以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法

1.以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，首先是纯化凹土，然后将益生菌菌悬液在一定的条件下吸附至凹土表面，最后真空冷冻干燥制备成益生菌制剂；其特征在于该制备方法包括以下具体步骤：
第一步，凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡20～28h，凹土与去离子水的质量比为10～20∶1，搅拌器以1000～1500rpm转速再搅拌20～28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以凹土悬液质量的5～20％的量继续加入上述去离子水，搅拌、分层同样操作重复2～3次，于105～120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目凹土细粉备用；
第二步，益生菌菌悬液的制备：将双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪链球菌或地衣芽胞杆菌由常规手段培养至对数生长期后期，收集菌
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体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，并用无菌生理盐水将菌体浓度调节至10 ～10 CFU/ml备用；
第三步，凹土吸附益生菌：10L益生菌菌悬液添加100～1000g凹土细粉构成吸附体系，调节吸附体系pH3～6、温度20～35℃，吸附20～50分钟，吸附时采用震荡法增加凹土与益生菌的接触，震荡速度为90～180rpm；
第四步，真空冷冻干燥：步骤三的吸附体系于-40～-75℃预冻2～3小时，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20～28小时，得益生菌制剂，制剂含水量≤2％，检测活菌剂中活菌
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数为10 ～10 CFU/g。
2.根据权利要求1所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：其中，双歧杆菌培养条件：培养基：蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl5g，Na2HPO42.5g，蒸馏水1000ml，pH7；35℃静置培养22小时。
3.根据权利要求1所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：其中，嗜酸乳杆菌培养条件：培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1ml，CH3COONa·3H2O 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O
0.25g，蒸馏水1000ml，调pH6.2-6.4；37℃静置培养20小时。
4.根据权利要求1或3所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：
其中，嗜热链球菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌；40℃静置培养20小时。
5.根据权利要求1或3所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：
其中，保加利亚乳杆菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。
6.根据权利要求1或3所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：
其中，鼠李糖乳杆菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌，37℃静置培养20小时。
7.根据权利要求1所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：其中，粪链球菌培养条件：培养基：蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml，pH6.8；37℃振荡培养6h，摇床转速为100rpm。
8.根据权利要求1所述的以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：其中，地衣芽胞杆菌培养条件：培养基：葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g，蒸馏水
1000ml，pH 7.0；37℃振荡培养40h，摇床转速为180rpm。

以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及益生菌制剂的制备方法，具体涉及一种以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法。\n背景技术\n[0002] 益生菌又称为益生素、利生菌、活菌剂或微生态制剂。是指能促进肠道内菌群平衡、对宿主起到有益作用的活菌制剂及其代谢产物，临床上，益生菌制剂主要用于预防和治疗各种胃肠道疾病，也可用于肝病的辅助治疗，为肝细胞的再生和修复创造良好的内环境。\n[0003] 益生菌包括双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、粪链球菌、肠球菌、明串珠菌、片球菌、蜡样芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌等。\n[0004] 益生菌的研究与运用，在日本、法国、美国、德国、俄罗斯等十多个国家研究较为专业化和系统性。目前国际上对乳酸菌等益生菌的研究显得非常活跃，产品消费成绩惊人，据粗略估计，全球的年产品生产总值约为300亿美元左右，其中使用益生菌生产的乳制品总产值超过50亿美元，且增长指数在逐年上升，呈上升发展态势。如日本利用益生菌制作的乳制品已成功打入了国际奶品饮料市场，已在13个国家建造了18家加工厂，目前全球每天至少2500万人在饮用这种产品。\n[0005] 凹土又称凹凸棒石粘土、凹凸棒土等，是以凹凸棒石(Attapulgite)为主要成分的一种粘土矿物，主要成分为坡缕石(Palygorskite)或坡缟石，是一种富镁硅酸盐，属于\n2∶1型层链状晶体结构，由于其本身独特的微观结构和性质，赋予凹土许多优良性能，如吸附性、胶体性、粘结性、催化性等，因而被广泛应用于化工、建材、医药、农业和环境保护等领域。但至今未见到利用凹土作为益生菌载体的报道。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的在于：提供一种以凹土为载体的益生菌制剂的制备方法，利用凹土吸附益生菌制备活菌制剂，提高益生菌到达肠道的存活率，并大大延长活菌的存活时间。\n[0007] 本发明的技术解决方案是：首先是纯化凹土，然后将益生菌菌悬液在一定的条件下吸附至凹土表面，最后真空冷冻干燥制备成益生菌制剂。\n[0008] 本发明的制备方法包括以下具体步骤：\n[0009] 第一步，凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水浸泡20～28h，凹土与去离子水的质量比为10～20∶1，搅拌器以1000～1500rpm转速再搅拌20～28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以凹土悬液质量的5～20％的量继续加入上述去离子水，搅拌、分层同样操作重复2～3次，于105～120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目凹土细粉备用；\n[0010] 第二步，益生菌菌悬液的制备：将双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪链球菌或地衣芽胞杆菌由常规手段培养至对数生长期后期，收集菌\n9 10\n体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，并用无菌生理盐水将菌体浓度调节至10 ～10 CFU/ml备用；\n[0011] 第三步，凹土吸附益生菌：10L益生菌菌悬液添加100～1000g凹土细粉构成吸附体系，调节吸附体系pH3～6、温度20～35℃，吸附20～50分钟，吸附时采用震荡法增加凹土与益生菌的接触，震荡速度为90～180rpm；\n[0012] 第四步，真空冷冻干燥：步骤三的吸附体系于-40～-75℃预冻2～3小时，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20～28小时，得益生菌制剂，制剂含水量≤2％，检测活菌剂中\n9 11\n活菌数为10 ～10 CFU/g。\n[0013] 其中，双歧杆菌培养条件：\n[0014] 培养基：蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HPO42.5g，蒸馏水1000ml，pH7；35℃静置培养22小时。\n[0015] 其中，嗜酸乳杆菌培养条件：\n[0016] 培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-801ml，CH3COONa·3H2O 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，调pH6.2-6.4；37℃静置培养20小时。\n[0017] 其中，嗜热链球菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌；40℃静置培养20小时。\n[0018] 其中，保加利亚乳杆菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。\n[0019] 其中，鼠李糖乳杆菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌。37℃静置培养20小时。\n[0020] 其中，粪链球菌培养条件：\n[0021] 培养基：蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml，pH6.8；37℃振荡培养6h，摇床转速为100rpm。\n[0022] 其中，地衣芽胞杆菌培养条件：\n[0023] 培养基：葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO42g，MgSO42g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；37℃振荡培养40h，摇床转速为180rpm。\n[0024] 本发明的制备方法简单，生产成本低，益生菌在肠道的存活率高，活菌的存活时间长，人体吸收效果良好。\n附图说明\n[0025] 图1是以嗜酸乳杆菌为例凹土益生菌制剂和以脱脂乳粉为保护剂的益生菌制剂在人工模拟肠环境中活菌数比较。\n具体实施方式\n[0026] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。\n[0027] 实施例1：依以下具体步骤制备益生菌制剂：\n[0028] 第一步，凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水以质量比\n10∶1浸泡28h，搅拌器以1000rpm转速再搅拌28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以凹土悬液质量的5％的量继续加入上述去离子水，搅拌、分层同样操作重复2次，于105℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目凹土细粉备用；\n[0029] 第二步，益生菌菌悬液的制备：将双歧杆菌由常规手段培养至对数生长期后期，\n9\n收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，并用无菌生理盐水将菌体浓度调节至10 ～\n10\n10 CFU/ml备用；其中，双歧杆菌培养条件：培养基：蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HPO42.5g，蒸馏水1000ml，pH7；35℃静置培养22小时；\n[0030] 第三步，凹土吸附益生菌：10L益生菌菌悬液添加100g凹土细粉构成吸附体系，调节吸附体系pH3、温度35℃，吸附20分钟，吸附时采用震荡法增加凹土与益生菌的接触，震荡速度为180rpm；\n[0031] 第四步，真空冷冻干燥：步骤三的吸附体系于-75℃预冻2小时，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20小时，得益生菌制剂，制剂含水量≤2％，检测活菌剂中活菌数为\n9\n10CFU/g。\n[0032] 实施例2：依以下具体步骤制备益生菌制剂：\n[0033] 第一步，凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水以质量比\n15∶1浸泡24h，搅拌器以1250rpm转速再搅拌24h，静置分层，取中间层凹土悬液，以凹土悬液质量的12.5％的量继续加入上述去离子水，搅拌、分层同样操作重复3次，于112℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目凹土细粉备用；\n[0034] 第二步，益生菌菌悬液的制备：将嗜酸乳杆菌由常规手段培养至对数生长期后期，\n9\n收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，并用无菌生理盐水将菌体浓度调节至10 ～\n10\n10 CFU/ml备用；其中，嗜酸乳杆菌培养条件：培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-801ml，CH3COONa·3H2O 5g，K2HPO4·3H2O2g，MgSO4·7H2O \n0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，调pH6.2-6.4；37℃静置培养20小时；\n[0035] 第三步，凹土吸附益生菌：10L益生菌菌悬液添加550g凹土细粉构成吸附体系，调节吸附体系pH4.5、温度27.5℃，吸附时间为35分钟，吸附时采用震荡法增加凹土与益生菌的接触，震荡速度为135rpm；\n[0036] 第四步，真空冷冻干燥：步骤三的吸附体系于-58℃预冻2.5小时，迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥24小时，得益生菌制剂，制剂含水量≤2％，检测活菌剂中活菌数为\n10\n10 CFU/g。\n[0037] 实施例3：依以下具体步骤制备益生菌制剂：\n[0038] 第一步，凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5μs/cm的去离子水以质量比\n20∶1浸泡28h，搅拌器以1000rpm转速再搅拌28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以凹土悬液质量的20％的量继续加入上述去离子水，搅拌、分层同样操作重复3次，于120℃烘干，研磨，过筛，取200目至140目凹土细粉备用；\n[0039] 第二步，益生菌菌悬液的制备：将嗜热链球菌由常规手段培养至对数生长期后期，\n9\n收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，并用无菌生理盐水将菌体浓度调节至10 ～\n10\n10 CFU/ml备用；其中，嗜热链球菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌；40℃静置培养20小时。\n[0040] 第三步，凹土吸附益生菌：10L益生菌菌悬液添加1000g凹土细粉构成吸附体系，调节吸附体系pH6、温度为20℃，吸附50分钟，吸附时采用震荡法增加凹土与益生菌的接触，震荡速度为90rpm；\n[0041] 第四步，真空冷冻干燥：步骤三的吸附体系于-40℃预冻3小时，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥28小时，得益生菌制剂，制剂含水量≤2％，检测活菌剂中活菌数为\n11\n10 CFU/g。\n[0042] 实施例4：\n[0043] 益生菌制剂的制备过程同实施例2，其中，益生菌为保加利亚乳杆菌，保加利亚乳杆菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌；37℃静置培养20小时。\n[0044] 实施例5：\n[0045] 益生菌制剂的制备过程同实施例2，其中，益生菌为鼠李糖乳杆菌，鼠李糖乳杆菌培养条件：培养基同嗜酸乳杆菌，37℃静置培养20小时。\n[0046] 实施例6：\n[0047] 益生菌制剂的制备过程同实施例1，其中，益生菌为粪链球菌，粪链球菌培养条件：\n培养基：蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml，pH6.8；37℃振荡培养6h，摇床转速为100rpm。\n[0048] 实施例7：\n[0049] 益生菌制剂的制备过程同实施例3，其中，益生菌为地衣芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌培养条件：培养基：葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO42g，MgSO42g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；37℃振荡培养40h，摇床转速为180rpm。\n[0050] 实验结果表明，添加凹土制得的益生菌制剂比用常规脱脂乳粉制得的活菌制剂在真空冷冻过程中和在人工模拟胃环境中的存活率要高得多，在人工肠环境中能较长时间地维持高活菌水平。\n[0051] 部分实验数据如表1、表2和图1所示。\n[0052] 表1凹土益生菌制剂和以脱脂乳粉益生菌制剂存活率比较\n[0053] \n[0054] 表2凹土益生菌制剂和以脱脂乳粉为保护剂的益生菌制剂\n[0055] 在人工模拟胃环境(3h)存活率比较\n[0056]