一种促进油菜生长的复合微生物制剂及其制备方法

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一种促进油菜生长的复合微生物制剂及其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种促进油菜生长的复合微生物制剂及其制备方法，施用在土壤中植物根系，用于固定空气中的氮为有机氮或按盐补充土壤中的氮素，属于有机肥领域。\n背景技术\n[0002] 油菜在我国常年种植面积约为800万公顷，其种子含油量为30％-50％，是我国重要的油料作物。长期以来，我国油菜种植面积和总产量均居世界第一，占世界油菜种植面积和总产量的30％左右。加入WTO以后，我国各种农产品市场都面临着长期处于被保护的地位，缺乏强硬的市场竞争力。加之随着国际化市场的进一步发展，我国的油菜产业和市场能否平稳的度过这个时期是一项挑战。\n[0003] 我国大部分油菜产区的，产量均低于200公斤每亩，是长期以来制约总产量的一个瓶颈。近年来，由于种植效益下降、科技成果转化较慢、市场价格低迷等诸多因素影响，油菜面积出现大幅减少的局面。当前，世界油菜籽价格的攀升、生物柴油的开发、市场的供求得不到满足，为油菜发展带来了机遇。\n[0004] 从1950-1990年40年间，全球应用化肥产量竟然增加了27倍，达到8亿吨，目前油菜产量的停滞和下降是由于氮的吸收不足造成的，只有增加氮肥的施用量才能维持或提高产量。为了减少不可再生资源的消耗及施肥所造成的环境污染，实现农业的可持续性发展，保护生态平衡，人们正试图减少化肥用量，希望通过一些新型的生物肥料和生物固氮解决上述问题，提高作物特别是油菜的产量。自从1904年德国微生物学家Lorenz Hiltner提出“根圈”(rhizosphere)这一概念以来，有关其生物学、微生物学和超微结构等多方面的知识已被人们研究而有了深入的了解。早期对根圈的研究主要限于微生物的根圈效应，六十年代后由于电子显微镜在土壤学和微生物学研究中的应用，初步证实了根圈微生态环境中存在着植物根系、根圈微生物和土壤环境三者之间相互作用的复杂关系。\n[0005] 现有的光合微生物肥料一般都是单一菌种，菌的活力一般在106-108cfu/克，功能也比较单一，作物与微生物只是松散的联合，它们之间没有形成共生的组织结构，因此固氮的活动容易受许多条件的制约。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的是提供一种可以有效改善作物根系的微生态环境，促进有益微生物的生长繁殖，同时增进油菜根系对氮、磷、钾和其他有机质的吸收，促进根系的正常发育，从而促进油菜生长减少施用化学肥料，达到一种安全、绿色的种植效果的复合微生物制剂及制备方法。\n[0007] 为了实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种促进油菜生长的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：\n[0008] 第一步：将第一液体培养基在115-130℃灭菌15-30分钟后与吐温以重量比\n100∶0.3-0.5混合，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 11060、巨大芽孢杆菌(Bacillus meyaterium)ACCC 10010和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)ACCC 10649的混合物按重量比1∶50-100的比例接种于上述第一液体培养基混合物中，在\n25-35℃以150-300转/分的速度搅拌15-25分钟后密闭静置发酵3-5天，抽样检测菌体生长情况和测定pH值，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml且pH值达到3.0-4.0时停止发酵；所述第一液体培养基由以下以重量份计的原料组成：豆粕粉3-5、大豆粉2-4、玉米粉\n1-2、碳酸氢铵0.01-0.3、糖蜜2-10、磷酸二氢钾1.2-2、硫酸镁0.01-0.8、硫酸锰0.001-1、丙酸钠0.1-0.5、氯化铵0.05-0.5和无菌水75.8-90.8；\n[0009] 第二步：将第二液体培养基在115-130℃灭菌15-30分钟，先通气，通气体积比\n1∶20，再将褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 10007按重量比1∶50-100接种于第二液体培养基中，在25-35℃以150-300转/分的速度搅拌15-25分钟后静置发酵，发酵过程中持续通气，通气体积比为1∶20，抽样检测菌体生长情况，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml，停止发酵；所述第二液体培养基由以下以重量份计的原料组成：甘露醇10-20、豆粕粉2-10、糖蜜2-10、玉米粉2-10、磷酸二氢钾0.5-1、磷酸二氢钠1-2、硫酸镁\n0.3-1和无菌水46-82.2；\n[0010] 第三步：分别将第一步和第二步所得的菌种培养物分别以2000-4000转/分的转速离心5-25分钟，并在42-45℃干燥10-12小时使含水量降低到30wt％以下，将菌种培养物按比例混合，将菌种培养物混合物与微生物载体按重量比20-40∶60-80混合，在室温破碎，过60-100目筛；\n[0011] 第一步所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 11060、巨大芽孢杆菌(Bacillus meyaterium)ACCC 10010、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)ACCC 10649以及第二步所用的褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 10007的重量比为2-8∶2-8∶5-10∶1-4；\n[0012] 第三步所述的微生物载体为草木灰、膨润土或它们的混合物。\n[0013] 本发明中采用的四种菌种是从农业微生物菌种保藏管理中心购买，各菌种的信息如下：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC 11060；巨大芽孢杆菌(Bacillus meyaterium)ACCC 10010；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)ACCC 10649；\n褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 10007。\n[0014] 本发明的原理如下：本发明由多种有益微生物组成，利用他们解磷、钾、降解有毒物质、提高作物抗逆性、促进腐殖质形成等多种功效。同时还有特殊吸附功能的载体，能在土壤中长期存活，可以有效改善作物根系的微生态环境，促进有益微生物的生长繁殖，同时抑制和杀伤有害腐殖细菌或病虫害，促进根系的正常发育，从而促进油菜生长减少或停止施用化肥，达到一种安全、绿色的种植效果，产品中采用在土壤中正常生长的有益菌种，数量高达10亿/g、并含有多种活性代谢物质的种植土壤微生物生态修复改良剂。在使用后，可形成作物土壤中良性生态环境，促进作物对养分的吸收转化，改善土壤结构，抑制有害病原菌的生长和繁殖，分解土壤和作物中的残存农药。\n[0015] 土壤中含有很多钾细菌和磷细菌它们能够将土壤矿物无效态的钾和磷释放出来供植物生长发育使用，解磷的微生物种类很多目前报道的解磷细菌主要有芽孢杆菌属(Bacillus)假单胞菌属(Pseudomonas)根瘤菌属(Rhizobium)等，植物根圈有益细菌即植物促生细菌(Plant-Growth-promoting Rhizobacteria，简称PGPR)，其在植物根圈是普遍存在的，是活跃在植物根圈的多种不同的细菌，通过抑病、直接刺激植物生长、增加可利用营养、增强根瘤菌植物根部的结瘤以及产生诱导抗性等促进植物生长、增加作物产量。本发\n9\n明还将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌还进行发酵，其数量可以高达10 个/g。\n[0016] 虽然上述不同细菌和真菌可以在种植土壤中扮演“解磷、钾、降解有毒物质、提高作物抗逆性、促进腐殖质”等多个功效，但是微生物毕竟是一种简单的原核生物，它的生长、繁殖收到土壤环境中pH值、水分、温度、空气含量、等适宜生长条件的影响，同时有害病原菌如腐败细菌的生长速度比它们更快，所以提供一个安全的生长环境或载体，是发挥这些有益微生物作用的前提，其实一些简单的无机物既可以作为土壤改良剂在土壤中使用，又可以作为有益微生物的良好载体，本发明中的载体由草木灰、碳酸钙组成。这类物质具有较强的吸附能力，能将分散的土粒吸附在一起，形成土壤团聚体，起到保水、保湿的功效。\n[0017] 本发明的优点是：\n[0018] 1.采用可以促进作物根系发育和改善土壤环境多种有益细菌和真菌，合理配伍，将促进作物根系发育，解磷、钾、降解有毒物质、提高作物抗逆性、促进腐殖质形成等功效有机的结合起来；\n[0019] 2.在液体培养中还有有益菌产生的胞外酶，如蛋白酶、纤维素酶等，能迅速分解前岔植物秸秆，提高利用率，减少化肥使用；\n[0020] 3.采用常用的粮食作物及副产品为主要培养基，成本低、产品安全可靠。\n具体实施方式\n[0021] 以下结合实施例对本发明作进一步说明。\n[0022] 实施例1\n[0023] 一种促进油菜生长的复合微生物制剂，由菌种培养物20重量份和微生物载体80重量份组成；其中，所述的菌种培养物由以下以重量份计的原料组成：枯草芽孢杆菌2份、巨大芽孢杆菌2份、沼泽红假单胞菌5份和褐球固氮菌1份，以上菌种均可在中国农业微生物菌种保藏管理中心购买；所述的微生物载体为草木灰。\n[0024] 上述促进油菜生长的复合微生物制剂的制备方法的具体步骤为：\n[0025] 第一步：将第一液体培养基在115℃灭菌15分钟后与吐温-80以重量比100∶0.3混合，将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌的混合物按重量比1∶50的比例接种于上述第一液体培养基混合物中，在25℃以150转/分的速度搅拌15分钟后放入消毒后塑料桶中静置发酵3天，抽样检测菌体生长情况和测定pH值，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml且pH值达到3.0时停止发酵；\n[0026] 所述第一液体培养基由以下以重量份计的原料组成：豆粕粉3、大豆粉2、玉米粉\n1、糖蜜2、磷酸二氢钾1.2、硫酸锰0.001、丙酸钠0.2、氯化铵0.05和无菌水90.6。\n[0027] 第二步：将第二液体培养基在115℃灭菌15分钟，先通气，通气比1∶20(体积比)再将褐球固氮菌按重量比1∶50接种于第二液体培养基中，在25℃以150转/分的速度搅拌15分钟后静置发酵，发酵过程中持续通气，通气比为1∶20(体积比)，抽样检测菌体生长情况，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml，停止发酵；\n[0028] 所述第二液体培养基由以下以重量份计的原料组成：甘露醇10、豆粕粉2、糖蜜2、玉米粉10、磷酸二氢钾1、磷酸二氢钠2、硫酸镁1和无菌水82.2。\n[0029] 第三步：分别将第一步和第二步所得的菌种培养物以2000转/分的转速离心5分钟，并在42℃干燥10小时使含水量降低到30wt％以下，将菌种培养物按比例混合，将菌种培养物混合物与微生物载体按比例混合，在室温25℃破碎，过60目筛，将过筛后的产品装入有单项放气阀的包装袋中，在干燥、避光处保存。\n[0030] 实施例2\n[0031] 一种促进油菜生长的复合微生物制剂，由菌种培养物40重量份和微生物载体60重量份组成；其中，所述的菌种培养物由以下以重量份计的原料组成：枯草芽孢杆菌8份、巨大芽孢杆菌8份、沼泽红假单胞菌10份和褐球固氮菌4份，以上菌种均可在中国农业微生物菌种保藏管理中心购买；所述的微生物载体为膨润土。\n[0032] 上述促进油菜生长的复合微生物制剂的制备方法的具体步骤为：\n[0033] 第一步：将第一液体培养基在130℃灭菌30分钟后与吐温-80以重量比100∶0.5混合，将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌的混合物按重量比1∶100的比例接种于上述第一液体培养基混合物中，在35℃以300转/分的速度搅拌25分钟后放入消毒后塑料桶中静置发酵5天，抽样检测菌体生长情况和测定pH值，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml且pH值达到4.0时停止发酵；\n[0034] 所述第一液体培养基由以下以重量份计的原料组成：豆粕粉5、大豆粉4、玉米粉\n2、碳酸氢铵0.3、糖蜜10、磷酸二氢钾2、硫酸镁0.8、硫酸锰1、丙酸钠0.2、氯化铵0.1和无菌水73.6。\n[0035] 第二步：将第二液体培养基在130℃灭菌30分钟，先通气，通气比1∶20(体积比)再将褐球固氮菌按重量比1∶100接种于第二液体培养基中，在35℃以300转/分的速度搅拌25分钟后静置发酵，发酵过程中持续通气，通气比为1∶20，抽样检测菌体生长情况，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml，停止发酵；\n[0036] 所述第二液体培养基由以下以重量份计的原料组成：甘露醇20、豆粕粉10、糖蜜\n10、玉米粉10、磷酸二氢钾1、磷酸二氢钠2、硫酸镁1和无菌水46。\n[0037] 第三步：分别将第一步和第二步所得的菌种培养物以4000转/分的转速离心25分钟，并在45℃干燥12小时使含水量降低到30wt％以下，将菌种培养物按比例混合，将菌种培养物混合物与微生物载体按比例混合，在45℃破碎，过100目筛，将过筛后的产品装入有单项放气阀的包装袋中，在干燥、避光处保存。\n[0038] 实施例3\n[0039] 一种促进油菜生长的复合微生物制剂，由菌种培养物40重量份和微生物载体60重量份组成；其中，所述的菌种培养物由以下以重量份计的原料组成：枯草芽孢杆菌6份、巨大芽孢杆菌6份、沼泽红假单胞菌6份和褐球固氮菌3份，以上菌种均可在中国农业微生物菌种保藏管理中心购买；所述的微生物载体为重量比为2∶8的草木灰和膨润土的混合物。\n[0040] 上述促进油菜生长的复合微生物制剂的制备方法的具体步骤为：\n[0041] 第一步：将第一液体培养基在125℃灭菌20分钟后与吐温-80以重量比100∶0.3混合，将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌的混合物按重量比1∶100的比例接种于上述第一液体培养基混合物中，在35℃以220转/分的速度搅拌20分钟后放入消毒后塑料桶中静置发酵5天，抽样检测菌体生长情况和测定pH值，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml且pH值达到4.0时停止发酵；\n[0042] 所述第一液体培养基由以下以重量份计的原料组成：豆粕粉3、大豆粉2、玉米粉\n1、糖蜜10、磷酸二氢钾1.2、硫酸锰0.001、丙酸钠0.2、氯化铵0.1和无菌水79.5。\n[0043] 第二步：将第二液体培养基在130℃灭菌30分钟，将褐球固氮菌按重量比1∶50接种于第二液体培养基中，在30℃以230转/分的速度搅拌20分钟后静置发酵，发酵过程中持续通气，通气比为1∶20(体积比)，抽样检测菌体生长情况，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml，停止发酵；\n[0044] 所述第二液体培养基由以下以重量份计的原料组成：甘露醇10、豆粕粉5、糖蜜5、玉米粉2、磷酸二氢钾0.5、磷酸二氢钠1、硫酸镁0.5、无菌水76。\n[0045] 第三步：分别将第一步和第二步所得的菌种培养物以3000转/分的转速离心25分钟，并在45℃干燥10小时使含水量降低到25wt％以下，将菌种培养物按比例混合，将菌种培养物混合物与微生物载体按比例混合，在45℃破碎，过80目筛，将过筛后的产品装入有单项放气阀的包装袋中，在干燥、避光处保存。\n[0046] 实施例4\n[0047] 一种促进油菜生长的复合微生物制剂，由菌种培养物40重量份和微生物载体60重量份组成；其中，所述的菌种培养物由以下以重量份计的原料组成：枯草芽孢杆菌5份、巨大芽孢杆菌10份、沼泽红假单胞菌6份和褐球固氮菌3份，以上菌种均可在中国农业微生物菌种保藏管理中心购买；所述的微生物载体为重量比为1∶9的草木灰和膨润土的混合物。\n[0048] 上述促进油菜生长的复合微生物制剂的制备方法的具体步骤为：\n[0049] 第一步：将第一液体培养基在130℃灭菌20分钟后与吐温-80以重量比100∶0.5混合，将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌的混合物按重量比1∶50的比例接种于上述第一液体培养基混合物中，在35℃以200转/分的速度搅拌20分钟后放入消毒后塑料桶中静置发酵5天，抽样检测菌体生长情况和测定pH值，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml且pH值达到4.0时停止发酵；\n[0050] 所述第一液体培养基由以下以重量份计的原料组成：豆粕粉5、大豆粉4、玉米粉\n2、碳酸氢铵0.3、糖蜜14、磷酸二氢钾2、硫酸镁0.8、硫酸锰0.002、丙酸钠0.2、氯化铵0.1无菌水72.6。\n[0051] 第二步：将第二液体培养基在130℃灭菌25分钟，将褐球固氮菌按重量比1∶100接种于第二液体培养基中，在30℃以230转/分的速度搅拌20分钟后静置发酵，发酵过程中持续通气，通气比为1∶20，抽样检测菌体生长情况，当显微镜下活菌总浓度数超过10亿/ml，停止发酵；\n[0052] 所述第二液体培养基由以下以重量份计的原料组成：甘露醇8、豆粕粉5、糖蜜7、玉米粉2、磷酸二氢钾0.5、磷酸二氢钠1、硫酸镁0.5、无菌水76。\n[0053] 第三步：分别将第一步和第二步所得的菌种培养物以3000转/分的转速离心25分钟，并在45℃干燥10小时使含水量降低到25wt％以下，将菌种培养物按比例混合，将菌种培养物混合物与微生物载体按比例混合，在45℃破碎，过80目筛，将过筛后的产品装入有单项放气阀的包装袋中，在干燥、避光处保存。