一种用于改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物及其制备方法和应用

1.一种用于改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物，其特征在于，所述微生物添加物由具有分泌胞外多肽γ-多聚谷氨酸功能的解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus 
amyloliquefaciens)和具有合成氨基酸功能的黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)联合发酵制备而得，其中，解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens)于2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013086；黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)于2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏号为CCTCC NO：M 
2013087；发酵所用的发酵底物包括如下重量份数的组分：醋糟900～930份、(NH4)2SO4 50～
60份、K2HPO4 5～8份，MnSO4 5～8份和MgSO4 5～8份，其通过如下方法制备得到：
(1)将黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)接种到第一液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu -1
ml ，按照第一液体发酵培养基体积的5％的比例将种子接种到第一液体发酵培养基中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28～33℃，溶氧通气量范围为30～100％，
150～220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，得到黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)的发酵液；其中，所用的第一液体种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min后备用；所用的第一液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖50g，玉米粉20g，豆粉5g，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30mi后备用；
(2)将解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens)接种到第二液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，按照第二液体发酵培养基体积的5％比例将种子接种到第二液体发酵培养基中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28～35℃，溶氧通气量范围为
30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，发酵液浓度变稠，得到解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens)的发酵液；其中，所用的第二液体种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水1000ml，pH范围7.0～7.5，121℃灭菌20min后备用；所用的第二液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，豆粉30g，谷氨酸钠2g，(NH4)2SO4 6g，K2HPO4 2g，MgSO4 0.25g，MnSO4 0.2g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min后备用；
(3)配制发酵底物，所述发酵底物包括如下重量份数的组分：醋糟900～930份、(NH4)
2SO4 30～35份、K2HPO4 5～8份、MnSO4 5～8份和MgSO4 5～8份，将上述组分混合，按照发酵底物体积的6％比例接种解淀粉芽孢杆菌IAE发酵液，将发酵基质堆成2米宽、1米高的条垛，条垛中心温度65～70℃时候开始翻堆，根据外界温度发酵5～7天，然后按照条垛型发酵物体积的10％比例接种黄色短杆菌IAE到发酵条垛，按照每1000g发酵基质添加(NH4)2SO4 20～25g，再次混匀，条垛中心发酵温度40℃翻堆，发酵15～20天，得到微生物添加物。
2.权利要求1所述的一种改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物在制备用于改良滩涂盐碱地的基质中的应用。
3.一种改良滩涂盐碱土壤结构的微生物基质，其特征在于，所述的微生物基质由权利要求1所述的微生物添加物和腐熟的牛粪堆肥或者腐熟的猪粪堆肥按照体积比1:1～3混合，堆置2～5天，堆温高于40℃时候翻堆，低温烘干至基质含水量≤30wt％制备而得。
4.根据权利要求3所述的微生物基质，其特征在于，所述的微生物基质含有0.5×108cfu g-1以上解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens)和0.5×108cfu g-1以上黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)、γ-多聚谷氨酸含量≥20g kg-1干重、含水量≤
30wt％、有机质含量≥45wt％。
5.根据权利要求3所述的微生物基质，其特征在于，所述的腐熟的猪粪或牛粪堆肥为发芽指数98％以上，有机质质量比含量≥45wt％，含水量≤30wt％。

一种用于改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物及其制备方\n法和应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体地涉及一种用于改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物及其制备方法和应用。\n背景技术\n[0002] 我国有1.8万公里的大陆岸线，由于泥沙淤积形成大量滩涂土地，滩涂土壤高质量的综合开发，能够为社会带来巨大的经济效益和生态环境效益，其中滩涂土壤农地开发，能够为社会提供大量的耕地资源。\n[0003] 滩涂土壤多为潮盐砂土，土壤盐分以氯化物钠盐为主，含盐量和碱化度较高，土壤中基本不含大于0.25mm的粗砂，粉砂含量一般>50％，基本无结构。土壤粉砂颗粒遇水板结，孔隙率低，通透性差，土壤渗透系数低，导致降雨径流系数和蒸发损失高，淋洗脱盐效率低。\n[0004] 滩涂盐碱地的改良措施主要是在开沟排水的基础上种植耐盐作物减少地表蒸发、加速降水入渗和培肥土壤。为了加速土壤的结构形成，通常采用具有粘结作用、化学合成的高分子聚合物改良盐碱土壤，增加土壤中大颗粒的团聚体形成，增加土壤孔隙率，增加土壤导水系数，同时减小土壤容重，增加土壤含蓄水分的能力。化学合成大分子物质，有的物质本身难降解或者降解产物有毒，有的大分子物质容易引起土壤板结。\n[0005] 微生物改良土壤的主要功能之一就是通过次级代谢产物粘结土壤粉粒形成较大团聚体，增加土壤的孔隙度和导水能力，增加土壤的透气、透水能力，因此微生物及其次级代谢产物，作为改良滩涂盐碱土壤的材料，是化学合成高分子聚合物的一个很好补充。微生物改良土壤不会造成土壤板结，而且微生物改良过程可以直接或者间接的增加土壤的有机质含量，提升土壤地力和质量。充足的土壤热、气、营养物质对参与土壤改良的微生物的生命活力的提升，具有很大的促进作用，但是滩涂盐碱土壤尤其是新形成的滩涂盐碱土壤非常缺乏此类条件，因此，微生物的载体对于实现微生物在滩涂盐碱土壤中的活力十分重要。\n[0006] 由此可见，发明一种适用于原始滩涂盐碱地改良的微生物基质十分必要。\n发明内容\n[0007] 发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物，该微生物添加物有利于功能微生物菌株在原始滩涂盐碱土壤中存活和定殖，最大化发挥微生物改良滩涂盐碱土壤的功能。本发明还要解决的技术问题在于提供上述微生物添加物的制备方法和应用。\n[0008] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供一种用于改良滩涂盐碱土壤结构的微生物添加物，所述微生物添加物由具有分泌胞外多肽γ-多聚谷氨酸功能的解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens)，2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013086)和具有合成氨基酸功能的黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)，2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013087)联合发酵制备而得，其中，发酵所用的发酵底物包括如下重量份数的组分：醋糟900～930份、(NH4)\n2SO450～60份、K2HPO4 5～8份，MnSO4 5～8份和MgSO4 5～8份。\n[0009] 上述微生物添加物的制备方法包括如下步骤：\n[0010] (1)将黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum)接种到第一液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×\n109cfu ml-1，按照第一液体发酵培养基体积的5％的比例将种子接种到第一液体发酵培养基中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28～33℃，溶氧通气量范围为30～\n100％，150～220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，得到黄色短杆菌IAE的发酵液；\n[0011] (2)将解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens)接种到第二液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，按照第二液体发酵培养基体积的5％比例将种子接种到第二液体发酵培养基中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28～35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位\n9 -1\n≥1×10cfu ml ，发酵液浓度变稠，得到解淀粉芽孢杆菌IAE的发酵液；\n[0012] (3)配制发酵底物，所述发酵底物包括如下重量份数的组分：醋糟900～930份、(NH4)2SO4 30～35份、K2HPO4 5～8份、MnSO4 5～8份和MgSO4 5～8份，将上述组分混合，按照发酵底物体积的6％比例接种解淀粉芽孢杆菌IAE发酵液，将发酵基质堆成2米宽、1米高的条垛，条垛中心温度65～70℃时候开始翻堆，根据外界温度发酵5～7天，然后按照条垛型发酵物体积的10％比例接种黄色短杆菌IAE到发酵条垛，按照每1000g发酵基质添加(NH4)2SO4 \n20～25g，再次混匀，条垛中心发酵温度40℃翻堆，发酵15～20天，得到微生物添加物。\n[0013] 步骤(1)中，所用的第一液体种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min后备用。\n[0014] 步骤(1)中，所用的第一液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖50g，玉米粉20g，豆粉5g，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌\n30mi后备用。\n[0015] 步骤(2)中，所用的第二液体种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min后备用。\n[0016] 步骤(2)中，所用的第二液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，豆粉30g，谷氨酸钠2g，(NH4)2SO4 6g，K2HPO4 2g，MgSO4 0.25g，MnSO4 0.2g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min后备用。\n[0017] 本发明进一步提出了上述述的微生物添加物在制备用于改良滩涂盐碱地的基质中的应用。\n[0018] 具体地，本发明提出了一种改良滩涂盐碱地土壤结构的微生物基质，所述的微生物基质由上述的微生物添加物和腐熟的牛粪堆肥或者腐熟的猪粪堆肥按照体积比1:1～3混合，堆置2～5天，堆温高于40℃时候翻堆，低温烘干至基质含水量≤30wt％制备而得。\n[0019] 其中，所述的微生物基质含有0.5×108cfu g-1以上解淀粉芽孢杆菌IAE和0.5×\n108cfu g-1以上黄色短杆菌IAE、γ-多聚谷氨酸含量≥20g kg-1干重、含水量≤30％、有机质含量≥45％。\n[0020] 具体地，所述的腐熟的猪粪或腐熟的牛粪堆肥为发芽指数98％以上，有机质含量≥45wt％，含水量≤30wt％。\n[0021] 本发明利用具有增加土壤团聚体功能的微生物结合适用于滩涂盐碱地的微生物的载体，通过特定的生产工艺和后期处理工艺生产改良滩涂盐碱土壤的微生物基质。\n[0022] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：\n[0023] (1)本发明的滩涂盐碱地改良产品微生物基质采用复合微生物菌群发酵农业固体废弃物，是利用微生物合成的γ-多聚谷氨酸作为有效物质实现对土壤粉粒、粘粒的粘结，形成大的团聚体，属于微生物技术，高效环保；\n[0024] (2)产品以醋糟为主要的发酵底物，醋糟中稻壳比例很高，稻壳含有大量的木质素、硅和钙类化合物，硬度高难降解，常规农田土壤适于大量地施用该类产品的堆肥。但是该类堆肥能够增加滩涂土壤的孔隙，作为微生物载体，能够使施入滩涂盐碱地微生物获得充足的水、空气、营养等，同时，该类堆肥为酸性，微生物基质颗粒在滩涂盐碱土壤中能够形成微小的pH值偏中性的环境，有利于基质中微生物在容易板结的土壤中存活；\n[0025] (3)由于本发明的微生物基质是生物菌株和农业固体有机废弃物通过一定的工艺生产，完全没有化学改良剂的使用所带来的一系列问题，有利于滩涂土壤的可持续开发。\n附图说明\n[0026] 图1施用微生物基质对滩涂土壤栽种棉花的影响；\n[0027] 图2不同处理对棉花成活率的影响；\n[0028] 图3不同处理对棉花植株干重的影响。\n具体实施方式\n[0029] 本发明的微生物基质通过将微生物添加物和腐熟的牛粪堆肥或者腐熟的猪粪堆肥按照体积比1:1～3混合后使基质含水量低于30％制备而得，其中，微生物添加物由具有分泌胞外多肽γ-多聚谷氨酸功能的解淀粉芽孢杆菌IAE(Bacillus amyloliquefaciens IAE，简称B.amyloliquefaciens  IAE)和具有合成氨基酸功能的黄色短杆菌IAE(Brevilbacterium flavum IAE，简称B.flavum IAE)联合发酵制备而得。下面通过具体的实施例具体阐述本发明。\n[0030] 实施例1微生物基质的制备。\n[0031] (一)菌剂生产\n[0032] 1)将B.flavum IAE接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床\n9 -1\n转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10cfu ml ，种子按照5％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度30℃，溶氧通气量范围为30～\n100％，150～220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1。所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水\n1000ml，pH范围7.2，121℃灭菌20min；所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：\n葡萄糖50g，玉米粉20g，豆粉5g，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，\n115℃灭菌30min；\n[0033] 2)将B.amyloliquefaciens IAE接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照5％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度30℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，发酵液浓度变稠；所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水1000ml，pH范围7.2，121℃灭菌20min。所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，豆粉30g，谷氨酸钠2g，(NH4)\n2SO4 6g，K2HPO4 2g，MgSO4 0.25g，MnSO4 0.2g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min；\n[0034] (二)微生物基质的生产\n[0035] 1)将醋糟920g，(NH4)2SO4 32g，K2HPO4 6g，MnSO4 6g，MgSO4 7g，彻底的混合，按照发酵底物体积6％的体积比接种B.amyloliquefaciens IAE发酵液，将发酵基质堆成2米宽、\n1米高的条垛，条垛中心温度65℃时候开始翻堆，根据外界温度发酵6天。按照条垛型发酵物体积10％的体积比接种B.flavum IAE到发酵条垛，按照每1000g发酵基质添加(NH4)2SO4 \n22g，再次彻底的混匀，条垛中心发酵温度40℃翻堆，根据外界的气温，发酵10～15天。\n[0036] 2)选用腐熟的、发芽指数98％以上、有机质质量比含量≥45wt％、含水量质量比\n30wt％的猪粪，按照体积比1:1比例添加到步骤1)的发酵产物中，堆置3天，堆温高于40℃时候翻堆，低温烘干至基质含水量≤30wt％，包装出厂即为一种改良滩涂盐碱地的微生物基质。\n[0037] 实施例2微生物基质的制备。\n[0038] (一)菌剂生产\n[0039] 1)将B.flavum IAE接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照5％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度30℃，溶氧通气量范围为30～\n100％，150～220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1。所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水\n1000ml，pH范围7.2，121℃灭菌20min；所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：\n葡萄糖50g，玉米粉20g，豆粉5g，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，\n115℃灭菌30min；\n[0040] 2)将B.amyloliquefaciens IAE接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照5％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度30℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形\n9 -1\n成单位≥1×10cfu ml ，发酵液浓度变稠；所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 3g，自来水1000ml，pH范围7.2，121℃灭菌20min。所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，豆粉30g，谷氨酸钠2g，(NH4)\n2SO4 6g，K2HPO4 2g，MgSO4 0.25g，MnSO4 0.2g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min；\n[0041] (二)微生物基质的生产\n[0042] 1)将醋糟900g，(NH4)2SO4 30g，K2HPO4 5g，MnSO4 5g，MgSO4 5g，彻底的混合，按照发酵底物体积6％的体积比接种B.amyloliquefaciens IAE发酵液，将发酵基质堆成2米宽、\n1米高的条垛，条垛中心温度65℃时候开始翻堆，根据外界温度发酵6天。按照条垛型发酵物体积10％的体积比接种B.flavum IAE到发酵条垛，按照每1000g发酵基质添加(NH4)2SO4 \n22g，再次彻底的混匀，条垛中心发酵温度40℃翻堆，根据外界的气温，发酵10～15天。\n[0043] 2)选用腐熟的、发芽指数98％以上、有机质质量比含量≥45wt％、含水量质量比\n30wt％的牛粪，按照体积比1.5:1比例添加到步骤1)的发酵产物中，堆置3天，堆温高于40℃时候翻堆，低温烘干至基质含水量≤30wt％，包装出厂即为一种改良滩涂盐碱地的微生物基质。\n[0044] 实施例3微生物基质改良滩涂盐碱地盆栽实验。\n[0045] 采用盆栽实验测定微生物基质对滩涂盐碱土壤的改良效果。棉花品种采用“中棉所35”，属于耐盐品种。围垦5年的滩涂土壤，土壤上基本没有绿色植物，土壤含盐量13‰，pH \n8.5，电导率5.33μS cm-1。\n[0046] 实验设置3个处理，分别为：\n[0047] 对照组：盐碱土壤不添加任何物质；\n[0048] 醋糟堆肥组：盐碱土壤添加质量比20％的醋糟堆肥；\n[0049] 生物基质组(实施例1制备的微生物基质)：盐碱土壤添加质量比20％的微生物基质；\n[0050] 实验盆钵(直径35cm，高18cm)放入5kg盐碱土壤或者混合醋糟堆肥或者混合微生物基质的盐碱土壤，盆钵正下方有3个直径10mm的圆孔供排水。将盆钵放置于露地90天，3个处理通过喷施相同的水量保持土壤湿润，在露天放置的90天中，累积自然降水200mm。露天放置90天后，向3个处理的盆钵中移栽生长40天的棉花苗。\n[0051] 棉花移栽后50天，各处理棉花的成活情况和生长情况如图1所示。对照处理在棉花移栽的8天后全部萎蔫、干枯，醋糟堆肥处理棉花成活率16.7％，生物基质处理棉花全部成活(图2)。测定棉花植株的干重显示如图3所示，生物基质处理棉花的干重分别是对照处理和醋糟堆肥处理的33倍和26倍。土壤的含盐量测定显示，相较于原始土壤，对照处理的含盐量下降了7.6％，醋糟堆肥处理下降了38.5％，微生物基质处理下降了61.5％，微生物基质处理的含盐量5.5‰，基本可以满足棉花的生长。\n[0052] 实施例4土壤改良试验。\n[0053] 滩涂盐碱地，土壤含盐10‰，土壤的pH8.3，土壤电导率3.99μS cm-1。\n[0054] 试验地选取江苏如东滨海滩涂，试验设置两个处理，\n[0055] 1)对照处理，不施用任何基质；\n[0056] 2)生物基质处理(实施例1制备的微生物基质)，土壤施用微生物基质1000kg/亩，采用农用旋耕机翻土，彻底混匀。\n[0057] 土壤施用微生物基质时间为2013年3月，同年7月份，对照处理和微生物基质处理土壤均播种田菁，播种量为每亩5kg田菁种子。田菁收获时，测定表层0～10cm土壤的含盐量。\n[0058] 田菁栽种3个月后测定的产量显示，对照处理田菁鲜重为51kg/亩，而微生物基质处理田菁鲜重为265kg/亩，田菁植株鲜重增加了5.2倍。田菁收获后测定土壤0～10cm土层的含盐量表明，对照处理含盐量9.0‰，微生物基质处理含盐量4.4‰，相较于对照处理，土壤盐分下降了51％。