一种农田土壤微生物保水制品及其制备方法

1.一种农田土壤微生物保水制品，其特征在于所述的一种农田土壤微生物保水制品为一株合成谷氨酸菌株和一株合成γ-多聚谷氨酸菌株联合发酵腐熟的猪粪堆肥、稻草秸秆粉末和(NH4)2SO4获得的保水制品；
其中所述的合成谷氨酸菌株为黄色短杆菌 Brevibacterium flavum，2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO：
M 2013087；
所述的合成γ-多聚谷氨酸菌株为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，
2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013086。
2.根据权利要求1所述的一种农田土壤微生物保水制品，其特征在于该制品中γ-多聚谷氨酸含量高于19.6g·kg-1干制品，含有0.5×108cfu·g-1以上的黄色短杆菌CCTCC NO：M 
8 -1
2013087菌落形成单位和0.5×10cfu·g 以上的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086菌落形成单位，有机质质量比含量为30～35%，含水率低于30%。
3.根据权利要求书1或2所述的一种农田土壤微生物保水制品，其特征在于黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087的培养条件：用接种环从培养皿中挑取生长24小时的菌接种于装有
100ml培养液的250ml三角瓶中，37℃、170 rmp培养48小时，菌液上清10000rpm离心20min，测定上清液谷氨酸含量为26.6g·L-1。
4.根据权利要求3所述所述的一种农田土壤微生物保水制品，其特征在于黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087所用培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖50g，玉米浆
10ml，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。
5.根据权利要求1或2所述一种农田土壤微生物保水制品，其特征在于解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086的培养条件：用接种环从培养皿中挑取生长24小时的菌接种于装有
100ml合成γ-多聚谷氨酸培养液的250ml三角瓶中，37℃、170rmp培养48小时，菌液上清
10000rpm离心20min，测定上清液γ-多聚谷氨酸含量为21.8g·L-1。

一种农田土壤微生物保水制品及其制备方法\n[0001] 一、技术领域\n[0002] 本发明涉及制备农业土壤保水材料的微生物菌株及其通过固体发酵生产的微生物保水制品，属于微生物技术领域。\n[0003] 二、背景技术\n[0004] 农业是我国用水大户，其用水量约占全国用水总量的70%左右，农业年缺水约300亿立方，开发高效蓄水保墒技术发展占国土陆地面积约56%旱地农业，充分利用降水和地下水（包括土壤水）发展节水农业，是现代化农业发展的根本途径，应用保水材料蓄水保墒充分利用水资源是实现节水农业重要途径之一。\n[0005] 微生物固体发酵合成的吸水储水高分子聚合物的微生物有机肥，具有可降解、环境友好以及可以高附加值化处理固体有机废弃物显著减少农业面源污染的优点，是节水农业领域的一个研究热点。微生物发酵合成产物γ-多聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid)是一种大分子长链多肽，分子量在30 000D ~ 50 000D，吸水倍率可达3500倍，且重复吸水性好，广泛应用于食品、化妆品、生活吸水材料等领域。\n[0006] 大部分γ-PGA高产率微生物是谷氨酸(Glu)依赖型菌株，固体发酵基质需要添加富含谷氨酸类物质，如豆粉、干酪素、谷氨酸或者味精渣等，生产成本较高。γ-多聚谷氨酸是一种天然的大分子物质，在土壤中容易降解，导致保水效果降低。\n[0007] 微生物能够利用无机氮源（尿素、硫酸铵等）合成谷氨酸类物质，通过合成谷氨酸微生物和合成γ-多聚谷氨酸微生物的联合发酵（co-fermentation）固体有机废弃物制成生物保水制品，原料成本低，而且通过携带进入土壤的谷氨酸合成微生物在土壤中继续合成谷氨酸能够有效的维持土壤γ-多聚谷氨酸的稳定性；同时采用微生物固体发酵农业有机废弃物和无机的氮源生产的γ-PGA生物有机肥，能够通过有机质持续供应微生物能量减少功能微生物在土壤中的消亡，延长制品的保水效果。通过联合发酵工艺生产微生物土壤保水制品，能够高附加值化利用农业废弃物，能够有效的增加土壤水分保持，有利于提高农业水资源的利用效率，所制成的微生物保水制品将会有很好的应用前景。\n[0008]  三、发明内容\n[0009] 发明目的\n[0010] 本发明的目的在于提供联合发酵农业废弃物和无机氮源生产土壤保水制品的微生物菌株及其发酵制成的土壤保水制品，供农业生产利用，发展高效节水现代农业。\n[0011] 技术方案\n[0012] 本发明一种农田土壤微生物保水制品及其制作方法通过以下方案实现：\n[0013] 一种农田土壤微生物保水制品，其特征在于所述的一种农田土壤微生物保水制品为一株合成谷氨酸菌株和一株合成γ-多聚谷氨酸菌株联合发酵腐熟的猪粪堆肥、稻草秸秆粉末和(NH4)2SO4获得的保水制品；\n[0014] 其中所述的谷氨酸菌株为黄色短杆菌IAE（Brevibacterium flavum IAE），2013年\n3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013087；简称为黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087；\n[0015] 所述的γ-多谷氨酸菌株为解淀粉芽孢杆菌IAE（Bacillus amyloliquefaciens IAE），2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013086，简称为解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086。\n[0016] 该制品中γ-多聚谷氨酸含量高于19.6g kg-1干制品，含有0.5×108cfu g-1以上的黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087菌落形成单位和0.5×108cfu g-1以上的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086菌落形成单位，有机质质量比含量为30～35%，含水率低于30%。\n[0017] 所述的黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087的培养条件：用接种环从培养皿中挑取生长24小时的菌接种于装有100ml培养液的250ml三角瓶中，37℃、170 rmp培养48小时，菌液上清10000rpm离心20min，测定上清液谷氨酸含量为26.6g L-1。\n[0018] 黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087所用培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：\n葡萄糖50g，玉米浆10ml，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。\n[0019] 所述的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086的培养条件：用接种环从培养皿中挑取生长24小时的菌接种于装有100ml合成谷氨酸培养液的250ml三角瓶中， 37℃、170rmp培养48小时，菌液上清10000rpm离心20min，测定上清液γ-多聚谷氨酸含量为21.8g L-1。\n[0020] 所述的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086所用液体培养基配制方法为，以配制\n1L培养基为例：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·\n7H2O 0.25g，MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水1000 ml，pH值自然，115 ℃灭菌30min。\n[0021] 所述土壤微生物保水制品的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：\n[0022] 1）将黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087菌接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照5%比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28~33℃，溶氧通气量范围为30～100％，150~220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×\n109cfu ml-1。所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨\n10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min；所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖50g，玉米浆10ml，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水\n1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min；\n[0023] 2）将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130~160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照8%比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28~35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120~160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，发酵液浓度变稠；所用的液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min。所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·7H2O 0.25g，MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水\n1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min；\n[0024] 3）将黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087发酵液、解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M \n2013086发酵液、(NH4)2SO4、稻草粉和腐熟的猪粪堆肥按照5~8：6~10：7~13：25~35：40~55（w：\nw：w：w：w：w）彻底的搅拌混匀，条垛式堆置发酵，发酵温度为30~50℃，发酵过程中每3天翻堆\n1次，发酵15~20天后结束，使黄色短杆菌含量达到0.5×108cfu g-1以上、解淀粉芽孢杆菌含量达到0.5×108cfu g-1以上，菌株含量稳定，γ-多聚谷氨酸含量高于19.6g kg-1，获得的制品即为农业土壤微生物保水制品；\n[0025] 所述微生物土壤保水制品可用于农业作物种植土壤，增加土壤持水能力，提高水资源利用效率，增加植物产量。\n[0026] 有益效果\n[0027] 本发明提供一种能够适应干旱贫瘠土壤环境的、能够合成谷氨酸和能够合成γ-多聚谷氨酸的微生物菌株及其农业土壤保水制品的生产方法。通过对长期缺水干旱和贫瘠土壤环境中合成谷氨酸和γ-多聚谷氨酸微生物的分离获得一株高效合成谷氨酸菌株和高效合成γ-多聚谷氨酸菌株，利用这两株菌株在农业固体废弃物中的发酵和稳定程序，制成具有保水作用的微生物制品，其制品与市场制品比较具有以下优点：\n[0028] ①该菌株具有适应干旱和贫瘠土壤环境的能力，试验结果表明，施用该制品的滩涂盐碱土壤环境，经过干旱冬季和春季6个月后，土壤中合成谷氨酸的黄色短杆菌菌株和合成γ-多聚谷氨酸解淀粉芽孢杆菌菌株存活量分别大于60%和80%，能够持续合成保水物质，相较于土壤施用单一γ-多聚谷氨酸化合物或者单一的解淀粉芽孢杆菌保水制品，保水效果持续时间更久、保水能力更强。\n[0029] ②该制品含有丰富保水物质，能够增加土壤大团聚体数量、减少土壤容重、减少表层结皮、增加土壤饱和/非饱和导水率、增加水分有效性、增加比水容量。\n[0030] ③由于是生物制品，完全没有因化学制剂的使用所带来的一系列问题，有利于提高农业水资源利用效率的可持续发展。\n[0031] 四、附图说明\n[0032] 图1是黄色短杆菌菌株电镜照片。\n[0033] 图2是解淀粉芽孢杆菌菌株电镜照片。\n[0034] 图3是纯化后γ-多聚谷氨酸吸水效果图。\n[0035] 图4是保水制品的保水促生效果图。\n[0036] 五、具体实施方式\n[0037] 实施例1\n[0038] 菌株的分离和鉴定\n[0039] 采集自江苏沿海滩涂裸露滩涂中、零星生长的植株根际周围土壤低温保存，对土壤中微生物采用基础牛肉膏蛋白胨培养基分离谷氨酸合成微生物菌株，其培养基配制按照\n1L量配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min。\n[0040] 进一步通过液体培养测定合成谷氨酸的浓度筛选高效合成菌株。培养条件：接种培养皿培养24h的菌株于装有100ml 液体培养基的250ml三角瓶中，接种量104cfu ml-1，37℃、150rmp培养7天，菌液上清10000rpm离心20min，测定培养液中的谷氨酸浓度，获得谷氨酸合成量最大菌株，发酵液谷氨酸浓度26.6g L-1。该菌株属于黄色短杆菌IAE\n（Brevibacterium flavum IAE），2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013087，主要生物学特性为：菌落淡黄色，短杆状，革兰氏阳性，兼性厌氧不运动，无鞭毛，无芽孢，菌株的电镜照片如图1所示；经过16s rDNA序列的进化分析，结果显示为黄色短杆菌（B. flavum）。\n[0041] 上述合成谷氨酸液体培养基配方为：葡萄糖50g，玉米浆10ml，尿素5g，KH2PO4 3g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。\n[0042] 采集自江苏沿海滩涂裸露滩涂中、零星生长的植株根际周围土壤低温保存，采用谷氨酸培养基分离γ-多聚谷氨酸合成微生物菌株。筛选的标准为菌落在培养基上形成高的隆起，隆起物具有很强的粘性和吸水性的菌株。筛选液体发酵合成γ-多聚谷氨酸的能力最强菌株，该菌株合成γ-多聚谷氨酸量为21.8g L-1；该菌株为解淀粉芽孢杆菌IAE（Bacillus amyloliquefaciens IAE），2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2013086，主要生物学特性为：菌体呈杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，芽孢呈椭圆形，革兰氏染色阳性，培养基上菌落呈白色不透明菌落，边缘不规则，有隆起，表面褶皱，菌株电镜照片如图2所示；经过16s rDNA序列的进化分析，结果显示为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。\n[0043] 上述培养基的配方为，按照配制1L量配制：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 \n8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·7H2O 0.25g，MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。\n[0044] 菌剂生产\n[0045] 将黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照\n5%比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28~33℃，溶氧通气量范围为30～100％，150~220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1；所用的液体的种子培养基和发酵培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g,自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min。\n[0046] 将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130~160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×109cfu ml-1，种子按照8%比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28~35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120~160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×109cfu ml-1，发酵液浓度变稠。所用的液体种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，自来水1000ml，pH范围7.0-7.5，121℃灭菌20min。所用的液体发酵培养基配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·7H2O 0.25g，MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水\n1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。\n[0047] 农业土壤微生物保水制品生产\n[0048] 将黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087发酵液、解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086发酵液、(NH4)2SO4、稻草粉和腐熟的猪粪堆肥按照5~8：6~10：7~13：25~35：40~55（w：w：w：w：\nw：w）彻底的搅拌混匀，条垛式堆置发酵，发酵温度为30~50℃，发酵过程中每3天翻堆1次，发酵15~20天后结束，使黄色短杆菌CCTCC NO：M 2013087含量达到0.5×108cfu g-1以上、解淀\n8 -1\n粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2013086含量达到0.5×10 cfu g 以上，菌株含量稳定，γ-多聚谷氨酸含量高于19.6g kg-1，获得的制品即为农业土壤微生物保水制品。\n[0049] 农业土壤保水制品保水效果验证\n[0050] 供试土壤为粉砂质土壤，供试作物为油菜。\n[0051] 试验设置处理如下：处理1. 对照；处理2. 施用有机肥；处理3. 施用微生物保水制品。处理1土壤为对照，处理2土壤按照质量比10%添加有机肥，处理3土壤按照质量比10%添加微生物保水制品，有机肥、保水制品均和土壤搅拌均匀。三个处理浇水的量参照对照处理土壤出现水饱和的时候停止浇水，发现三个处理植株均表现出缺水萎蔫的时候开始浇水。测定辣椒生育期内植株的株高、鲜重和干重，辣椒收获后土壤容重、导水率、饱和含水率。\n[0052] 实验结果表明，油菜种植60天后，对照处理植株的平均株高、鲜重和干重为\n17.6cm、98.9g、6.7g；施用有机肥处理植株的平均株高、鲜重和干重为18.2cm、100.5g、\n7.2g；微生物保水制品处理植株的平均株高、鲜重和干重为22.8cm、125.7g、9.8g；相较于对照处理1，施用微生物保水制品处理植株的平均株高、鲜重和干重分别增加27.8%、27.1%和\n36.1%；相较于处理2，施用微生物保水制品处理植株的平均株高、鲜重和干重分别增加\n25.3%、25.1%和46.2%。对照、有机肥和微生物保水制品处理土壤容重分别为1.32g/cm3、\n1.27g/cm3、1.22g/cm3，土壤导水率分别为5.2mm/h、5.8mm/h、6.7mm/h，饱和含水量分别为\n36%、39%、46%，相较于对照处理，微生物保水制品处理土壤容重下降了7.5%，土壤导水率增加了28.8%，饱和含水量增加27.8%。