一种草酸青霉菌在溶解褐煤制取苯甲酸中的应用

1.一种草酸青霉菌在溶解褐煤制取苯甲酸中的应用方法，其特征在于，所述草酸青霉菌的分类命名为草酸青霉菌Penicillium oxalicum，已于2019年10月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 18600；
将所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 经培养后，将预处理后的褐煤加入培养液中继续培养，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum的培养基为CDA液体培养基，培养时间为24‑48 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，褐煤的预处理包括，将褐煤粉碎过筛后，再进行酸处理或碱处理。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酸处理的方法为，用浓度为3‑5 mol/L的硝酸溶液浸泡18‑32 h，且浸泡过程不断搅拌，随后用蒸馏水反复洗涤至pH中性，再在121℃下灭菌后烘干备用。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碱处理的方法为，用浓度为3‑5 mol/L的氢氧化钠溶液浸泡18‑32 h，且浸泡过程不断搅拌，随后用蒸馏水反复洗涤至pH中性，再在121℃下灭菌后烘干备用。
6.根据权利要求3‑5任一项所述的方法，其特征在于，所述过筛的目数为80‑120 目。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum经培养后，将经粉碎过筛和酸处理后的褐煤加入到培养液中继续培养10‑15 天后，褐煤溶解液化率为34.5‑48.0 %，且培养液中苯甲酸浓度为52.1‑73.6 mg/L；所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum经培养后，将经粉碎过筛和碱处理后的褐煤加入到培养液中继续培养10‑15 天后，褐煤溶解液化率为27.3‑35.2 %，且培养液中苯甲酸浓度为21.4‑26.0 mg/L。

一种草酸青霉菌在溶解褐煤制取苯甲酸中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及微生物溶解低阶煤技术领域，更具体地，涉及一种草酸青霉菌及其在溶解褐煤制取苯甲酸中的应用。\n背景技术\n[0002] 我国拥有丰富的煤炭资源，特别是褐煤和风化煤等低阶煤资源，在我国内蒙古东部、东北及云南等地区褐煤储量丰富，已探明的褐煤储量高达2100亿多吨，约占全国煤炭总资源量的13%。\n[0003] 褐煤是一种煤化程度较低的劣质煤，具有化学活性好、含水量高、发热量低和挥发分高等特点，直接燃烧热效率低，污染严重，长期露天堆放容易风化和自然不易存储和运输。煤炭资源在我国能源结构中占70%以上，随着精煤资源的枯竭，对低阶煤的开发利用也越来越引起人们的关注。\n[0004] 褐煤不仅可以作为燃料能源，还可以用于生产化工原料、吸附剂、催化剂载体和净化污水等。目前，对褐煤的开发利用主要通过物理和化学方法经过高温及高压等手段将褐煤转化为液体或气体用来代替油类燃料或制备化工产品，其特点是成本较高、条件苛刻；而采用微生物转化褐煤，使其溶解或转化为另一种产品，作为燃料或从中提取化工产品，具有工艺简单，无污染、处理成本低等优点。褐煤等低阶煤由于煤化程度低，保留了大量近似木质素物质结构，这是能利用微生物对褐煤进行降解的关键。因此，利用微生物特别是霉菌来降解褐煤等低阶煤具有可行性。\n[0005] 由于大部分霉菌都可以产生胞外过氧化物酶类，通过从褐煤或其他环境中分离可以降解木质素的微生物对褐煤等低阶煤进行降解，并从中获取一些特殊价值的工业化学产品，为褐煤的高效、清洁利用提供了一条新的有效途径。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的之一在于提供一种草酸青霉菌，所述草酸青霉菌的分类命名为草酸青霉菌Penicillium oxalicum ，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 18600，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所（100101），保藏日期为2019年10月25号。\n[0007] 该菌株的形态学以及生理生化鉴定参照《真菌鉴定手册》进行。\n[0008] 经形态鉴定及生物学特性研究，所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 为好氧菌，在固体CDA培养基中于28℃培养72 h后，菌落呈0.5‑1.0 cm的暗绿色，近似圆形，边缘为白色绒毛状菌丝，菌落扁平无褶皱无凸起，有大量孢子块易挑取，孢子易脱落；所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 过氧化氢酶和氧化酶活性为阳性，且可水解淀粉。\n[0009] 具体地，所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 的最适生长条件为：温度28℃，pH 7.0，培养基为CDA（硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15‑20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0‑7.2）；培养时间48 h，开始产生灰绿色孢子。\n[0010] 通过ITS rDNA作为Marker片段，通过引物扩增出的ITS基因序列，与NT数据库进行对比进行BLAST分析后，构建系统进化树获取近源物种信息，菌种与草酸青霉Penicillium oxalicum处于最小分支，为近似物种。\n[0011] 将菌株ITS序列号提交至NCBI基因库获取的许可登录号为：GQ851779.1；最终将分离到的编号为菌株确定为Penicillium oxalicum。关于保藏，菌种接种于CDA琼脂斜面上28 ℃培养72 h，加入3 mL灭菌后50%甘油/50 % CDA液体培养基，然后用接种环刮斜面孢子和菌丝，然后无菌操作取2 mL孢子和菌丝悬浮液装入菌种冻存管中于‑80℃条件下长期保存（2年）；平时菌种保存于CDA固体斜面，于4℃冰箱中保存，并定期对菌种进行转接（2月）。\n[0012] 本发明的另一发明目的为提供上述草酸青霉菌在溶解褐煤制取苯甲酸中的应用。\n[0013] 本发明还一方面提供了上述草酸青霉菌溶解褐煤制取苯甲酸的方法，包括：将所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 经培养后，再将预处理后的褐煤加入到培养液中继续培养，即可。\n[0014] 在上述技术方案中，所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 的培养基为CDA液体培养基，培养时间为24‑48 h。\n[0015] 进一步地，在上述技术方案中，所述褐煤的预处理包括，将褐煤粉碎过筛后，再进行酸处理或碱处理后的褐煤。\n[0016] 具体地，在上述技术方案中，所述酸处理的方法为，用浓度为3‑5 mol/L的硝酸溶液浸泡18‑32 h，且浸泡过程不断搅拌，随后用蒸馏水反复洗涤至pH中性，再在121℃下灭菌后烘干备用。\n[0017] 具体地，在上述技术方案中，所述碱处理的方法为，用浓度为3‑5 mol/L的氢氧化钠溶液浸泡18‑32 h，且浸泡过程不断搅拌，随后用蒸馏水反复洗涤至pH中性，再在121℃下灭菌后烘干备用。\n[0018] 再进一步地，在上述技术方案中，所述过筛的目数为80‑120 目。\n[0019] 还进一步地，在上述技术方案中，所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum 经培养后，将经粉碎过筛和酸处理后的褐煤加入到培养液中继续培养10‑15 天后，褐煤溶解液化率为34.5‑48.0 %，且培养液中苯甲酸浓度为52.1‑73.6  mg/L；所述草酸青霉菌Penicillium oxalicum  经培养后，将经粉碎过筛和碱处理后的褐煤加入到培养液中继续培养10‑15 天后，褐煤溶解液化率为27.3‑35.2 %，且培养液中苯甲酸浓度为21.4‑26.0 mg/L。\n[0020] 本发明具有如下有益效果：\n[0021] （1）本发明所提供的草酸青霉菌Penicillium oxalicum 是一种高效的褐煤溶解菌，接种于CDA培养基中培养48 h，加入酸处理和碱处理后褐煤样品，发酵15天对酸处理和碱处理后褐煤均有较好的溶解效果，发酵后再发酵液中可检测到高浓度苯甲酸；\n[0022] （2）在CDA平板培养基涂布本发明的草酸青霉菌Penicillium oxalicum ，于28 ℃下培养48 h，然后将粉碎100目后的酸处理后褐煤均匀撒在菌落表面，继续培养7天后，能明显的看到褐煤溶解后产生的黑色液滴，经过多次试验验证，草酸青霉菌Penicillium oxalicum 溶解褐煤效果明显。\n[0023] 附图说明：\n[0024] 图1为本发明实施例草酸青霉菌Penicillium oxalicum 的菌落形态图和菌丝显微镜形态图；\n[0025] 图2为本发明实施例草酸青霉菌Penicillium oxalicum 与同源菌株18S rDNA基因序列系统发育树示意图；\n[0026] 图3为本发明实施例草酸青霉菌Penicillium oxalicum 在CDA液体培养基中对褐煤的溶解效果（A：灭活青霉菌+酸处理褐煤；B：青霉菌+酸处理褐煤；C：青霉菌+碱处理褐煤）；\n[0027] 图4 为本发明实施例草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对褐煤的溶解率结果；\n[0028] 图5为本发明实施例草酸青霉菌Penicillium oxalicum 发酵液中苯甲酸的浓度；\n[0029] 图6为本发明实施例草酸青霉菌Penicillium oxalicum 发酵液中苯甲酸的液相色谱图。\n具体实施方式\n[0030] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。\n[0031] 若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。\n[0032] 实施例1 菌株的分离与鉴定\n[0033] 取内蒙古胜利煤矿新鲜褐煤样品，经过预处理、分离、筛选，从褐煤中获得23株可以溶解褐煤的微生物菌株，具体筛选步骤如下：\n[0034] （1）称取10g颗粒褐煤，用无菌水清洗三次，然后用灭过菌的研钵将褐煤研磨至细\n2 3\n腻的粉末状，然后将粉末溶解在90 mL无菌生理盐水中，再梯度稀释10、10 、10 ，然后均匀涂布于CDA和LB固体平板培养基上，于28℃倒置培养，待菌落充分长出后，用接种针分别挑取单菌落于相应的固体培养基上进行划线纯化培养，反复纯化4‑5次直到划线平板只有单一菌种菌落，然后通过生理生化和形态学鉴定最终得到13株霉菌、1株酵母菌、9株芽孢杆菌；\n[0035] （2）通过溶煤实验最终得到一株溶解褐煤效果较好的菌株，将菌株接种于装有CDA固体培养基的组培瓶中，于28℃下培养48h后将预处理褐煤粉末撒在菌落表面，继续培养7天，观察菌种可将酸处理后胜利褐煤溶解并产生黑色液滴。将菌种接种于100mL液体察氏培养基中，28℃震荡培养48h后，加入2 g酸处理褐煤，然后继续震荡培养10天后，取发酵液\n1000 rpm离心20 min，取上清液用0.45 um膜过滤后，用高效液相色谱检测，结果证明菌株溶解褐煤的降解产物中有高浓度的苯甲酸。\n[0036] （3）取步骤（1）中菌株单菌落在CDA琼脂平板上反复划线纯化3次后，对固体平板上菌株单菌落进行生理生化鉴定。\n[0037] 如图1所示，本发明实施例提供的菌株菌落形态为直径0.5‑1.0 cm近似圆形暗绿色菌落，菌落边缘呈白色绒毛状，菌落扁平无凸起，表面无褶皱，产生大量孢子易于挑取和脱落，在液体察氏培养基中有较宽的pH适应范围，在pH 4.5‑8.5范围内均可很好生长，最适生长温度为28℃。该菌株可以使经过酸处理和碱处理后褐煤溶解液化，形成黑色液滴，且对经过酸处理后褐煤溶解效果优于碱处理后褐煤。\n[0038] 分子生物学水平鉴定：\n[0039] 取10 mL菌株液体培养物，10000 rpm冷冻离心15 min，然后用无菌水悬浮菌丝后反复离心清洗3次，然后提取DNA。\n[0040] PCR操作：\n[0041] PCR引物使用真菌 ITS 通用引物进行扩增。\n[0042] （1）引物序列\n[0043] ITS1： TCCGTAGGTGAACCTGCGG\n[0044] ITS4： TCCTCCGCTTATTGATATGC\n[0045] （2） PCR扩增\n[0046] PCR反应体系：10×Ex Taq buffer 2.0 μl；5U Ex Taq 0.2 μl；2.5 mM dNTP Mix \n1.6 μl；27F 1μl；1492R 1 μl；DNA 0.5 μl；ddH2O 13.7 μl。\n[0047] Total volume 20 μl。\n[0048] （3）PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行25个循环；72 ℃ 10 min。\n[0049] PCR扩增结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳（120 V电压电泳30 min），PCR产物约为\n500 bp，PCR产物直接使用3730XL 测序仪进行一代双末端测序。获得AB1测序峰图文件，通过软件组装后，与NT库进行比对进行BLAST分析后，构建系统进化树获取近源物种信息（系统发育树如图2所示），菌种与Penicillium oxalicum处于最小分支，为近似物种。菌株ITS序列在线提交至 NCBI基因库获取的许可登录号为：GQ851779.1。\n[0050] 结合的形态学特征和生理生化鉴定结果，确定其为Penicillium oxalicum ；该菌株已于2019年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No. 18600。\n[0051] 实施例2 苯甲酸、苯酚和盐浓度对草酸青霉菌Penicillium oxalicum 生长的影响\n[0052] 在实验过程中，分别配制含苯甲酸、苯酚浓度分别为20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、\n300 mg/L和500 mg/L的固体PDA培养基，NaCl配制浓度分别为5%、10%、15%和20%，将草酸青霉菌Penicillium oxalicum 划线接种于相应PDA平板上于28℃培养。\n[0053] 结果表明，浓度为500 mg/L以下的苯酚对草酸青霉菌Penicillium oxalicum 无明显抑制作用；浓度为300 mg/L以下的苯甲酸对草酸青霉菌Penicillium oxalicum 无明显抑制作用；草酸青霉菌Penicillium oxalicum 的NaCl耐受浓度为10 %；当苯酚浓度高于\n800 mgL、苯甲酸浓度高于500 mg/L以及NaCl浓度高于15%时对生长有明显抑制作用。\n[0054] 研究表明，褐煤溶解过程会生成酚类、苯甲酸及其酯类以及无机盐，因此，研究草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对苯酚、苯甲酸及无机盐的耐受性，对研究草酸青霉菌Penicillium oxalicum 溶解褐煤制备苯甲酸具有重要意义。\n[0055] 实施例3 草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对酸处理褐煤的溶解实验和发酵液苯甲酸含量测定\n[0056] 为了进一步研究草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对褐煤的溶解液化及发酵生成苯甲酸的能力，将经过酸处理后褐煤粉（褐煤粉碎至100目以下，用3 mol/L的硝酸浸泡48 h，然后用自来水洗至中性，于121 ℃下灭菌，80 ℃烘干），按照5 wt%比例加入到已振荡培养48 h含草酸青霉菌Penicillium oxalicum 的CDA液体培养基中继续于28 ℃，120 rpm条件下振荡培养15天。\n[0057] 用干重法测定溶煤效果，利用HPLC法测定培养液中苯甲酸的含量。溶煤效果和苯甲酸含量测定结果如图4和图5所示，结果表明，培养10天草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对酸处理褐煤液化溶解率达到42%，培养15天草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对酸处理褐煤液化溶解率达到48%，此外，发酵液中苯甲酸浓度在第15天时为可达到73mg/L。\n[0058] 实施例4 草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对碱处理褐煤的溶解实验和发酵液苯甲酸含量测定\n[0059] 将经过NaOH处理后褐煤粉（褐煤粉碎至100目以下，用3 mol/L的NaOH浸泡48 h，然后用自来水洗至中性，121℃下霉菌，80 ℃烘干），按照5 wt%比例加入到已振荡培养48 h含草酸青霉菌Penicillium oxalicum 的CDA液体培养基中继续于28℃，120 rpm条件下震荡培养15天。\n[0060] 用干重法测定溶煤效果，利用HPLC法测定培养液中苯甲酸的含量。溶煤效果和苯甲酸含量测定结果如图4和图5所示，结果表明，培养15天草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对碱处理褐煤液化溶解率达到35 %，此外，发酵液中苯甲酸浓度可达到26.0 mg/L。\n[0061] 此外，将振荡培养48小时后的草酸青霉菌Penicillium oxalicum 培养液于121℃下灭活处理20min，使草酸青霉Penicillium oxalicum 全部死亡后，与实施例3相同的比例，加入经过酸处理后褐煤粉（褐煤粉碎至100目以下，用3 mol/L的硝酸浸泡48 h，然后用自来水洗至中性，于121 ℃下灭菌，80 ℃烘干），与实施例3和4进行对比，对比结果如图3所示。\n[0062] 从图3中可以看出，经过灭活后的草酸青霉菌Penicillium oxalicum 对加入的酸处理后褐煤几乎没有任何溶解液化效果，而未灭活的草酸青霉菌Penicillium oxalicum 可以将经过酸处理和碱处理后褐煤溶解生成黑色的溶解物，表明对预处理后褐煤起溶解液化作用的为草酸青霉菌Penicillium oxalicum ，而非褐煤自然溶解。\n[0063] 以上所述为本发明的较佳实施例，但本发明不局限于实施例所公开的内容，所说凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效实施和修改，都落入本发明保护的范围内。