12.5微升抗体(1∶800最终稀释液)，1∶10稀释的6.25微升抗体(1∶1600最终稀释液)以及1∶10稀释的3.12微升抗体(1∶3200最终稀释液)。将其置于在室温下轻微振荡培养20分钟。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)进行离心(6,000rpm离心5分钟)、冲洗和悬浮，重复四次。最后再将细菌(以及对照液)悬浮于10mL结合缓冲液中。\n[0074] 将5微升抗兔山羊受体中加入过氧化酶(或者已经由生产厂家直接加入)。将其置于室温下轻微振荡培养25分钟。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)进行离心(6,000rpm离心\n5分钟)、冲洗和悬浮，重复四次。通过TMB方法测量结合的过氧化酶活性。简单地讲，将\n10mg TMB(Sigma，T2885)溶解到1mL DMSO中，然后用99mL 0.1摩尔PH值为6.0的醋酸钠缓冲液稀释。在使用前，先将溶液中加入33微升过氧化氢(30％W/W)。然后将150微升所得溶液置于阴暗环境中培养15-30分钟。加入50微升2M硫酸使反应停止。以阴性对照组为背景，使用分光光度计测量450nm的光吸收度。数据绘图。如图15所示，测定浓度就是线性直线与X轴(代表稀释浓度)之间的交点。\n[0075] 实施例2\n[0076] 寡核苷酸的序列、合成和连接\n[0077] 寡核苷酸的设计：图12中有四个寡核苷酸A-D，它们的序列以随机产生的寡核苷酸连接基团26和29的序列为基础。在例二中，代表第一寡核苷酸连接基团26的寡核苷酸A由dA(40)(即40个脱氧腺苷残基)组成。寡核苷酸A与寡核苷酸C的3’末端互补，其中寡核苷酸C的3’末端由40个脱氧胸苷残基组成，形成了信号分子30上的结合区32。在这个例子中，代表第二寡核苷酸连接基团29的寡核苷酸B由dG(30)(即30个脱氧鸟苷)组成。寡核苷酸B与寡核苷酸D互补，其中寡核苷酸D由dC(30)(即30个脱氧胞苷)组成，形成了与抗体41连接的结合区35，这里的抗体41用作分析物结合分子40。每对寡核苷酸之间互补区的熔点都高于70℃。通过传统的DNA合成仪可以对所有寡核苷酸进行合成。\n[0078] 寡核苷酸C的碱基长度为190，其中40个脱氧胸苷残基位于3’末端，另外150个脱氧胸苷残基位于信号结合区34。当利用DNA合成技术对寡核苷酸进行高效合成后，含有\n190个碱基长度的寡核苷酸C可以一步合成。否则，寡核苷酸C也可以由四个较小的寡核苷酸前体97(寡核苷酸C1-C4)合成，其中寡核苷酸C1含有40个脱氧胸苷残基。图12B对四个寡核苷酸前体的依次连接进行了描述。寡核苷酸C的生成是通过利用ATP的多聚核苷酸激酶对信号结合区寡核苷酸(C2-C4)5’末端和寡核苷酸结合区(C1)进行连接从而完成的。寡核苷酸C1-C4通过以带羟基末端的寡核苷酸99(12个碱基长度)作为模板排列，通过T4DNA连接酶相连。模板寡核苷酸99的碱基与相邻寡核苷酸3’和5’末端的碱基分别互补，比如dA(6)d(CT)(3)，d(CT)(3)dC(6)和dC(6)dT(6)。信号结合区寡核苷酸(C2-C4)的中心部分由衍生了功能团(比如伯胺)的去氧核酸残基组成。或者，通过把带有衍生功能团的非核酸化合物引入寡核苷酸合成，可以将功能团引入到信号结合分子中去。含有衍生功能团的去氧核苷或者非核苷合成物的含磷衍生物也可以通过化学合成有效地引入寡核苷酸。这些含磷衍生物可以通过商业途径获取，比如Glen Research(Sterling，VA)可提供由伯胺衍生的dT含磷衍生物，Clontech(Palo Alto，CA)可提供由伯胺衍生的非核苷含磷衍生物(名为UniLinkTM AminoModifier)。\n[0079] 连接后，将反应混合物置于65℃中加热15分钟使模板寡核苷酸分离。由于模板寡核苷酸和未连接的寡核苷酸(C1-C4)相对比较小(一般不超过40-50个碱基)，因此通过凝胶过滤栏可以很容易地将它们从长约190个碱基的连接产物中除去。连接产物数量和性质的测定可以通过银染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳反应来完成。\n[0080] 尽管，根据试验中实际情况的要求(比如灵敏度和线形范围)，寡核苷酸C的长度和功能团数量(比如寡核苷酸C上伯胺)可以多样化。但是衍生的功能团数目最好不要超过寡核苷酸C上所有碱基数目的一半，这样与信号分子(比如吖啶)相连的寡核苷酸C就依然能够保持水溶性。在一些实施方案中，尽管寡核苷酸C的碱基数量少于70、60或者50，而且碱基上的功能团数量也分别少于20、15或者10，但是仍然可以保证检测的灵敏度。在这种情况下，寡核苷酸C可以是一个由杂交区32和信号结合区34组成的单一寡核苷酸。\n[0081] 实施例3\n[0082] 吖啶酯和寡核苷酸C的键合\n[0083] 多年来吖啶一直被应用于诊断学实验中，它的发光效率高易于检测从而提高了检测的敏感度。吖啶很容易通过商业渠道获取。但是，它必须经过激活才能与含在信号区的胺基相连。一种常用方法就是将N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)引入到吖啶分子中。在这里，所推荐的合成吖啶酯方案是1983年由Week et al(Clin.Chem.29：1474)发展而来的，这个方案已被许多诊断学方面的生产厂家采用。一些销售商可提供吖啶酯合成服务，比如分子探针公司(Portland，OR，USA)。\n[0084] 因为琥珀酰亚胺基酯可以与伯胺之间发生反应，因此如上面所描述的，通过将伯胺引入到寡核苷酸中，就可以完成吖啶与寡核苷酸C的信号结合区34之间的连接。为了防止N-羟基琥珀酰亚胺酯在水溶剂中水解和提高吖啶与寡核苷酸C的有效连接，建议最好使用有机溶剂，比如与吖啶酯和寡核苷酸C均相容的二甲亚砜(DMSO)。\n[0085] 将10微摩尔的吖啶NHS酯(4-(2-琥珀酰亚胺氧羰乙基)苯基-10-甲基吖啶-9酯氟磺酸盐，约5mg，制法见Clin.Chem.29：1474)溶解在1mL二甲亚砜(DMSO)中，然后再加入溶解于0.5mL二甲亚砜(DMSO)中的0.1微摩尔寡核苷酸C。吖啶与寡核苷酸C中的伯胺的摩尔比为10∶1。将混合物置于阴暗室温下，轻微振荡培育4-5小时。然后再加入\n100μL的1M Tris-HCl(pH 7.5)，然后置于同样环境中培育30分钟，以中和未反应的吖啶酯。将混合物倒入葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25色谱柱中，用0.1M醋酸钠(pH 5.2)进行洗脱。将洗脱液分成每小份0.5mL保存，测量OD260。收集峰值洗脱液，混合并且贮存在-70℃环境下。\n[0086] 为了评估特定活性，用0.1M醋酸钠(pH 5.2)将10微升寡核苷酸稀释到1.0mL。\n取出0.5mL稀释液，测量OD260吸光率，从而测算寡核苷酸浓度。取100微升溶液做一系列\n2 12\n稀释，比如稀释10-10 倍。从每种稀释液中均取出50微升，测量RLU值。由于RLU平均值与稀释系数成反比，因此可以得到50微升原溶液(即未稀释溶液)中的RLU，从而测定出比活性，比如RLU/pmol寡核苷酸C。\n[0087] 实施例4\n[0088] 寡核苷酸连接基团与信号扩增微粒和分离微粒之间的连接\n[0089] 该发明中使用的磁珠和微球体均可以从很多销售商获得。Bangs实验室(Fishers，IN)可以提供不同大小和质地的微球形小珠，包括那些外裹胺基功能团、含有或不含有铁磁性的小珠。直径为1.0微米的磁珠可用为于分离微粒73，直径为1微米的微球可用为信号扩增微粒11。小珠的大小允许它们与合适的分析物结合，比如含有一个细菌可以和一个或者两个磁珠，或与一个或者两个吖啶标记的信号扩增微粒11结合。\n[0090] 位于寡核苷酸5’末端上的寡核苷酸连接基团26和29与信号扩增微粒11相连，其中寡核苷酸连接基团26和29均含有伯胺。这里描述的方案不仅适于将寡核苷酸连接基团\n26和29与信号扩增微粒11相连，也适于将第三寡核苷酸连接基团66与组成分离微粒73的磁珠相连。这里的方案是从销售商(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)提供的方案材料修改而来，在此作为文献收入。用超过滤或离心所得的试剂级水对200mg羧基衍生的微粒冲洗两次。将微粒悬浮于少于2mL的水中。在使用前，将384mg碳二亚胺(EDC)溶解到\n20mL，100毫摩尔HEPES缓冲液中(pH 7.5)。立即分别将1.8微摩尔寡核苷酸A和0.2微摩尔寡核苷酸B加入到EDC溶剂中，用力振荡2分钟以保证寡核苷酸完全溶解。将所得寡核苷酸/EDC溶液立即倒入前面制备好的微粒溶液中。在室温下振荡16-24小时。用40mL水对寡核苷酸连接好的微粒冲洗三次，然后将其悬浮于10mL含有1xPBS(磷酸盐缓冲液)、\n5％甘油、1％去核酸酶BSA、0.1％Tween 20和0.5％Proclin防腐剂5000的贮藏缓冲液中。\n将所得溶液置于68℃下培育4小时，同时每30分钟用力振荡一次。最后，在室温下将溶液再旋转16-24小时，补充贮藏缓冲液后将其置于4-8℃下保存。通过测定上清液OD260吸光率，即可对寡核苷酸连接的有效性进行评估。\n[0091] 实施例5\n[0092] 寡核苷酸与抗体的连接\n[0093] 图12中，5’末端上含有胺基基团的寡核苷酸D以共价键的方式与抗体41相连，形成分析物结合分子的结合区。一种值得推荐的连接寡核苷酸D和抗体方法是使用双功能交联剂。这里可供参考的一种双功能交联剂是Sulfo-SMCC，它由一个NHS酯和一个马来酰亚胺基团共同组成，其中马来酰亚胺与一个间隔臂相连。因此，这个交联剂在与一个分子上的伯胺发生反应的同时，还与另一个分子上的巯基发生反应，从而将两个分子连接起来。如果寡核苷酸D的终端上含有一个伯胺，那么最好将寡核苷酸和交联剂Sulfo-SMCC以1∶5的摩尔比率(或者根据经验决定)倒入磷酸盐缓冲液(PBS)中，置于室温下培养30-60分钟。\n然后将反应溶液倒入脱盐色谱柱以除去未参与反应的交联剂Sulfo-SMCC。将所得到的寡核苷酸和含有游离巯基的抗体以2∶1的摩尔比倒入磷酸盐缓冲液(PBS)中，置于4度环境下培育一整夜，其中抗体中游离巯基的引入可以通过还原剂(比如2-半胱胺)或者化学修饰来完成。寡核苷酸连接抗体与未连接寡核苷酸之间的分离可以通过凝胶色谱或者离心过滤完成。这些分离技术已经非常成熟。\n[0094] 实施例6\n[0095] 抗体与磁珠的直接连接\n[0096] 另一方面，抗体可以通过化学键合与分离微粒73(或者信号扩增微粒11)直接相连，而不用通过第三寡核苷酸连接基团66。这里的方案是从销售商(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)提供的方案材料修改而来，在此作为文献收入。用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)将50mg胺基化的磁珠(240毫摩尔胺基/毫克)冲洗三次。然后将磁珠悬浮于1mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，并加入了1mL亲和纯化过的单克隆抗体(5mg/mL)。轻微振荡混合后，加\n3\n入0.5mL 5mM新鲜制备的交联剂BS。将混合物置于室温下轻微振荡培养60分钟。加入\n3\n50μL的已准备好的5mM新鲜BS。将混合物轻微摇动，然后置于室温下培养60分钟。加入\n50μL的1M Tris缓冲液(pH 7.5)，继续培养10分钟后终止反应。微粒连接的抗体与未连接的抗体之间的分离可以通过磁性分离和冲洗来完成。连接效率的评估可以通过对280nm磁珠吸光度的测量来完成。\n[0097] 实施例7\n[0098] 吖啶标记的寡核苷酸和抗体与微粒之间的连接\n[0099] 吖啶标记的寡核苷酸C和寡核苷酸D标记的抗体40分别通过共价连接于微粒的寡核苷酸A26和B29杂交联接于微粒。杂交时，需要先将以下几种成分置于42℃环境中预热5分钟：例4所示200mg置于5mL存储缓冲液中的外裹寡核苷酸A和B的微粒、5毫升2.0微摩尔吖啶标记的寡核苷酸C、22.5mg(5mL)寡核苷酸D连接的抗体、以及15毫升2X杂交缓冲液(40mM Tris盐酸盐，pH 8.0，1.0M氯化钠)。将这些成分混合，并且置于已经预热到\n42℃杂交烤箱中培育2小时。然后将混合物置于黑暗环境室温下旋转培育5小时。收集微粒并且用磷酸盐缓冲液(PBS)对其进行离心冲洗或者超滤冲洗4次，最后将微粒悬浮储存\n9\n缓冲液液配成浓度为10 颗粒/mL。\n[0100] 通过使用UV紫外诱导的交联剂，比如补骨脂素，可以进一步提高双链DNA杂交的稳定性。\n[0101] 实施例8\n[0102] 血小板细菌检测的试剂盒构成\n[0103] 表1所示为所用的试剂盒的组成成分和试剂：\n[0104] 表1\n[0105] \n组成成分 主要试剂\n9\n1 结合试剂 含有抗体标记的磁珠分离微粒的存储缓冲液(10\n微粒/mL)\n9\n2 检测试剂 含有吖啶标记的信号扩增微粒的存储缓冲剂(10\n微粒/mL)\n3 阴性对照 含有12.5mg/L庆大霉素的无菌人血浆\n4 阳性对照 含有12.5mg/L庆大霉素和掺杂灭活细菌的人血\n浆\n5 冲洗缓冲液 含有0.01％吐温20(Tween20)的磷酸盐缓冲液\n(PBS)\n6 检测缓冲液A 0.4N氢氧化钠\n7 检测缓冲液B 0.1N盐酸中含有1％过氧化氢\n[0106] 实施例9\n[0107] 细菌检测试剂盒的反应条件优化\n[0108] 本测定是一种三明治夹心体形式的测定，如图6所示，三明治夹心体的形成是细菌通过相同的多克隆抗体同时与磁珠和吖啶标记的信号扩增微粒结合。\n[0109] (i)为了提高敏感度(即检测极限)，磁珠和微粒的浓度需要足够高，而且/或者培养时间需要足够长，这样才能保证检测所需的量的复合体65的形成。由于这种检测是一个快速检测，培育养时间最好不超过20分钟。在此对培养时间为10、15或者20分钟的检测进行评估。另一个影响检测极限的可变因素是样本的体积和制备，通常情况(95％置信度)下，检测极限是指每mL溶液中可稳定检测到的细菌数目。然而，设计该检测的另一个目标是尽量简单化，包括尽可能少的样本制备或者无需样本制备。所以，该实验中采用了从存储基质中直接得到的1.0mL血小板。为了达到优化目的，将每毫升含5000掺杂的细菌的人类血浆(比如对照阳性试验)作为最佳样本。抗体和细菌的制备已在例1中阐明。\n[0110] 初期试验中，与信号扩增微粒和分离微粒相连的抗体浓度，以及试验过程中形成这两种偶联物的比例的评估可以采用10分钟培养时间和1.0mL无需进一步制备的阳性样本。这两种偶联物比率可由信截比的最高值确定。表2所示为初期试验中两种偶联物的组合。\n[0111] 表2\n[0112] 偶联物浓度的最佳化\n[0113] \n编 样本 抗体-磁珠偶 抗体-寡核苷酸/ RLU S/CO\n联物(分离微 吖啶微粒偶联物 (相对\n号\n粒) (信号扩增微粒) 光单位)\n1n 1.0-mL 106微粒 106微粒 不相关\n阴性对照\n2n 1.0-mL 106微粒 107微粒 不相关\n阴性对照\n3n 1.0-mL 106微粒 108微粒 不相关\n阴性对照\n4n 1.0-mL 107微粒 106微粒 不相关\n阴性对照\n5n 1.0-mL 107微粒 107微粒 不相关\n阴性对照\n6n 1.0-mL 107微粒 108微粒 不相关\n阴性对照\n7n 1.0-mL 108微粒 106微粒 不相关\n阴性对照\n8n 1.0-mL 108微粒 107微粒 不相关\n阴性对照\n9n 1.0-mL 108微粒 108微粒 不相关\n阴性对照\n1p 1.0mL 106微粒 106微粒\n阳性对照\n2p 1.0mL 106微粒 107微粒\n阳性对照\n3p 1.0mL 106微粒 108微粒\n阳性对照\n4p 1.0mL 107微粒 106微粒\n阳性对照\n编 样本 抗体-磁珠偶 抗体-寡核苷酸/ RLU S/CO\n联物(分离微 吖啶微粒偶联物 (相对\n号\n粒) (信号扩增微粒) 光单位)\n5p 1.0mL 107微粒 107微粒\n阳性对照\n6p 1.0mL 107微粒 108微粒\n阳性对照\n7p 1.0mL 108微粒 106微粒\n阳性对照\n8p 1.0mL 108微粒 107微粒\n阳性对照\n9p 1.0mL 108微粒 108微粒\n阳性对照\n10p 1.0mL 108微粒 无\n阳性对照\n11p 1.0mL 无 108微粒\n阳性对照\n[0114] 信截比(S/CO)为阳性对照得到的RLU值除以阴性对照在同样条件下得到的RLU值。微粒的数目是根据提供商提供的数据和设定的85％的反应回收率决定的，或通过其他方法如应用流式细胞计来测量。\n[0115] (ii)初期优化方案。该方案可用于表2中所示的偶联物优化。\n[0116] (a)设备：磁铁，反应试管(75x12mm玻璃光面的试管或者其他大小相似的透明试管)，试剂盒如例8表1中所示。\n[0117] (b)取20个反应试管，如表2所示对其进行标记。按表2所示加入一定量的磁珠偶联物和吖啶偶联物。\n[0118] (c)向10p-20p试管中加入1.0mL阳性对照样本；向1n-9n试管中加入1.0mL阴性对照样本。混合后将其置于室温下培育，并且每10分钟一次轻微振荡。\n[0119] (d)将试管移至磁铁附近，等待2分钟直至所有的磁珠都吸附到试管壁上。\n[0120] (e)将所有溶液从试管中倒出。用Kimwipe试纸或者其他吸附试纸贴近试管口除去最后一滴溶液。\n[0121] (f)再将试管置于磁铁上，加入5mL冲洗缓冲液后重复(d)和(e)。然后再重复一次。\n[0122] (g)用光度计测量RLU，将结果记录在表2中。\n[0123] (h)计算每种偶联物的S/CO值。\n[0124] 这个程序可以优化两种偶联物之间的组合。使用一个类似的程序则可以优化抗体与信号扩增微粒上的信号分子的结合。在该程序中，每组中分离微粒与信号扩增微粒之间的比是固定的，但是抗体偶联物与信号分子偶联物之间的比是可变的。所以可能需要对此试验重复2次或更多，从而确保检验结果的可重复性。\n[0125] 该试验中可采用含有两个进样器的光度计。\n[0126] (iii)偶联物浓度的进一步优化。虽然每个偶联物只有三个浓度级，但是每个浓度级之间相差10倍。因此我们仍然可以对“最佳”浓度进行深一步地优化。如果有一种以上的偶联物组合出现同样高的S/CO值，那就表明没有最佳组合。在这种情况下，最高浓度的偶联物需要进一步优化。\n[0127] (iv)样本数量和制备的优化(可选择的)。如果没有一种偶联物组合出现相对较高的S/CO值(比如＜2.0)，那就表明细菌浓度太低。因此为了提高细菌浓度，要将1.0mL样本溶液在微型离心机(Microfuge)中6,000rpm离心5分钟使细菌沉淀。除去0.9mL上悬液，并且将细菌沉淀置于剩余溶液中。这一步大约可提高10倍浓度，使检测极限发生显著改变。尽管这步在程序上需要花费5分钟，但是可以将培养时间减少到少于10分钟。如果在制备过程中对样本溶液进行离心，那么可以用多于1mL的样本溶液。\n[0128] (v)培育时间的优化。在一个给定的试验中，在至少为15分钟、20分钟或者最长培养时间的基础上再逐次增加5分钟。通常，增长培养时间可以提高分析物结合，直至系统达到分析物结合分子亲合常数的平衡点。\n[0129] (vi)背景RLU(阴性对照试验)的优化。因为信号分子与信号扩增微粒直接连接后比较容易清除，因此背景RLU非常低。但是，由于程序中的两个“洗涤”的步骤实际上都是“清水”冲洗，因此不可能完全清除未结合微粒，所以背景RLU仍然存在。如果出现背景RLU较高的情况，(比如高出不含吖啶标记微粒的RLU好几倍)，那么应该增加洗涤次数。在程序上可能又要花费5分钟时间。另一方面，如果背景RLU与不含吖啶标记微粒对照液的RLU相似，那就表明“清水”冲洗在清除未结合微粒上是非常有效的。程序上每减少一次“清水”冲洗，就可以节省3-4分钟。最好是只使用一次“清洗”冲洗。\n[0130] (vii)另一种组成方式。可以将一个试剂盒简化到只含有信号扩增微粒11和分离微粒73。这种试剂盒的组成能否存在主要取决于它是否具有长期稳定性，可以根据反复阳性对照试验所得结果对其长期稳定性进行评估。\n[0131] (viii)重现性研究——截止点的设定和检测极限的确定。一旦试验优化后得到了最大的S/CO，就可以通过重现性研究中所得数据对有关±S/CO值设定和检测极限测定的试验的变异性进行评估。\n[0132] (ix)方案。每个试验每隔五天进行一次，不需要连续进行。每天使用一包血小板。\n先倒出一部分血小板进行平面培养，以确保无细菌污染。然后倒出50mL血小板作为阴性对照样本。再倒出5x15mL(60mL)血小板分别置于五个消毒试管中，然后进行细菌掺杂，分别制成浓度为1000、2000、4000、6000和8000的阳性对照样本。每天对40个阴性样本和10个阳性样本进行平行测定。为了增加操作次数，可以每天将平行测定分成若干次进行。比如，每次对8个阴性样本和2个阳性样本进行平行测定，每天进行五次。记录每次测定所得RLU值。当完成研究时将会得到200个阴性样本测试结果和50个阳性样本测试结果。\n[0133] 阴性对照试验中RLU的平均值和标准方差由这200份测试结果计算所得。根据所需特异性而对阴性(或者阳性)截点RLU进行设定。如图13所示，如果将截点RLU的标准方差设定为3，那么试验的特异性就高达99％。将截点RLU作为分母，样本RLU作为分子，两者相除即可得到样本的S/CO(信号/截点比)。因此，如果S/CO等于或者大于1.0，那么样本就为阳性。\n[0134] (xi)检测极限的估测。一旦阳性S/CO被设定(比如：＝1.0)，那么我们就可以判断细菌样本测试是否为阳性，并且计算出每个细菌浓度级中阳性结果的百分率。在这里，值得推荐的是使用Finney，D.J.(1971)的“Probitmodeling”统计法(Probit Analysis，Third Edition，London：CambridgeUniversity Press)，利用每个细菌浓度级的阳性率对检测极限进行评估。Probit分析的程序软件可以由SAS Institute公司(Cary，NC)提供。\n如图14所示，检测极限取决于95％样本测定为阳性的细菌浓度级。\n[0135] (xii)血小板中细菌生长的检测。用5000个细菌(E.coli，M15)对1单位新鲜配置的血小板进行掺杂。为了使没有其他种株的细菌在血小板中生长，加入卡那霉素使其浓度为25微克/mL。每12小时倒出4mL血小板，其中1mL血小板用于平板培养从而测定细菌浓度，另外2mL按方案优化后进行平行测定。该研究是对相似条件下细菌生长试验的评估。\n[0136] 实施例10\n[0137] HIV病毒检验中微粒信号扩增技术的使用\n[0138] 如图10所示，此项发明可用于对核酸定量或者定性检测中。在此是对一例对HIV-1病毒定量测定方法的描述，也就是对样本中病毒浓度的测定。\n[0139] 寡核苷酸序列的选择和合成：试验至少需要有1对、2对、3对或者4对寡核苷酸，这些寡核苷酸的所有序列或者部分序列与HIV-1中高度保守区的序列互补。挑选保守区序列的方法目前已很成熟，在此不复详述。每对寡核苷酸最好(但非必须)与病毒染色体中同一区域的不同序列互补。其中一个寡核苷酸与分离微粒73相连，而另一个寡核苷酸与信号扩增微粒11相连。它们之间可以通过直接连接，如图3A，也可以借用第三分子间接连接，如图3B和3C。\n[0140] 因此，在设计四对寡核苷酸时，分离微粒73和信号扩增微粒11将都与这每对寡核苷酸中的一个相连。寡核苷酸序列需要足够长，以保证DNA/RNA混合物最少具有40度或者\n50度或者60度的熔点。寡核苷酸上的3’或者5’末端在合成时被衍生为功能团(比如伯胺)。如图10中所示，信号扩增微粒11含有两个额外的寡核苷酸，即信号分子31和第一连接基团26，其中第一连接基团26的寡核苷酸序列与信号分子31中结合区32的序列互补。\n信号分子31和第一连接基团26的制备在例2和例3中已阐述。\n[0141] 寡核苷酸和微粒的连接：寡核苷酸分别与微粒10和60相连形成信号扩增微粒11和分离微粒73。一种将寡核苷酸与微粒进行连接的方法已在例4中说明，这种方法也可以用于HIV-1试验中。第一连接寡核苷酸26和与病毒基因互补的特异寡核苷酸之间的摩尔比应该根据经验确定，但是开始时可采用1∶4的比例。病毒特异寡核苷酸的摩尔数最好与微粒10和60连接基团的摩尔数相等。一旦病毒特异寡核苷酸与微粒60相连，微粒将变\n9\n成功能性分离微粒73，以10 微粒/mL的浓度悬浮于保存缓冲液中。\n[0142] 如例7所示，通常情况下，特定信号扩增微粒11的合成需要通过信号分子31杂交来完成。更具体的，将以下几种成分置于42℃环境中预热5分钟：200mg表面连有5mL寡核苷酸的微粒，2.0摩尔吖啶标记的寡核苷酸C(5mL)和10mL 2X杂交缓冲液(40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0，1.0M氯化钠)。然后将这些成分混合，置于42℃已预热的杂交箱中培养2小时。再将其至于阴暗室温下旋转培养5小时。收集微粒用PBS缓冲液离心或者\n9\n超滤冲洗4次，最后将微粒悬浮于存储缓冲液中(10 微粒/mL)。\n[0143] 样本的制备：临床上最好使用人类血浆作为样本，这些收集到的个体血浆含有抗血凝剂(比如肝素和EDTA)用于对HIV-1病毒含量检测的试验。首先通过低速离心(例如\n3000g/10分钟)除去红细胞、白细胞以及其他类似微粒，所得血液即可用于病毒含量测定中。样本中使用的核糖核酸(RNA)最好是首次从血液提取到的核糖核酸。从临床样本中提取RNA的方法都是常规成熟技术，在此不复详述。另外也可以通过商业途径获取RNA提取液，比如从Invitrogen，San Diego，CA。RNA提取液然后放入100微升TE缓冲液中(10mM T三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0，0.5mM EDTA)。\n[0144] 试验方案：向100微升RNA样本中加入300微升2X杂交缓冲液，100微升分离微粒和100微升信号扩增微粒。将其置于42度环境下轻微振荡培养3小时。将反应液倒入\n12x75mm试管中，然后将试管移近磁铁。等分离微粒吸附到试管壁以后(大约2-3分钟)，倒出水溶液。用2mL PBS缓冲液将微粒冲洗4次。将微粒悬浮到100微升PBS缓冲液中。\n加入0.1N盐酸(含300微升1％过氧化氢)和0.4N氢氧化钠以后测量发光强度。样本中病毒RNA浓度可以通过预先测定或者同步测定的线形曲线来完成。\n[0145] 试验优化：可进行优化的试验条件包括但不仅仅限于，分离微粒和信号扩增微粒的数目、信号扩增微粒中吖啶标记强度、杂交环境(比如含盐浓度、持续时间和温度)以及循环冲洗次数。一种对分离微粒和信号扩增微粒相对数目的优化方法已经在例9中说明，这个方法也可用于对HIV病毒含量测定的试验中。之所以对定量测定中吖啶标记的强度进行最佳化，是因为最佳强度可以使试验的线形范围扩大。因此，在线性研究中通过对吖啶标记强度的最佳化，可以得到一个理想的线形范围(例如100-50,000HIV-1RNA拷贝/mL)。最佳杂交状态是指在最短的时间内的有效杂交。最佳循环冲洗次数是指通过最少次数的冲洗即可得到最低的背景。\n[0146] 标准曲线的建立：在定量测定中，通常每次对已知递增浓度(比如从0-50,000拷贝/mL)、含HIV-1病毒RNA的样本进行测定后都建立一条标准曲线。由于试验中RLU发光量与病毒浓度之间为回归关系，因此可以产生一条线性曲线。利用线性曲线可以计算出样本中HIV-1RNA的浓度。\n[0147] 另一种在试验中建立标准曲线的方法是指在不同的环境中(比如不同实验室和试剂批号组)对大量标准样品进行测试，而不是针对某一次特定检测。为了控制检测的变异性，在每次特定检测时可能要对含有已知HIV-1RNA浓度的标定物(例如三个)进行检测，从而校准每个标准曲线。\n[0148] 试验操作评定：几个试验标志性的重要指数可以具有概括性。它们包括(但不仅限于)：线性范围(最低和最高定量界限)、线性和准确性。用于评估线形性和准确性的方法在技术上已经广为人知，比如NCCLS指导文献中描述的方法，这些方法也可以用于对该试验评估。