一种热带假丝酵母菌Y2及其应用

1.热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2，其保藏编号：CCTCC No：M2013726。
2.权利要求1所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在生产水产养殖动物的功能性饵料添加剂中的应用，所述的水产养殖动物为花刺参或凡纳滨对虾。
3.权利要求1所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用。
4.根据权利要求3所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用，且特征在于，具体方法为：先将热带假丝酵母菌Y2培养于YPD培养基中，形成种子液，每1公斤养殖废物添加5～10公斤消毒海水，将种子液以2～5％V/W的比例添加其中，并按照质量体积比补充0～5‰的蔗糖作为碳源，室温经24～48小时培养，再自然沉降，弃上清，风干即为海水养殖废物发酵产物。
5.权利要求1所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用。
6.根据权利要求5所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用，且特征在于，具体方法为：先将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2培养于YPD培养基中，形成种子液，将种子液以2～5％V/V的比例添加到经消毒处理的海水养殖废水中，按照质量体积比添加0～5‰的蔗糖作为碳源，充分搅动混匀，室温经24～48小时培养，发酵结束后，搅动池水，以水泵分别抽出池水分别通过箍有10目、20目、40目筛绢的网笼，过滤后的水体经自然沉降4小时，得到粘稠的白色膏体即为海水养殖废水发酵产物。

一种热带假丝酵母菌Y2及其应用\n技术领域：\n[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种热带假丝酵母菌Y2及其应用。\n背景技术：\n[0002] 酵母营养丰富、大小适中，是很多生物优良的天然饵料，同时酵母也是一类腐生菌，可以分解多种物质，利用养殖水体中的有机物、氨氮、硫化氢等养殖废物，并形成优势种群，有效地抑制其它有害微生物的生长，起到生物防治的作用。近年来随着水产养殖技术的进步以及对水产动物营养需求了解的深入，酵母在水产养殖中的应用越来越广泛。\n[0003] 然而目前市场上可应用于海水养殖的酵母还非常少，常用的酵母仍然是来自于食品酿造的面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，这种来自于陆生环境的酵母并不能适应海水环境，因此不能发挥净化海水水质的作用，其对于海洋水产动物生长的影响也缺乏科学的报道。基于此种情况，迫切需要分离适应于海洋环境的单细胞酵母用于海洋水产养殖。\n另一方面，酵母的大规模培养中，通常需要一些农副产品作为原料，增加了生产成本，因此需要探索新的替代营养源，以节省成本。\n[0004] 此外，近三十年来我国海水养殖规模及产量不断增加，目前已居世界首位，然而快速发展的同时也带来了严重的环境污染问题。随着人们环保意识的提高，政府对于水产养殖的污物排放施行逐渐严格的控制，因此发展环境友好型水产养殖模式，走可持续的水产养殖发展道路成为必然趋势。目前，一些养殖废水处理方法虽然将养殖废物从水体中分离出去，但是不能有效的利用养殖废物。如何进行养殖废水、废物的资源化利用是发展环境友好型水产养殖模式必须要解决的问题。\n发明内容：\n[0005] 本发明的第一个目的是提供一种具有高营养价值、高效利用海水养殖废物、废水且能改善发酵废物风味的热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2，该菌于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC No：M2013726。\n[0006] 本发明所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2分离于广东深圳金鲳鱼养殖场排污口。酵母菌分离培养基为YPD酵母专用培养基。热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2筛选培养基为对虾养殖废物培养基。本筛选的目的是获得能在对虾养殖废物培养基快速生长的酵母种类，分离的酵母将具有在低糖或无糖条件下利用养殖废物的能力。\n[0007] 热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的菌落形态特征和细胞形态特征：菌落在YPD培养基平板上培养24小时为白色，72小时后为白色，菌落圆形突起，干燥、表面光滑或部分有皱纹，无光泽，易挑取，有酒香味，细胞球形到椭圆形，单个或多个细胞相连，见出芽(如图1所示)。\n[0008] 热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在对虾养殖废物培养基上生长状态与YPD培养基类似。\n[0009] 以酵母基因组提取试剂盒(购自Takara，China)提取DNA。PCR扩增并测序18S rDNA片段，其18S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将18S rDNA序列通过GeneBank中的BLAST软件与GeneBank数据库中的序列进行比对，热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株的\n18S rDNA序列与多个热带假丝酵母菌株的18S rDNA序列关系最近，相似度达100％，且比对得分也很高。基于热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株的18S rDNA序列及其相似序列构建的种系发生树也显示，热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株的18S rDNA序列与Candida tropicalis(JQ008834)关系最近，以92％的支持率聚为一枝，确认该酵母菌为热带假丝酵母菌的新菌株，命名为热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2，该菌种已于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC No：M2013726。\n[0010] 经实验测定本发明的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2具有丰富的营养，因此，本发明的第二个目的是提供热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在生产水产养殖动物的功能性饵料添加剂中的应用。\n[0011] 经发酵养殖废物测试，在养殖废物中添加2.5‰蔗糖的情况下，培养本发明的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2 48h后，生物量达到4.05×108cfu/g废物。但是蔗糖浓度过高时反而造成热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2的生物量下降。这与其它酵母生长要求较高的糖浓度明显不同。在热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2的分离时，发现其可以在不添加任何糖源的对虾养殖废物培养基平板上快速生长，而其它酵母不生长或生长缓慢。这一结果表明，热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2对糖分的要求低，特别适合于糖分相对缺乏的水产养殖废物和废水的资源化处置。\n[0012] 因此，本发明的第三个目的是提供热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用。\n[0013] 所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用，具体方法为：先将热带假丝酵母菌Y2培养于YPD培养基中，形成种子液。每1公斤养殖废物添加5～10公斤消毒海水，将种子液以2～5％(V/W)的比例添加其中，并按照质量体积比补充0～5‰的蔗糖作为碳源。室温经24～48小时培养，再自然沉降，弃上清，风干即为海水养殖废物发酵产物，从而达到养殖废物高值化利用目的。经发酵处理后，热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2大量繁殖，利用养殖废物积累自身的蛋白质，因此提高了养殖废物的再次作为营养物利用的价值；同时，海水养殖废物发酵产物呈现出明显的发酵香味，可以起到改善养殖废物再利用作饵料时的风味，提高动物摄食欲望，海水养殖废物发酵产物可直接作为海参、贝类等腐食及滤食经济动物的饵料。\n[0014] 本发明的第四个目的是提供热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用。\n[0015] 所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用，具体方法为：先将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2培养于YPD培养基中，形成种子液。将种子液以2～5％(V/V)的比例添加到经消毒处理的海水养殖废水中。按照质量体积比添加0～5‰的蔗糖作为碳源，充分搅动混匀，室温经24～48小时培养，发酵结束后，搅动池水，以水泵分别抽出池水分别通过箍有10目、20目、40目筛绢的网笼，过滤后的水体经自然沉降4小时，得到粘稠的白色膏体即为海水养殖废水发酵产物，得到的海水养殖废水发酵产物可以直接用于投喂水产养殖动物，也可以进一步干燥后包装成商品销售，从而达到养殖废水高值化利用目的。\n[0016] 本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC No：M2013726。\n附图说明：\n[0017] 图1是热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2培养及细胞形态图。其中a：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在YPD平板上的菌落形态；b：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2细胞形态，细胞球形或椭球形，出芽生殖，标尺＝10μm；c：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌液呈白色；d：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株在对虾养殖废物平板上的菌落形态。\n具体实施方式：\n[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。\n[0019] 实施例1：\n[0020] 一、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的分离、筛选及鉴定[0021] (1)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的分离、筛选\n[0022] 取广东深圳金鲳鱼养殖场排水口污泥1g，加入灭菌海水10ml，混匀后取200μL涂布酵母菌分离培养基(YPD)平板，YPD为酵母专用培养基，制备方法为：葡萄糖(单独灭菌)20g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，海水1L，灭菌后冷却加入1ml50mg/ml的氯霉素。30℃培养48小时后，挑取生长菌落，纯化并保存，得到分离菌。\n[0023] 将上述分离菌培养于液体YPD中，分别取1μL点种于酵母菌筛选培养基，此筛选培养基为对虾养殖废物培养基平板，其制备方法为：虾粪干粉20g，琼脂粉20g，海水1L，灭菌后稍冷，加入1ml50mg/ml的氯霉素。本筛选的目的是获得能在对虾养殖废物培养基快速生长的酵母种类，分离的酵母将具有在低糖或无糖条件下快速利用养殖废物的能力。30℃培养\n24小时后，记录生长菌落，挑出其中一株生长快、菌落大菌株记录为Y2。\n[0024] 热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的菌落形态特征和细胞形态特征：菌落在YPD培养基平板上培养24小时为白色，72小时后为白色，菌落圆形突起，干燥、表面光滑或部分有皱纹，无光泽，易挑取，有酒香味，细胞球形到椭圆形，单个或多个细胞相连，见出芽(如图1所示)。\n[0025] (2)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2分子鉴定\n[0026] 采用锚定于真菌18S rDNA基因片段的引物，进行PCR扩增，并将PCR产物测序。引物序列为：EF3：5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’；EF4:5’-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3’。\n[0027] 菌株Y2 18S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。经blast比对及种系发生分析表明：Y2菌株的18S rDNA序列与多个热带假丝酵母菌株的18S rDNA序列关系最近，相似度达100％，且比对得分也很高。基于Y2菌株的18S rDNA序列及其相似序列构建的种系发生树也显示，Y2菌株的18S rDNA序列与Candida tropicalis(JQ008834)关系最近，以92％的支持率聚为一枝，确认该酵母菌为热带假丝酵母菌的新菌株，命名为热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2，该菌种已于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC No：M2013726。\n[0028] 二、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2营养成分分析\n[0029] 采用凯氏定氮法(GB/T6432-94)对热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的蛋白质含量进行测定，在培养2d时粗蛋白含量即达到56.1％，说明热带假丝酵母Y2的主要成分为蛋白质。该菌株的蛋白含量几乎为通常用于单细胞蛋白生产的面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)中蛋白质的含量(29％)的2倍。\n[0030] 以液相色谱法(GB/T18246-2000)测定热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株氨基酸组成。其氨基酸组成见表1，结果表明：总水解氨基酸占细胞干重的45.5％％，其中必须氨基酸占总氨基酸的49.5％。水产动物饲料中赖氨酸是常见的限制性氨基酸，但是热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的赖氨酸在必须氨基酸中含量是最高的。热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2与花刺参(Stichopus herrmanni)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的氨基酸组成模式相似。热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2对花刺参的氨基酸组成计算生物价为84.1，对凡纳滨对虾氨基酸成计算生物价为82.4。\n这一结果表明热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2作为水产饵料具有良好的应用潜力。\n[0031] 表1  热带假丝酵母Y2菌株氨基酸组成及与水产生物比较\n[0032]\n[0033]\n[0034] a水产动物中的十种必须氨基酸；b必须氨基酸的总和；c花刺参的氨基酸含量参考文献(Wen等，2010)；d凡纳滨对虾的氨基酸含量参考文献(Tacon等，2002)。\n[0035] 以气相色谱法(GB/T17377-2008)测定热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2脂肪酸组成，结果见表2。由表可见，热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的脂肪酸中油酸(C18:1)含量最高，占总脂肪酸的37.2％，其次是棕榈酸(C16:0)占总脂肪酸的19.7％。\n不饱和脂肪酸含量分别高达53.8％，热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2多不饱和脂肪酸占比12.1％。由此可见热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的脂肪酸组成比例合适，具有较高的营养价值。\n[0036] 表2  热带假丝酵母Y2的脂肪酸组成(占总脂肪酸的百分比)\n[0037]\n[0038]\n[0039] a饱和脂肪酸的总和；b单不饱和脂肪酸的总和；c多不饱和脂肪酸的总和；d不饱和脂肪酸的总和；N.D.未检出。\n[0040] 三、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2固态发酵石斑鱼养殖废物生物量统计\n[0041] 取烘干的石斑鱼养殖废物2g，加水100ml，分别加入终浓度为0‰、2.5‰、5‰、10‰的蔗糖，灭菌冷却后，分别接种过夜培养的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2 1ml。\n30℃振荡培养48h。取1ml培养液，做梯度稀释后，涂布YPD平板计算养殖废物中热带假丝酵母Y2生物量。结果见表3。\n[0042] 表3.热带假丝酵母Y2固态发酵石斑鱼养殖废物生物量\n[0043]\n[0044]\n[0045] 由表3可见，当养殖废物中添加2.5‰蔗糖时，生物量达到4.05×108cfu/g废物，但是蔗糖浓度过高时反而造成热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的生物量下降。这与其它酵母生长要求较高的糖浓度明显不同。在热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的分离时，我们也发现其可以在不添加任何糖源的对虾养殖废物培养基平板上快速生长，而其它酵母不生长或生长缓慢。这一结果表明，热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2对糖分的要求低，特别适合于糖分相对缺乏的水产养殖废物和废水的资源化处理。\n[0046] 四、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用\n[0047] 将工厂化循环水海水鱼类养殖系统中经过物理过滤得到的残饵、粪便收集，晾干，再经高温80℃进行进一步的烘干及消毒，备用。\n[0048] 将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2接种于YPD培养基，30℃过夜培养，作为种子培养液。\n[0049] 将上述烘干消毒的养殖废物以质量比1：10加入消毒的海水，不添加蔗糖。再以2％(V/W)的比例加入上述种子培养液，混合均匀。室温发酵48h，期间尽量多次搅动。待自然沉降后，弃上清，自然晾干，即为即海水养殖废物发酵产物，从而达到养殖废物高值化利用目的。经发酵处理后，热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2大量繁殖，利用养殖废物积累自身的蛋白质，因此提高了养殖废物的再次作为营养物利用的价值；同时，海水养殖废物发酵产物呈现出明显的发酵香味，可以起到改善养殖废物再利用作饵料时的风味，提高动物摄食欲望，海水养殖废物发酵产物可直接作为海参、贝类等腐食及滤食经济动物的饵料。\n[0050] 五、热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用[0051] 将热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2接种于YPD培养基，30℃过夜培养，作为种子培养液。对虾集约化养殖系统中央排污系统排出的废水，集中到资源化处理池，待自然沉降24小时后，以水泵吸除上层多余的清水，只留下底部的少量污水和残饵粪便。通入臭氧进行消毒处理，清毒处理后，放置24小时，期间搅动池水多次，以助进水体曝气。以2％(V/V)的比例加入种子培养液，不加入蔗糖，充分搅动混匀，室温发酵48小时，期间尽量多次搅动。\n[0052] 发酵结束后，搅动池水，以水泵分别抽出池水分别通过箍有10目、20目、40目筛绢的网笼。由于热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2的个体相对细菌要大，过滤后的水体经自然沉降4小时，热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2自然沉降至容器底部，吸除上层海水，下层粘稠的白色膏体即为海水养殖废水发酵产物。\n[0053] 该海水养殖废水发酵产物可以直接用于投喂水产养殖动物，也可以进一步干燥后包装成商品销售。\n[0054] 实施例二：\n[0055] 将工厂化循环水海水鱼类养殖系统中经过物理过滤得到的残饵、粪便收集，晾干，再经高温80℃进行进一步的烘干及消毒，备用。\n[0056] 将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2接种于YPD培养基，30℃过夜培养，作为种子培养液。\n[0057] 将上述烘干消毒的养殖废物以质量比1：5加入消毒的海水，按照质量体积比添加\n5‰蔗糖。再以5％(V/W)的比例加入上述种子培养液，混合均匀。室温发酵24h，期间尽量多次搅动。待自然沉降后，弃上清，自然晾干，即为海水养殖废物发酵产物，从而达到养殖废物高值化利用目的。经发酵处理后，热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2大量繁殖，利用养殖废物积累自身的蛋白质，因此提高了养殖废物的再次作为营养物利用的价值；同时，海水养殖废物发酵产物呈现出明显的发酵香味，可以起到改善养殖废物再利用作饵料时的风味，提高动物摄食欲望，海水养殖废物发酵产物可直接作为海参、贝类等腐食及滤食经济动物的饵料。\n[0058] 实施例三：\n[0059] 将热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2接种于YPD培养基，30℃过夜培养，作为种子培养液。对虾集约化养殖系统中央排污系统排出的废水，集中到资源化处理池，待自然沉降24小时后，以水泵吸除上层多余的清水，只留下底部的少量污水和残饵粪便。通入臭氧进行消毒处理，清毒处理后，放置24小时，期间搅动池水多次，以助进水体曝气。以5％(V/V)的比例加入种子培养液，按照质量体积比添加5‰蔗糖，充分搅动混匀，室温发酵24小时，期间尽量多次搅动。\n[0060] 发酵结束后，搅动池水，以水泵分别抽出池水分别通过箍有10目、20目、40目筛绢的网笼。由于热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2的个体相对细菌要大，过滤后的水体经自然沉降4小时，热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2自然沉降至容器底部，吸除上层海水，下层粘稠的白色膏体即海水养殖废水发酵产物。\n[0061] 该海水养殖废水发酵产物可以直接用于投喂水产养殖动物，也可以进一步干燥后包装成商品销售。