烟草专用微生物肥及其制备方法

1.一种烟草专用微生物肥，其特征在于，由复合菌剂5-25重量份和载体75-95重量份组成；
所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.6-8亿cfu/g、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)1.6-8亿cfu/g、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)0.4-2.0亿cfu/g和刺孢吸水链霉菌(Streptomyces hygrospinosus)0.4-2.0亿cfu/g组成；所述载体为菜籽饼、豆粕饼和芝麻饼经过微生物发酵、腐熟后，干燥过筛后的粉状物；
用于发酵菜籽饼、豆粕饼和芝麻饼的微生物由枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、哈茨木霉和地衣芽孢杆菌组成，四种微生物的活菌数比为4:1:0.5:4。
2.根据权利要求1所述的微生物肥，其特征在于，由复合菌剂10-20重量份和载体
80-90重量份组成；
所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌1.6-6.4亿cfu/g、地衣芽孢杆菌1.6-6.4亿cfu/g、哈茨木霉0.4-1.6亿cfu/g和刺孢吸水链霉菌0.4-1.6亿cfu/g组成。
3.根据权利要求1所述的微生物肥，其特征在于，由复合菌剂15重量份和载体85重量份组成；
所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌4.8亿cfu/g、地衣芽孢杆菌4.8亿cfu/g、哈茨木霉1.2亿cfu/g和刺孢吸水链霉菌1.2亿cfu/g组成。
4.根据权利要求1所述的微生物肥，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 10118、地衣芽孢杆菌的保藏编号为ACCC 10613、哈茨木霉的保藏编号为ACCC
31707、刺孢吸水链霉菌的保藏编号为ACCC 40018。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微生物肥，其特征在于，所述微生物肥为粉剂。
6.权利要求1-5任一项所述微生物肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)复合菌剂的制备
I.芽孢杆菌混合孢子粉的制备：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液按等重量比混合，经过浓缩干燥制备成芽孢杆菌混合孢子粉；
II.哈茨木霉孢子粉的制备：将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉；
III.刺孢吸水链霉菌菌粉的制备：将刺孢吸水链霉菌原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，经过浓缩干燥制备成刺孢吸水链霉菌菌粉；
IV.将上述制得的芽孢杆菌混合孢子粉、哈茨木霉孢子粉、刺孢吸水链霉菌菌粉按比例混合，即得复合菌剂；
(2)载体的制备
将菜籽饼、豆粕饼、芝麻饼和发酵专用复合菌剂按8:8:8:1的重量比混匀，调节水分至
50％-60％，堆高1.0-1.5米，堆沤40-60天；
发酵初始时覆盖薄膜，待发酵堆中心温度在50℃以上时撤去薄膜，当发酵堆中心温度超过65℃时用翻堆机翻堆，发酵前25天适当补水，使得发酵堆水分维持在50％-60％；如此反复操作，待发酵堆颜色变咖啡色或黑色，同时发酵堆温度降至40℃，水含量在30％以下结束发酵，将发酵好的饼肥干燥、粉碎、过筛，即得载体；其中，发酵专用复合菌剂中含有枯草芽孢杆菌4亿cfu/g、酿酒酵母1亿cfu/g、哈茨木霉0.5cfu亿/g和地衣芽孢杆菌4亿cfu/g；
(3)烟草专用微生物肥的制备：按比例称取复合菌剂和载体，混匀后即得烟草专用微生物肥。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中I、II、III具体为：
I.芽孢杆菌混合孢子粉的制备：
a.斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养36-48小时；
b.摇床培养：将步骤a培养的菌种在无菌条件下分别接种于种子培养基中，在pH6.5-7.0、30℃条件下，140-160r/min摇床培养12-18小时；
c.发酵罐培养：将步骤b培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基中，在
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pH7.5-8.0、罐压0.5kg、30℃条件下，培养48-56小时后，活菌数大于1.0×10cfu/mL，80％菌体成为芽孢时下罐，得到发酵液；
d.将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合，经过浓缩干燥制备成芽孢杆菌混合孢子粉；
其中，步骤a中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、琼脂15g和水1000mL；步骤b中使用的种子培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、KH2PO40.5g、MgSO40.2g和水1000mL；步骤c中使用的液体发酵培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨
1.7kg和消泡剂50mL，加水至600L；
II.哈茨木霉孢子粉的制备：
e.将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养48小时；
f.摇床培养：将步骤e培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在pH6.5-6.8、
30℃条件下，160-200r/min摇床培养24小时；
g.发酵罐培养：将步骤f培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、27-28℃，在培养48小时后，菌丝体占总体积的20％时终止发酵，进行固体发酵产孢；
h..固体发酵产孢：将步骤g经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养144-168小时，待哈茨木霉90％产孢时停止发酵；
i.将步骤h中完全产孢的发酵物料浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液；
j.将上述步骤i中得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制成孢子粉；
其中，步骤e中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g和水
1000mL，pH自然；步骤f中使用的种子培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g和水1000mL；步骤g中使用的液体发酵培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、消泡剂50mL，加水至600L；步骤h中的固体发酵培养基配方如下：棉籽壳、玉米粉和麸皮按5:2:13重量比混合组成的固体料中加入水，即得固体发酵培养基，固体料与水的重量比为1:0.6；
III.刺孢吸水链霉菌菌粉的制备：
k.在无菌条件下，将刺孢吸水链霉菌菌种接种于斜面培养基上，于28℃下培养5-6天；
l.摇床培养：将步骤k培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在28℃条件下，
220r/min摇床培养24小时；
m.发酵罐培养：在无菌条件下，将步骤l培养的菌种接入液体发酵培养基中，在初始pH7.5、罐压0.5kg、28℃，培养48小时后，放罐收集发酵液，经浓缩干燥后制得孢子粉；
其中，步骤k中使用的斜面培养基的配方如下：可溶性淀粉20g、KNO3 1g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.1g、琼脂粉18g和蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4；步骤l、m中使用的培养基配方如下：玉米淀粉20g、豆粉10g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g、(NH4)2SO4 5g、CaCO3 3g、消泡剂0.5g和蒸馏水1000mL，pH7.5。
8.权利要求1-5任一项所述微生物肥在烟草种植中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，作为基肥施用，每亩用量10-100kg。

烟草专用微生物肥及其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及农用肥领域，具体地说，涉及一种烟草专用微生物肥及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 农业是国民经济的基础产业，农业的发展关系到国民经济的全局。同时，农业生产周期性长，受客观环境的影响比较大，因此国家对农业的发展非常重视，对从事农业科技研究、开发、生产经营等单位的审批往往要经历一个较长过程。湖南泰谷生物科技股份有限公司在正式成立农用微生物研究院之前，就已经开始从事相关农用微生物方面的研发工作。\n[0003] 湖南是全国烟叶生产大省，高附加值农业是湖南最重要的农业发展方向。长期以来，由于农业生产中大量使用化肥、化学农药及杀菌剂等化学物质，使得土壤结构不断遭到破坏，土壤有机质得不到补充，土壤微生态环境失去平衡，从而使土壤板结严重，保水能力大大降低，土壤病原微生物大量繁殖，特别是烟草种植业受到特定的地理条件和种植制度的限制以及单一计划市场的制约，长期连茬种植，病、虫危害严重，烟叶品质下降，烟农不得不加大用肥用药量，由此形成恶性循环。食用了含有大量有害物质的农产品，给人们的健康带来严重地危害。因此，如何充分利用高科技手段，生产和应用高效生物有机肥、高效生物菌剂和高效生物农药，对于增进人民身体健康，促进社会发展进步显得尤为重要。\n发明内容\n[0004] 本发明的目的是提供一种能够有效防止烟草生长中病害滋生，减少农药和化肥施用、且促进烟草的生长和品质提高的新型烟草专用微生物肥。\n[0005] 本发明的另一目的是提供所述微生物肥的制备方法及应用。\n[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种烟草专用微生物肥由复合菌剂5-25重量份和载体75-95重量份组成。所述复合菌剂中含有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）\n1.6-8亿cfu/g、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）1.6-8亿cfu/g、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）0.4-2.0亿 cfu/g和 刺 孢 吸 水 链 霉 菌（Streptomyces hygrospinosus）0.4-2.0亿cfu/g；所述载体为菜籽饼、豆粕饼和芝麻饼经过微生物发酵、腐熟后，干燥过筛后的粉状物。\n[0007] 优选地，所述微生物肥由复合菌剂10-20重量份和载体80-90重量份组成。所述复合菌剂中含有枯草芽孢杆菌1.6-6.4亿cfu/g、地衣芽孢杆菌1.6-6.4亿cfu/g、哈茨木霉0.4-1.6亿cfu/g和刺孢吸水链霉菌0.4-1.6亿cfu/g。\n[0008] 更优选地，所述微生物肥由复合菌剂15重量份和载体85重量份组成。所述复合菌剂中含有枯草芽孢杆菌约4.8亿cfu/g、地衣芽孢杆菌约4.8亿cfu/g、哈茨木霉约1.2亿cfu/g和刺孢吸水链霉菌约1.2亿cfu/g。\n[0009] 前述的微生物肥，用于发酵菜籽饼、豆粕饼和芝麻饼的微生物包括枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、哈茨木霉和地衣芽孢杆菌，四种微生物的活菌数比为4:1:0.5:4。\n[0010] 前述的微生物肥，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为ACCC10118、地衣芽孢杆菌的保藏编号为ACCC10613、哈茨木霉的保藏编号为ACCC31707、刺孢吸水链霉菌的保藏编号为ACCC40018。\n[0011] ACCC代表中国农业微生物菌种保藏管理中心。\n[0012] 本发明提供的烟草专用微生物肥为粉剂。\n[0013] 本发明还提供所述微生物肥的制备方法，包括如下步骤：\n[0014] （1）复合菌剂的制备\n[0015] I.芽孢杆菌混合孢子粉的制备：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，将得到的发酵液按等重量比混合，经过浓缩干燥制备成芽孢杆菌混合孢子粉；\n[0016] II.哈茨木霉孢子粉的制备：将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养、固体发酵产孢后，将得到的完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液，然后将得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制备成哈茨木霉孢子粉；\n[0017] III.刺孢吸水链霉菌菌粉的制备：将刺孢吸水链霉菌原始菌种在无菌条件下分别依次进行斜面培养、摇床培养、发酵罐培养后，经过浓缩干燥制备成刺孢吸水链霉菌菌粉；\n[0018] IV.将上述制得的芽孢杆菌混合孢子粉、哈茨木霉孢子粉、刺孢吸水链霉菌菌粉按比例混合，即得复合菌剂；\n[0019] （2）载体的制备\n[0020] 将菜籽饼、豆粕饼、芝麻饼和发酵专用复合菌剂按8:8:8:1的重量比混匀，调节水分至50%-60%，堆高1.0-1.5米，堆沤40-60天；\n[0021] 发酵初始时覆盖薄膜，待发酵堆中心温度在50℃以上时撤去薄膜，当发酵堆中心温度超过65℃时用翻堆机翻堆，发酵前25天适当补水，使得发酵堆水分维持在50%-60%；如此反复操作，待发酵堆颜色变咖啡色或黑色，同时发酵堆温度降至40℃，水含量在30%以下结束发酵，将发酵好的饼肥干燥、粉碎、过筛，即得载体；其中，发酵专用复合菌剂中含有枯草芽孢杆菌约4亿cfu/g、酿酒酵母约1亿cfu/g、哈茨木霉约0.5cfu亿/g和地衣芽孢杆菌约4亿cfu/g；\n[0022] （3）烟草专用微生物肥的制备：按比例称取复合菌剂和载体，混匀后即得烟草专用微生物肥。\n[0023] 具体地，上述步骤I、II、III为：\n[0024] I.芽孢杆菌混合孢子粉的制备：\n[0025] a.斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养36-48小时；\n[0026] b.摇床培养：将步骤a培养的菌种在无菌条件下分别接种于种子培养基中，在pH6.5-7.0、30℃条件下，140-160r/min摇床培养12-18小时；\n[0027] c.发酵罐培养：将步骤b培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基中，在pH7.5-8.0、罐压0.5kg、30℃、通风量1:0.8-1.1条件下，培养48-56小时后，活菌数\n9\n大于1.0×10cfu/mL，80%菌体成为芽孢时下罐，得到发酵液；\n[0028] d.将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合，经过浓缩干燥制备成芽孢杆菌混合孢子粉。\n[0029] 其中，步骤a中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏\n5g、琼脂15g和水1000mL；步骤b中使用的种子培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、KH2PO40.5g、MgSO40.2g和水1000mL；步骤c中使用的液体发酵培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg和消泡剂50mL，加水至600L。\n[0030] II.哈茨木霉孢子粉的制备：\n[0031] e.将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养48小时；\n[0032] f.摇床培养：将步骤e培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在pH6.5-6.8、30℃条件下，160-200r/min摇床培养约24小时；\n[0033] g.发酵罐培养：将步骤f培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、27-28℃、通风量为1:0.6-0.8，在培养约48小时后，菌丝体占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；\n[0034] h..固体发酵产孢：将步骤g经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养144-168小时，待哈茨木霉90%产孢时停止发酵；\n[0035] i.将步骤h中完全产孢的发酵物料浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液；\n[0036] j.将上述步骤i中得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制成孢子粉。\n[0037] 其中，步骤e中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g和水1000mL，pH自然；步骤f中使用的种子培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉\n20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g和水1000mL；步骤g中使用的液体发酵培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁\n0.12kg、氯化钠0.12kg、消泡剂50mL，加水至600L；步骤h中的固体发酵培养基配方如下：\n棉籽壳、玉米粉和麸皮按5:2:13重量比混合组成的固体料中加入水，即得固体发酵培养基，固体料与水的重量比为1:0.6。\n[0038] III.刺孢吸水链霉菌菌粉的制备：\n[0039] k.在无菌条件下，将刺孢吸水链霉菌菌种接种于斜面培养基上，于28℃下培养\n5-6天；\n[0040] l.摇床培养：将步骤k培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在28℃条件下，220r/min摇床培养约24小时；\n[0041] m.发酵罐培养：在无菌条件下，将步骤l培养的菌种接入液体发酵培养基中，在初始pH7.5、罐压0.5kg、28℃、通风量1:0.5-1，培养48小时后，放罐收集发酵液，经浓缩干燥后制得孢子粉。\n[0042] 其中，步骤k中使用的斜面培养基的配方如下：可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl0.5g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO40.1g、琼脂粉18g和蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4；步骤l、m中使用的培养基配方如下：玉米淀粉20g、豆粉10g、NaCl0.5g、K2HPO40.5g、（NH4)2SO45g、CaCO33g、消泡剂0.5g和蒸馏水1000mL，pH7.5。\n[0043] 本发明还提供所述微生物肥在烟草种植中的应用。\n[0044] 施用方法：\n[0045] ①可作为专用基肥，每亩用量50-100kg；也可作为辅助基肥，配合烟草公司指定基肥使用，每亩用量10-20kg，可沟施、穴施、地面撒施；\n[0046] ②特别适宜作基肥；\n[0047] ③施用本品后要及时灌水，肥效更佳；\n[0048] ④施用本品后要及时覆土或耕地，勿使本品暴露于阳光下；\n[0049] ⑤严禁与杀菌剂直接混合使用；\n[0050] ⑥存放于阴凉干燥处。\n[0051] 所述烟草专用微生物肥具有吸水保湿，增加土壤肥力，协助农作物吸收营养，提高烟株防病抗逆能力，减少烟草花叶病、赤星病、黑胫病等病害发生，显著提高烟叶品质和产量。\n[0052] 本发明具有以下优点：\n[0053] （一）本发明的烟草专用微生物肥中，微生物种类搭配合理，哈茨木霉和刺孢吸水链霉菌组合能抑制真菌性致病菌，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混配能在烟草根部繁殖形成优势菌落抑制病原体的繁殖，能很好地改善连茬种植引起的土壤环境恶化的情况。这四种微生物还能产特异性的酶和游离氨基酸，烟草吸收后能显著提升烟的香味和品质。另外，本发明采用了发酵腐熟后的菜籽饼、豆粕饼、芝麻饼为主要载体，对废弃物进行了回收及有效利用，能产生很好的经济效益，通过微生物发酵腐熟后的三粕混合物能释放出可供烟草吸收的氮、磷、钾，作为基肥施用能保证烟草生长的所需营养物质，长期使用能很好地改善土壤品质。\n[0054] （二）本发明的有效菌制备方法先进科学，简便可行，孢子数含量高，存活时间长，能在土壤中快速繁殖，形成优势菌落，促进烟草的健康生长。\n[0055] （三）本发明的烟草专用微生物肥在田间的应用效果好。通过烟草田间种植应用试验，结果表明：使用本品的烟草植株各农艺性状表现较对照组好；亩产量比常规施肥方法高出14.19%，亩产值比常规施肥方法高出15.05%；在防治烟草病害方面表现突出，使用本品，植株发病非常少，尤其在土传病害的防治方面表现更佳；施用本品的上等烟比例比常规施肥法高，烘烤出来的烟成色比对照组的要鲜艳，香味也更浓郁。\n具体实施方式\n[0056] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。\n[0057] 实施例1烟草专用微生物肥及其制备方法\n[0058] 烟草专用微生物肥含以下重量份计的原料：\n[0059] 复合菌剂 15份；\n[0060] 载体 85份。\n[0061] 所述复合菌剂中有效活菌总含量为10亿cfu/g，构成如下：\n[0062] \n[0063] 上述烟草专用微生物肥的制备方法，包括如下步骤：\n[0064] （1）复合菌剂的制备\n[0065] I.芽孢杆菌混合孢子粉的制备：\n[0066] a.斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养48小时；\n[0067] b.摇床培养：将步骤a培养的菌种在无菌条件下分别接种于种子培养基中，在pH7.0、30℃条件下，160r/min摇床培养18小时；\n[0068] c.发酵罐培养：将步骤b培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基中，在pH8.0、罐压0.5kg、30℃、通风量1:1.1条件下，培养48-56小时后，活菌数大于\n9\n1.0×10cfu/mL，80%菌体成为芽孢时下罐，得到发酵液；\n[0069] d.将步骤c中得到的发酵液按等重量比混合，经过浓缩干燥制备成芽孢杆菌混合孢子粉。\n[0070] 其中，步骤a中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏\n5g、琼脂15g和水1000mL；步骤b中使用的种子培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、KH2PO40.5g、MgSO40.2g和水1000mL；步骤c中使用的液体发酵培养基配方如下：玉米粉26kg、豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg和消泡剂50mL，加水至600L。\n[0071] II.哈茨木霉孢子粉的制备：\n[0072] e.将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养48小时；\n[0073] f.摇床培养：将步骤e培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在pH6.8、\n30℃条件下，200r/min摇床培养约24小时；\n[0074] g.发酵罐培养：将步骤f培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体发酵培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、27-28℃、通风量为1:0.6-0.8，在培养约48小时后，菌丝体占总体积的20%时终止发酵，进行固体发酵产孢；\n[0075] h..固体发酵产孢：将步骤g经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养168小时，待哈茨木霉90%产孢时停止发酵；\n[0076] i.将步骤h中完全产孢的发酵物料浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液；\n[0077] j.将上述步骤i中得到的哈茨木霉孢子悬浮液浓缩干燥制成孢子粉。\n[0078] 其中，步骤e中使用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g和水1000mL，pH自然；步骤f中使用的种子培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、淀粉\n20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g和水1000mL；步骤g中使用的液体发酵培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁\n0.12kg、氯化钠0.12kg、消泡剂50mL，加水至600L；步骤h中的固体发酵培养基配方如下：\n棉籽壳、玉米粉和麸皮按5:2:13重量比混合组成的固体料中加入水，即得固体发酵培养基，固体料与水的重量比为1:0.6。\n[0079] III.刺孢吸水链霉菌菌粉的制备：\n[0080] k.在无菌条件下，将刺孢吸水链霉菌菌种接种于斜面培养基上，于28℃下培养\n5-6天；\n[0081] l.摇床培养：将步骤k培养的菌种在无菌条件下接种于种子培养基中，在28℃条件下，220r/min摇床培养约24小时；\n[0082] m.发酵罐培养：在无菌条件下，将步骤l培养的菌种接入液体发酵培养基中，在初始pH7.5、罐压0.5kg、28℃、通风量1:1，培养48小时后，放罐收集发酵液，经浓缩干燥后制得孢子粉。\n[0083] 其中，步骤k中使用的斜面培养基的配方如下：可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl0.5g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO40.1g、琼脂粉18g和蒸馏水1000mL，pH7.4；步骤l、m中使用的培养基配方如下：玉米淀粉20g、豆粉10g、NaCl0.5g、K2HPO40.5g、（NH4)2SO45g、CaCO33g、消泡剂0.5g和蒸馏水1000mL，pH7.5。\n[0084] IV.将上述制得的芽孢杆菌混合孢子粉、哈茨木霉孢子粉、刺孢吸水链霉菌菌粉按比例混合，即得复合菌剂。\n[0085] （2）载体的制备\n[0086] 将菜籽饼、豆粕饼、芝麻饼和发酵专用复合菌剂按8:8:8:1的重量比混匀，调节水分至60%，堆高1.2米，堆沤60天。\n[0087] 发酵初始时覆盖薄膜，待发酵堆中心温度在50℃以上时撤去薄膜，当发酵堆中心温度超过65℃时用翻堆机翻堆，发酵前25天适当补水，使得发酵堆水分维持在60%；如此反复操作，待发酵堆颜色变咖啡色或黑色，同时发酵堆温度降至40℃，水含量在30%以下结束发酵，将发酵好的饼肥干燥、粉碎、过筛，即得载体；其中，发酵专用复合菌剂中含有枯草芽孢杆菌约4亿cfu/g、酿酒酵母约1亿cfu/g、哈茨木霉约0.5cfu亿/g和地衣芽孢杆菌约\n4亿cfu/g。\n[0088] （3）烟草专用微生物肥的制备：按比例称取复合菌剂和载体，混匀后即得烟草专用微生物肥。\n[0089] 实施例2烟草专用微生物肥及其制备方法\n[0090] 烟草专用微生物肥含以下重量份计的原料：\n[0091] 复合菌剂 5份；\n[0092] 载体 95份。\n[0093] 所述复合菌剂中有效活菌总含量为≥4亿cfu/g，构成如下：\n[0094] \n[0095] 其余同实施例1。\n[0096] 实施例3烟草专用微生物肥及其制备方法\n[0097] 烟草专用微生物肥含以下重量份计的原料：\n[0098] 复合菌剂 25份；\n[0099] 载体 75份。\n[0100] 所述复合菌剂中有效活菌总含量为≥20亿cfu/g，构成如下：\n[0101] \n[0102] \n[0103] 其余同实施例1。\n[0104] 实施例4烟草专用微生物肥及其制备方法\n[0105] 烟草专用微生物肥含以下重量份计的原料：\n[0106] 复合菌剂 10份；\n[0107] 载体 90份。\n[0108] 所述复合菌剂中有效活菌总含量为≥4亿cfu/g，构成如下：\n[0109] \n[0110] 其余同实施例1。\n[0111] 实施例5烟草专用微生物肥的田间肥效试验\n[0112] 1.试验目的：\n[0113] 验证烟草专用微生物肥对烟草生长及品质提升的显著效果。\n[0114] 2.试验材料：\n[0115] 植株：供试烤烟品种为G80(由龙山县烟草公司提供)。\n[0116] 肥料：烟草专用微生物肥、专用基肥、专用追肥、提苗肥、硫酸钾、生物饼肥。\n[0117] 试验点：在湖南省吉首市龙山县召市镇大兴村。供试土壤主要农化特性见表1，前茬作物为水稻。\n[0118] 3.试验设计\n[0119] 3.1实验分5组，每组种植面积20m2，每个组别做3个平行实验。\n[0120] 实验组A：每组分别取实施例1中制备的烟草专用微生物肥500g加适量基肥（以烟草公司指导施加量为准）混匀做基肥施用。其他常规施肥按烟草公司指导量正常施用。\n[0121] 实验组B：每组分别取实施例1中制备的烟草专用微生物肥500g，然后再加适量基肥（以烟草公司指导施加量为准）混匀做基肥施用。其他常规施肥按烟草公司指导量的90%正常施用。\n[0122] 实验组C:每组分别取供试基质500g加适量基肥（以烟草公司指导施加量为准）混匀做基肥施用。其他常规施肥按烟草公司指导量正常施用。\n[0123] 实验组D:常规施肥，以烟草公司指导量为准。\n[0124] 实验组E:不施加任何肥料。\n[0125] A、B、C、D四组常规施肥烟草公司指导施加量为固定值，五组前茬作物一致都是水稻。烟草公司施肥指导施加量见表2。\n[0126] 3.2试验实施：\n[0127] 按3.1执行，并做好田间管理、记录、分析和计产工作。\n[0128] 3.2.1田间管理及试验记录：\n[0129] 五个组别各项处理的管理措施应一致，并进行试验记录；\n[0130] a)供试烟草的品种；\n[0131] b)注明试验地点、试验时间、方法设计、小区面积、小区排列、重复次数（采用图表的形式）；\n[0132] c)试验地地形、土壤质地、土壤类型、前茬作物种类；\n[0133] d)施肥时间、方法、数量及次数等；\n[0134] e)试验期间的降水量及灌水量；\n[0135] f)病虫害防治情况及其它农事活动等；\n[0136] g)作物的生长状况田间调查，包括移苗成活率、长势、生育期（各处理生育期情况见表3）。及病虫发生情况等。\n[0137] 3.2.2收获和计产\n[0138] a)分次收获（收获时机根据按烟草公司指导进行、烘烤条件一致）、计产，最后累加；\n[0139] b)计产时评定烟草质量，烟草质量评定由龙山县召市镇烟草站执行。\n[0140] 3.2.3作物品质、土壤肥力和抗逆性等记录\n[0141] 记录烟草专用微生物肥对烟草品质提升、土壤肥力的提升及抗病能力。\n[0142] 3.3效果评价\n[0143] 3.3.1作物农艺性状对比情况见表4。\n[0144] 3.3.2产量效果评价\n[0145] 进行烟草专微生物菌肥处理与其它各处理间的产量差异分析。增产差异显著水平的试验点数达到总数的2/3以上者，判定该产品有增产效果。产量情况见表5。\n[0146] 3.3.3品质效果评价\n[0147] 记录烟叶路黄时间、一级、二级、三级烟叶的比率，各组别做比较。分级情况见附表\n5\n[0148] 3.3.4抗逆性效果评价\n[0149] 抗逆性包括抑制病虫害发生（病情及发病率记录）、抗旱、克服连作障碍等方面。抗逆性指标比对照应提高20%以上的效果明显。病情情况见表6。\n[0150] 3.3.4土壤改良效果评价\n[0151] 测定土壤中的微生物种群与数量、有机质、速效磷、速效钾、速效氮、pH等指标。测定时间为移栽施用前、然后是每月取土壤样一次进行测定直至烟草采收结束。肥效效果见表7。\n[0152] 3.3.5安全指标评价\n[0153] 对试验作物以及土壤进行农药残留、重金属等有毒有害物质含量的测定，以评价烟草专用微生物肥对其是否具有降解和转化功能。\n[0154] 附录A（规范性附录）\n[0155] 基质无菌检验方法\n[0156] A.1取样\n[0157] 从基质样品中随机取样。\n[0158] A.2样品检验\n[0159] A.2.1培养基制备\n[0160] 分别配制NY/T1114-2006中A1、A9、A11、A13四种培养基。\n[0161] A.2.2菌悬液的制备\n[0162] 称取样品10g（精确到0.01g），加入带玻璃珠的100mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成菌悬液。\n[0163] A.2.3加样及培养\n[0164] 在预先制备好的四种固体培养基平板上分别加入0.1mL菌悬液，并用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于培养基平板表面，重复3次，于适宜温度条件下培养2d-7d。以无菌水作空白对照。\n[0165] A.2.4灭菌效果鉴定\n[0166] 空白对照无菌落出现，而其它培养平板上菌落总数≤5个，则该样品可用作基质试验。反之，须重新灭菌。空白对照有菌落出现，须重做无菌检验。\n[0167] 4.试验结果\n[0168] 试验严格按照试验方案进行，移栽后无死苗现象，成活后长势除E处理外均表现正常，烟株打顶后即从6月底开始连续两个月干旱天气，严重影响了烟株的正常生长发育，没有进行灌水。试验结果如表4-7所示，试验证明该产品能有效提高烟草亩产值，减少烟草病虫害的发生，提高烟叶品质。\n[0169] 表1供试土壤的主要农化性状\n[0170] \n[0171] 表2烟草公司施肥指导施加量\n[0172] \n[0173] 注：所有肥料除专用追肥留5公斤和提苗肥外，其余全部做底肥。剩余肥料均在适当时机全部施入烟田中。养分含量（N：P2O5：K2O）20：9：0表示N：P2O5为20：9，其中不含K2O；养分含量（N：P2O5：K2O）0：0：50表示仅含K2O。\n[0174] 表3各处理生育期表\n[0175] \n[0176] \n[0177] 表4各处理农艺性状表\n[0178] \n[0179] 表5各处理产量、分级情况及经济性状表（%）\n[0180] \n[0181] \n[0182] 注：产值按2013年正价计算。\n[0183] 表6各处理对烟草大田病害发生的影响\n[0184] \n[0185] 表7各处理土壤养分含量\n[0186]