一种快速定量检测CK‑MB的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法

发明专利无效专利

申请号：
CN201610575106.3
IPC分类号：G01N33/558;G01N33/533;G01N33/543;G01N21/64
申请日期：
2016-07-21
申请人：
上海奥普生物医药有限公司

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专利名称	一种快速定量检测CK‑MB的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法
申请号	CN201610575106.3	申请日期	2016-07-21
法律状态	驳回	申报国家	中国
公开/公告日	2016-12-21	公开/公告号	CN106248927A
优先权	暂无	优先权号	暂无
主分类号	G01N33/558 ? IPC结构图谱： G 物理 G0 仪器 G01 测量；测试 G01N （除免疫测定法以外包括酶或微生物的测量或试验入C12M，C12Q） G01N33/00 利用不包括在G01N 1/00至G01N 31/00组中的特殊方法来研究或分析材料 G01N33/48 生物物质，例如血、尿（G01N 33/02，G01N 33/26，G01N 33/44，G01N 33/46优先）；血球计数器（靠对一表面扫描来统计该表面上的血球数入G06M 11/02）〔3，4〕 G01N33/50 生物物质（例如血、尿）的化学分析；包括了生物特有的配体结合方法的测试；免疫学试验（除了免疫学试验以外包括酶或微生物，以及相应的组分或试纸的检测或试验，形成这些组分的工艺过程，在微生物的或酶的反应过程中反应条件的控制入C12Q）〔3，2006.01〕 G01N33/53 免疫测定法；生物特异性结合测定；相应的生物物质〔4，2006.01〕 G01N33/558 利用了抗原或抗体的扩散或迁移〔4〕	IPC分类号	G;0;1;N;3;3;/;5;5;8;;;G;0;1;N;3;3;/;5;3;3;;;G;0;1;N;3;3;/;5;4;3;;;G;0;1;N;2;1;/;6;4查看分类表>
申请人	上海奥普生物医药有限公司	申请人地址	上海市浦东新区瑞庆路526号变更专利地址、主体等相关变化，请及时变更，防止失效
权利人	上海奥普生物医药股份有限公司	当前权利人	上海奥普生物医药股份有限公司
发明人	朱传增;石晓强;安永君;李福刚;徐建新
代理机构	上海伯瑞杰知识产权代理有限公司	代理人	吴泽群

摘要

本发明公开一种快速定量检测CK‑MB的时间分辨荧光免疫层析试剂及其制备方法，属于临床医学诊断领域。该试剂由试纸条和荧光液两部分组成。其中，试纸条包括底板、Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上。所述硝酸纤维素膜上包被有CK‑MB单克隆抗体1的检测线和兔IgG抗体构成的质控线。荧光液包含CK‑MB单克隆抗体2标记的荧光微球、羊抗兔抗体标记的荧光微球。本发明利用时间分辨荧光微球提高荧光强度，降低背景信号，同时定量检测全血、血清或血浆中的CK‑MB含量,样本仅需要10～20微升。该试纸条具有方便快捷、操作简单、检测时间短、特异性强、灵敏度高、检测结果更加准确，适用于临床POCT的快速诊断。

1.一种快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)；
所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上；所述硝酸纤维素膜(3)上包被有CK-MB单克隆抗体1(5)的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线；
所述的荧光液(7)包含CK-MB单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。
2.根据权利要求1所述的快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求2所述的快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，粒径为100～
500nm。
4.根据权利要求1所述的快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。
5.根据权利要求4所述的快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于，所述的荧光液的制备步骤如下：
(1)CK-MB单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释：
将时间分辨荧光微球溶于100mmol/L MES缓冲液中，每1mg时间分辨荧光微球对应100-
300μL MES缓冲液,加入活化剂NHS和EDC,EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为
0.1％-0.2％；随后加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂,每1mg时间分辨荧光微球对应
10-100μL 50mmol/L氨基乙酸；洗涤、10000-15000rpm离心后，再次加入活化剂活化，EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为0.1％-0.2％；再次洗涤、10000-15000rpm离心，将时间分辨荧光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入CK-MB单克隆抗体2进行反应，微球与抗体的质量比为10mg:0.01mg～2.0mg；反应完后加入封闭剂进行封闭，封闭剂的终浓度为2-
3％；封闭2h，洗涤、10000-15000rpm离心，再次用pH为7-9的60-100mmol/L硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，封闭剂的终浓度为2-3％，CK-MB抗体标记时间分辨荧光微球终浓度在0.5～50μg/ml，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存；
(2)羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备及稀释过程同(1)所述；
(3)滴配：
用pH为8.0、200mmol/L的Tris缓冲液将步骤(1)和(2)中同等量的CK-MB、羊抗兔包被的荧光微球分别进行稀释，其中，CK-MB包被的荧光微球稀释200～300倍，羊抗兔包被的荧光微球稀释2000～3000倍，混合后即为所需要的荧光混合液。
7.根据权利要求6所述的一种快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂。其特征在于：所述洗涤采用0.9％NaCl，0.05％Tween 20，剩余为5mmol/L的PB混合而成的洗涤剂，其pH为7.8，加入洗涤剂后微球终浓度在2％。
8.一种快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备检测线和质控线：硝酸纤维素膜(3)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生的场所；检测线(5)是将CK-MB单克隆抗体1使用50mmol/L柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线于所述硝酸纤维素膜(3)上；质控线(6)是将兔IgG抗体使用
50mmol/L柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线与所述质控线(6)，将划好的硝酸纤维素膜置于真空干燥箱，在37～45℃下，烘干24～48小时，检测线(5)位于质控线(6)左侧，即液体首先接触的位置；
(2)试纸条的组装：试纸条底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水纸(4)，将组装好的大板切成小条，即得到所述快速定量检测CK-MB的时间分辨荧光免疫层析试纸条。

序号	公开(公告)号	公开(公告)日	申请日	专利名称	申请人
1	CN102707056A	2012-10-03	2012-04-28	快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法有效专利	广州鸿琪光学仪器科技有限公司
2	CN104090248A	2014-10-08	2013-12-24	铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂无效专利	上海容晖生物科技有限公司
3	CN104198723A	2014-12-10	2014-08-11	一种基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒无效专利	南京普朗医疗设备有限公司

序号	公开(公告)号	公开(公告)日	申请日	专利名称	申请人
1	CN108254562B	2016-12-28	2016-12-28	检测MYO的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法有效专利	广州瑞博奥生物科技有限公司
2	CN108254563B	2016-12-28	2016-12-28	检测cTnI的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法有效专利	广州瑞博奥生物科技有限公司
3	CN109444406A	2018-11-09	2018-11-09	定量检测标志物cyfra21-1的试纸条及其制备方法和检测方法无效专利	深圳市众循精准医学研究院

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