磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒

1.一种磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于包括以下步骤：
<1>处理待测样品，参照农业部1025号公告－24-2008标准进行；
<2>将半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清白蛋白的偶联物作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，分别加入系列标准样品溶液或经前处理的待测样品，再加入磺胺二甲嘧啶单克隆抗体进行反应；具体按以下操作进行：用包被液按1:100000稀释包被抗原，每孔加入
100μL，4℃孵育10h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入
350μL封闭液，37℃孵育1h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37℃烘干后，用锡箔纸真空密封，4℃保存；将化学发光板从4℃中取出，平衡至室温，按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后每孔加入50μL磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，混匀，37℃孵育30min；倾去液体，用洗板机洗涤3次，拍干；
<3>经步骤<2>后，加入酶标二抗进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品溶液和待测样品的发光值，具体按以下操作进行：每孔加入50μL 1:2500稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入100μL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值；
<4>以步骤<3>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中磺胺二甲嘧啶的含量。
2.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于：所述封闭液是5％的脱脂奶粉；所述磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的稀释倍数为1:1500；所述系列标准样品溶液的浓度为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；所述包被液是pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
3.一种磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被有包被抗原的化学发光板、磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液、磺胺二甲嘧啶单克隆抗体工作液、浓缩洗涤液、HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液；所述包被抗原为磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清白蛋白的偶联物；所述磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液为6个浓度梯度，分别是0μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；所述浓缩洗涤液由NaCl
8.00g、KH2PO4 0.20g、Na2HPO4·12H2O 2.90g、KCl 0.20g、吐温-20 0.50mL，加水定容至
100mL制成；所述化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyoECL Plus。
4.根据权利要求3所述的磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测试剂盒，其特征在于磺胺二甲嘧啶单克隆抗体按以下操作制备：
<1>动物免疫
将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；
<2>细胞融合和克隆筛选
冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；
待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100μL上清，加至已包被抗原的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100％时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；
<3>细胞冻存与复苏
用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中培养；
<4>腹水的制备与纯化
采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水经饱和硫酸铵初纯和亲和层析后，即得磺胺二甲嘧啶单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述试剂盒在动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测中的应用。

磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒\n技术领域\n[0001] 本发明属于化学发光酶免疫分析技术领域，尤其涉及一种磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。\n背景技术\n[0002] 磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM2）又称磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲嘧啶，是畜牧养殖业中应用最广的磺胺类药物之一，常用做饲料添加剂和细菌性疾病的治疗药物，长期添加或滥用可导致动物性食品中的药物残留，对人类健康造成威胁。研究发现，人体通过任何途径摄入都可以在体内蓄积，影响机体的免疫系统，破坏肌肉、肾脏、甲状腺等组织，同时可诱发甲状腺癌；而且，该药也可以通过胎盘和乳汁从母体向胎儿或新生儿转移，使其血浆和脑组织中的甲状腺素水平降低，这对人类和动物的脑发育有深远影响。另一方面，磺胺二甲嘧啶的残留容易诱导细菌的耐药性，使药物失去治疗疾病的价值。因此，联合国食品法典委员会和欧盟等规定，食品和饲料中磺胺类药物单个均不得超过100μg/kg；日本规定的最高残留限量为10μg/kg；2002年12月我国农业部公告第235号文件规定，在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中，磺胺类最高残留限量为100μg/kg，并将其列为兽药残留监控重点。\n[0003] 目前，检测磺胺二甲嘧啶的方法有微生物法、理化方法（如高效液相色谱法、薄层层析等）和免疫分析法（放射免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法等）。其中，微生物法简便、快速、廉价，适合基层现场筛查，但易受其它生物影响，灵敏度低、漏检率高；\n理化方法精密度高、准确度高，但是仪器昂贵、专业性强、检测时间长，可用于疑似样品的确证；免疫分析法操作简便、快速、特异、灵敏度高，近年来已被应用于多种药物残留的检测，但有关检测磺胺二甲嘧啶残留的化学发光酶免疫分析法尚未见报道。\n发明内容\n[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种经济、简便、快速、特异、灵敏、准确的磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒和该试剂盒在动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测中的应用。\n[0005] 本发明要解决的另一技术问题是提供一种特异性强的磺胺二甲嘧啶单克隆抗体。\n[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，包括以下步骤：\n[0007] <1>处理待测样品；\n[0008] <2>将半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清蛋白的偶联物（SM2-OVA）作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，分别加入系列标准样品或经前处理的待测样品，再加入磺胺二甲嘧啶单克隆抗体进行反应；\n[0009] <3>经步骤<1>后，加入酶标二抗进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值；\n[0010] <4>以步骤<3>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中磺胺二甲嘧啶的含量。\n[0011] 步骤<1>参照农业部1025号公告－24-2008标准进行；步骤<2>按以下操作进行：\n用包被液按1:100000稀释包被抗原，每孔加入100μL，4℃孵育10h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350μL封闭液，37℃孵育1h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37℃烘干后，用锡箔纸真空密封，4℃保存；将化学发光板从4℃中取出，平衡至室温，按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设\n3孔重复，然后每孔加入50μL磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，混匀，37℃孵育30min；倾去液体，用洗板机洗涤3次，拍干；步骤<3>按以下操作进行：每孔加入50μL1:2500稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入100μL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。\n[0012] 封闭液是5%的脱脂奶粉；磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的稀释倍数为1:1500；系列标准样品溶液的浓度为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。\n[0013] 磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测试剂盒，包括包被有包被抗原（SM2-OVA）的化学发光板、磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液、磺胺二甲嘧啶单克隆抗体工作液、浓缩洗涤液、HRP-山羊抗小鼠IgG（酶标二抗）工作液、化学发光液；包被抗原为磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清蛋白的偶联物；磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液为6个浓度梯度，分别是0μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；浓缩洗涤液由NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g、吐温-200.50mL，加水定容至100mL制成；化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyoECL Plus。\n[0014] 上述试剂盒在动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测中的应用。\n[0015] 磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，按以下操作制备：以半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物（SM2-BSA）作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选，对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次，经过鉴定、冻存和建株后，进行腹水的制备，然后通过纯化腹水，获得能特异性识别磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体。\n[0016] 上述磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，按以下操作制备：\n[0017] <1>动物免疫\n[0018] 将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；\n[0019] <2>细胞融合和克隆筛选\n[0020] 冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；\n[0021] 待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100μL上清，加至已包被抗原SM2-OVA的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；\n[0022] <3>细胞冻存与复苏\n[0023] 用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中培养；\n[0024] <4>腹水的制备与纯化\n[0025] 采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水经饱和硫酸铵初纯和亲和层析后，即得磺胺二甲嘧啶单克隆抗体。\n[0026] 本发明首次探讨了检测磺胺二甲嘧啶的化学发光酶免疫机理，发明人将间接酶免疫反应和化学发光技术相结合，成功建立了磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒，该法应用在动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测中，具有特异、快速、灵敏、准确的特点，试剂盒的IC50为4.006μg/L，回收率为94.42～102.73%，与现有检测方法的吻合率为100%，适合用于磺胺二甲嘧啶的痕量分析与批量检测。本发明的线性检测范围（0.1～\n1000μg/L）比ELISA宽，当检测磺胺二甲嘧啶严重超标（含量超过ELISA检测范围而低于\n1000μg/L）的样品时，无需对样品进一步稀释并重复检测，减少了工作量、节省检测成本和时间；同时，本发明最低检测限（0.17μg/L）比ELISA降低了10倍，更加符合痕量分析和批量检测，具有较好的应用前景。\n附图说明\n[0027] 图1是实施例2磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法的标准曲线。\n[0028] 图中：X轴为磺胺二甲嘧啶标准样品浓度的对数值，Y轴为各浓度磺胺二甲嘧啶标准样品的发光值除以“0”浓度孔发光值（RLU/RUL0%）。\n具体实施方式\n[0029] 实施例1磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的制备\n[0030] 1.1动物免疫\n[0031] 以半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物（SM2-BSA）作为免疫原，将10只健康的6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成2组，其中1组为对照组；通过基础免疫和5次加强免疫后，采血测定血清效价，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；\n[0032] 1.2细胞融合和克隆筛选\n[0033] 冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将5号小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合（融合率为71.4%），融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；\n[0034] 待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100μL上清，加至已包被抗原SM2-OVA的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；\n[0035] 1.3细胞冻存与复苏\n[0036] 用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中培养；\n[0037] 1.4腹水的制备与纯化\n[0038] 采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水经饱和硫酸铵初纯和亲和层析后，经SDS-PAGE电泳鉴定，证实获得的磺胺二甲嘧啶单克隆抗体1E7达到电泳纯。\n[0039] 1.5单克隆抗体的鉴定\n[0040] 1.5.1蛋白含量的测定\n[0041] 用紫外分光光度计测定纯化的单克隆抗体的蛋白含量为4.536mg/mL。\n[0042] 1.5.2亲和力的测定\n[0043] 通过非竞争ELISA，分别以OD450值为纵坐标，以SM2-McAb的浓度为横坐标，绘制标准曲线，以公式1计算不同抗原包被浓度下的亲和常数，取平均值得出磺胺二甲嘧啶单克\n7\n隆抗体的亲和常数（Ka）为0.12×10L/mol。\n[0044] （公式1）\n[0045] 1.5.3亚类的鉴定\n[0046] 按照洛阳佰奥通实验材料中心的小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA试剂盒测定\n1E7亚类为IgG2b。\n[0047] 实施例2磺胺二甲嘧啶残留的化学发光酶免疫分析检测法的建立\n[0048] 2.1相关试剂的配制\n[0049] 碳酸盐缓冲液（pH9.6，即包被液）：准确称取Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，超纯水溶解后，调节pH至9.6，定容至1000mL。\n[0050] 洗 涤 液（pH7.4）：准 确 称 取NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，超纯水溶解后，调节pH至7.4，加入吐温-200.50mL，定容至1000mL。\n[0051] 磷 酸 盐 缓 冲 液（PBS）（pH7.4）：准 确 称 取 NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，超纯水溶解后，调节pH至7.4，定容至1000mL。\n[0052] 封闭液：准确称取脱脂奶粉1.0g，加入20mL磷酸盐缓冲液，搅拌均匀至完全溶解。\n[0053] BeyoECL Plus（超敏ECL化学发光试剂盒，P0018，100mL）：购自碧云天生物技术研究所。\n[0054] 2.2抗原包被条件的确定\n[0055] 使用半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清蛋白的偶联物（SM2-OVA）作为包被抗原，将该抗原按1:25000、1:50000、1:75000、1:100000和1:125000稀释后分别在37℃10h、\n25℃10h、4℃10h和37℃3h、25℃3h和4℃3h条件下包被，选择反应标准曲线IC50（50%抑制率时药物的浓度，即反应的灵敏度）最小的条件作为最佳抗原包被条件。由表1结果确定包被抗原按1:100000稀释，在4℃孵育10h为最佳。\n[0056] 表1抗原包被条件的优化结果\n[0057] \n[0058] 2.3封闭条件的确定\n[0059] 以最佳抗原包被条件包被化学发光板，以20mM的PBS、5%的脱脂奶粉、1%的BSA、\n5%的胎牛血清作为封闭材料，选择反应标准曲线IC50最小的，作为反应封闭液；然后，以5%的脱脂奶粉作为封闭液，设定封闭时间为37℃45min、37℃1h、37℃1.5h、37℃2h，计算不同条件下的IC50，选择反应标准曲线IC50最小的，作为反应封闭条件，由表2结果确定5%的脱脂奶粉37℃1h为最佳。\n[0060] 表2封闭条件的优化结果\n[0061] \n[0062] 2.4抗体稀释倍数的确定\n[0063] 在最佳包被、封闭条件下，将磺胺二甲嘧啶单克隆抗体分别按照1:1000、1:1500、\n1:2000和1:2500稀释，以反应标准曲线IC50作为判定指标，确定反应最佳抗体稀释倍数。\n由表3结果确定1:1500为抗体最佳稀释倍数。\n[0064] 2.5竞争反应时间的确定\n[0065] 在前述已确定的最佳条件下，分别选择15min、30min和60min作为竞争反应时间，以反应标准曲线IC50作为判定指标，选择竞争反应时间。由表3结果确定30min为最佳竞争反应时间。\n[0066] 表3抗体稀释倍数、竞争反应时间的优化结果\n[0067] \n[0068] 2.6HRP-山羊抗小鼠IgG稀释倍数的确定\n[0069] 在以上最优条件下，分别将HRP-山羊抗小鼠IgG按照1:1000、1:2000、1:4000和\n1:8000稀释，以反应标准曲线IC50作为判定指标，确定反应最佳二抗稀释倍数。结果显示，按1:1000稀释时，化学发光值过高，误差较大；按1:6000稀释时，化学发光值太小，结果不易判定；而1:2000和1:3000稀释时，发光数值大小为发光仪最佳检测范围。综合考虑，确定1:2500为HRP-山羊抗小鼠IgG最佳稀释浓度。\n[0070] 2.7标准曲线的建立、灵敏度和最低检测限\n[0071] 在最优条件下，将磺胺二甲嘧啶配成0.1～1000μg/L系列浓度，每个浓度3孔重复，进行检测。以标准样品溶液浓度的对数值为横坐标，以各浓度磺胺二甲嘧啶标准品的发光值除以“0”浓度孔发光值（RLU/RUL0%）为纵坐标，绘制标准曲线。如图1所示，标准曲线\n2\n的回归方程为y=-22.13x+63.338，R=0.9904，曲线在0.1～1000μg/L之间呈现良好的线性关系，最低检测限是0.17μg/L，IC50为4.006μg/L。\n[0072] 2.8本发明的特异性\n[0073] 以本发明的分析检查法对一些常见抗生素（磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺五甲嘧啶、青霉素、氧氟沙星、氯霉素、己烯雌酚）进行检测，测定IC50，按照公式2，计算各药物的交叉反应率。由表4可见，本发明所建立的方法与常见抗生素的交叉反应率均小于0.01%，表明本法特异性较好。\n[0074] 交叉反应率＝IC50（磺胺二甲嘧啶）/IC50（其他药物）×100％ （公式2）[0075] 表4本发明特异性测定结果\n[0076] \n[0077] 2.9本发明的准确度\n[0078] 以低、中、高三个浓度（1μg/L、10μg/L、100μg/L）进行回收率实验，每个样品设定3孔重复，测定其化学发光值，将得到的平均值代入标准曲线的回归方程，求出相应标准样品浓度值，计算回收率。由表5结果确定本发明的回收率在94.42～102.73%之间，表明本法具有可靠的准确度。\n[0079] 表5本发明准确度的测定结果\n[0080] \n[0081] 实施例3磺胺二甲嘧啶残留化学发光酶免疫分析检测试剂盒的研制\n[0082] 根据实施例1和2的研究结果，组装磺胺二甲嘧啶残留化学发光酶免疫分析检测试剂盒。\n[0083] 3.1试剂盒组成\n[0084] A包被有包被抗原（SM2-OVA）的化学发光板；\n[0085] B磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液：0μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；\n[0086] C磺胺二甲嘧啶单克隆抗体1E7工作液；\n[0087] D HRP-山羊抗小鼠IgG工作液；\n[0088] E浓 缩 洗 涤 液：NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g、吐温-200.50mL，加水定容至100mL；\n[0089] F化学发光液A液、B液（超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyoECL Plus）；\n[0090] 3.2化学发光板的包被\n[0091] 用包被液按1:100000稀释包被抗原，每孔加入100μL，4℃孵育10h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后每孔加入350μL封闭液，37℃孵育1h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37℃烘干后，用锡箔纸真空密封，4℃保存。\n[0092] 实施例4磺胺二甲嘧啶残留化学发光酶免疫分析检测试剂盒的应用\n[0093] 4.1试剂的配制\n[0094] A洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用超纯水稀释10倍后使用。\n[0095] B化学发光液：在添加化学发光液前，将化学发光液A液、B液按照1:1混合均匀。\n[0096] 4.2组织样品的前处理\n[0097] 参照农业部1025号公告－24-2008标准进行：\n[0098] A取3g动物肌肉组织到研钵内研至糊状转到50mL离心管内；\n[0099] B加入84%的乙晴9mL混合震荡10min，4000r/min离心10min；\n[0100] C取上清液3mL加入2mol/L氯化钠2mL、乙酸乙酯7mL，震荡混匀10min，4000r/min离心5min；\n[0101] D取上层液于氮气吹干，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲液1mL、正己烷1mL溶解，震荡混匀3min，于4000r/min离心5min，取下层液体用于检测。\n[0102] 4.3检测过程\n[0103] A将化学发光板从4℃中取出，平衡至室温；\n[0104] B按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后每孔加入50μL磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，混匀，37℃孵育30min；\n[0105] C倾去液体，用洗板机洗涤3次，拍干；\n[0106] D每孔加入50μL1:2500稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；\n[0107] E倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入100μL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值；\n[0108] F按照公式，根据所获得样品发光值，计算样品的抑制率，并将抑制率代入标准回归方程，计算出残留量；如样品曾稀释，则乘以稀释倍数，即为样品中磺胺二甲嘧啶的残留量。\n[0109] \n[0110] 4.4样品的检测\n[0111] 采集市售的虾、鱼和猪肉样品共141份，参考上述公告标准进行样品的前处理，然后用本发明的试剂盒进行检测，按照农业部规定，当残留量超过100μg/kg判为不合格，其中有129份合格，样品合格率为91.49%。\n[0112] 实施例5本发明的化学发光酶免疫试剂盒与市售ELISA试剂盒的比较\n[0113] 挑选36份组织样品，用本发明的试剂盒和市售ELISA试剂盒同时检测其中磺胺二甲嘧啶的残留量，结果见表6。二者的阴阳性符合率为100%，对两种方法的检测结果进行统计分析，经t检验可知t=0.410，P=0.648＞0.05，两种方法检测结果之间差异不显著，说明本发明的试剂盒具有较好的应用效果。\n[0114] 另外，本发明的检测范围更宽、最低检测限比市售ELISA试剂盒降低了10倍，更加符合痕量分析和批量检测，应用前景良好。\n[0115] 表6试剂盒结果比较\n[0116] \n样品编号 市售ELISA试剂盒检测结果（μg/kg） 本试剂盒检测结果（μg/kg）虾1 317.3386221 248.0751806\n虾2 335.6700716 266.10262\n虾15 1.001767113 2.309985198\n虾17 1.523619251 2.3584488\n虾19 1.301923065 2.961149759\n虾20 1.451238264 2.598121808\n鱼1 335.6700716 378.3196916\n鱼2 364.4887814 334.2108086\n鱼11 2.194873187 1.890214447\n鱼12 1.673115544 1.809148814\n鱼14 2.900981043 3.53177296\n鱼15 2.055676615 3.188808856\n鱼17 1.743458869 1.218988793\n鱼18 1.413698722 1.80391665\n鱼20 1.150609629 2.922276658\n猪1 158.1578608 172.2441963\n猪2 410.8804742 445.0008146\n猪3 397.2662671 420.5712173\n猪4 407.8153277 443.0162229\n猪5 353.7336141 385.9277567\n猪10 8.559588927 18.16834143\n猪11 1.352423994 1.363395653\n猪15 353.7336141 340.2694691\n猪17 1.397909086 1.447940964\n猪19 5.15386114 4.40341437\n猪24 1.08168136 1.139793386\n猪25 1.377130226 2.182899973\n猪44 323.3350819 271.2961433\n猪61 360.417797 348.4369918\n猪83 296.6574807 347.6356024\n猪64 357.7290994 334.2100464\n猪65 318.5289507 241.6193998\n猪88 3.973078555 14.07213281\n猪86 28.3639221 32.23077022\n猪111 4.078580205 18.16573141\n猪125 4.078580205 1.799760481