处理实验室耗材表面上存在的残留核酸的方法

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处理实验室耗材表面上存在的残留核酸的方法 \n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种处理耗材表面上存在的残留核酸的方法，更具体地是实验室耗材，特别是用于扩增DNA或RNA样品的实验的管和滤器。\n[0002] 更具体地，本发明的目的在于解决在实施使用聚合酶链反应(PCR)或转录介导的扩增(TMA)反应的技术时，由所述耗材表面上存在的残留核酸的特异性或非特异性扩增所引起的问题。\n[0003] 这些残留核酸一般来自环境，可以游离形式存在，或者包含在活细胞如微生物、病毒或原生动物中。\n背景技术\n[0004] 核酸扩增反应由一系列酶促反应组成，包括使得能够从最初存在于反应介质中的核酸序列合成新核酸分子的聚合酶的作用。\n[0005] 这些酶促反应的目的一般是产生最初少量存在于样品中的相同核酸序列的拷贝。\n最常使用的扩增是包括连续聚合或转录反应的那些扩增，如PCR和TMA。这类技术被广泛描述，并且是本领域技术人员公知的。使用特异性引物，它们使得能够在单个DNA或RNA模板的基础上将相同核酸序列复制非常高的次数。\n[0006] 在这类反应中，用来起始聚合反应的引物的核苷酸序列决定扩增哪个核酸序列。\n[0007] 通过扩增反应获得的核酸序列可用于分子生物学领域中的许多应用，如基因克隆、遗传性疾病的诊断或者病毒或微生物的检测[Vosberg,H.P.,(1989)The polymerase chain reaction:an improved method for the analysis of nucleic acids,Hum Genet.83(1):1-15]。\n[0008] 根据进行酶促反应的条件，特别是所用的严格性的程度(盐的浓度和杂交温度)，可能扩增这样的DNA或RNA序列，其序列与试图扩增的序列或多或少相同。\n[0009] 为了获得给定序列的非常特异性的扩增，即仅靶向具有与引入反应介质的引物的序列相同的序列的核酸，应当采用高严格性的条件。相反地，当试图扩增相对于所用的引物具有一定可变性的序列时，反应条件应当具有较低的严格性。\n[0010] 在用于微生物检测、遗传研究或感染性疾病的诊断的通用测试的情况下，考虑到个体或物种之间序列的差异，常常必须寻找相对于所探寻的序列类型具有一定可变性的核酸序列。为此，通常必需求助于较低的严格性，使得能够考虑遗传多样性。\n[0011] 然而，在低严格性条件下进行的测试具有扩增来自研究样品外源性的残留核酸的序列的风险。“假阳性”的出现由此所致，其可以大大地扭曲测试结果。\n[0012] 在微生物的通用检测的情况下，与来自环境的残留核酸的存在相关的假阳性的风险非常高[Schmidt,T.,Hummel,S.,Hermann,B.,1995,Evidence of contamination in PCR laboratory disposables;Naturwissenschaften82]。\n[0013] 在法医学中，当试图在罪犯的遗传指纹的基础上确认其身份时，也有非零的风险，实验室中使用的管或设备可能被另一个人的DNA污染，或者甚至被操作者的DNA污染。因此难以肯定地建立该罪犯的DNA谱。\n[0014] 因为这些原因，扩增核酸专用的装置完全去除可扩增的残留核酸是非常重要的。\n[0015] 一般来说，用于分子生物学反应的消耗性产品，包括DNA或RNA的扩增反应涉及的那些消耗性产品在进行常规灭菌的最终步骤之前在洁净室中制造以确保不存在微生物。\n[0016] 然而，这些常规灭菌方法不足以消除来自耗材表面的所有可扩增的核酸。\n[0017] 不含人DNA、RNA、DNA酶、RNA酶和其他PCR抑制剂的耗材可以接受“PCR清洁”标签。然而这并不表示它们不含来自环境的细菌核酸。可以使用诸如核酸内切酶的酶或诸如补骨脂素的化学产物以使得残留核酸分子不可扩增。\n[0018] 然而，这类产品或酶可以与扩增反应中使用的试剂和样品不良地相互作用。\n[0019] 去除残留的可扩增的核酸的其他方法使用电离辐射(紫外线(UV)、gamma(γ)、X-射线和beta(β))，但是为了更有效，暴露的持续时间必须为几个小时，这使得该过程非常昂贵，并且最重要的是，这降解或削弱制备耗材的材料。此外，电离辐射的操作受到严格管理，这限制其实施的可能性。\n[0020] 目前，为了灭菌其耗材，申请人使用名为 (Johnson&Johnson)的商业化过氧化氢处理方法。过氧化氢是一种氧化性气体，其使得能够通过氧化来破坏微生物的细胞组分，特别是蛋白，并且在较少程度上破坏核酸。 方法使用低温下的气体形式的90%过氧化氢。根据这种方法，将真空相施用于室，待处理的耗材位于该室中，从而气相穿透并通过待处理的装置的所有部件内。在循环结束时，再次施用真空阶段，而通过施用电场和等离子体的形成来使过氧化氢分子电离。Sterrad方法的优点之一是可以将装置灭菌，同时所述装置预包装在塑料小袋中。所述小袋包含过氧化氢可渗透的非织造合成的表面( )。\n[0021] 然而，申请人发现这种方法并不完全破坏包含在装置内的残留核酸。因此，方法仅部分地满足申请人的需要。\n[0022] 应当注意到申请人专业从事制造适用于微生物检测测试的包含滤膜的膜过滤装置。这些微生物检测测试通常在通过已无菌的所述装置过滤液体样品之后通过PCR扩增来进行。\n[0023] 这些装置通常由复杂的装置组成，包含导管、罐和滤膜，这使得它们的处理更困难。\n[0024] 申请人已应用 方法几次以试图完全消除装置中存在的残留核酸。然而，扩增仍显示来自微生物的核酸未完全消除(图3B)。\n发明内容\n[0025] 因此申请人进行研究以改进前述方法，以开发处理那些装置中存在的残留核酸的方法，所述方法具有以下条件：(i)不损坏构成装置的材料，特别是膜和滤器(例如：聚丙烯、PES、PVDF)，以及(ii)没有抑制那些装置适用的核酸扩增反应的效果。\n[0026] 许多次测试后，申请人已确定待处理的表面的两步去污处理允许满足 上文提到的条件。\n[0027] 所开发的方法包括通过气相环氧乙烷处理的第一步，然后用液相或气相过氧化氢处理的第二步。申请人发现这两步的组合使得能够比现有技术更完全去污。\n[0028] 具体地，通过比较测试，申请人发现处理装置的两步的效果是消除任何不期望的扩增，甚至在残留核酸最初包含在微生物中时也是如此，这在仅进行处理步骤之一时是不可以实现的。\n[0029] 本发明的不同模式和由此所致的优点在下文中详述。\n附图说明\n[0030] 图1：比较应用于最初包含在微生物(表皮葡萄球菌(S.epidermis))中的残留DNA的不同去污处理的图。接受各种处理之前将耗材(1.5ml管)的表面用相同数量的表皮葡萄球菌细胞污染。NS(浅灰色)：未处理。EO(中灰色)：通过气相环氧乙烷处理。\nEO+H2O2(l)(黑色)：根据本发明通过气相环氧乙烷然后通过液体溶液中的过氧化氢(30%)处理。Neg.(深灰色)：未被表皮葡萄球菌污染的阴性对照。为了检测可能的来自表皮葡萄球菌的残留DNA，然后将这样处理的表面漂洗，并且对漂洗产物进行PCR反应(40个循环)。\n曲线代表通过荧光检测的扩增的DNA的量。\n[0031] 图2：比较应用于最初包含在微生物(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))中的残留RNA的不同去污处理的图。在接受各种处理之一之前将耗材(1.5ml管)的表面用相同数量的铜绿假单胞菌细胞污染。2A：EO(中灰色)：通过气相环氧乙烷处理。γ(深灰色)：用γ辐射处理。NS(浅灰色)：未处理。2B：EO+H2O2(l)(黑色)：用气相环氧乙烷然后用溶液中的过氧化氢(30%)处理。γ+H2O2(l)(深灰色)：通过γ辐射然后用溶液中的过氧化氢(30%)处理。NS+H2O2(l)(浅灰色)：仅用溶液中的过氧化氢(30%)处理。NS(浅灰色)：未处理。为了检测可能的来自铜绿假单胞菌的残留RNA，然后将这样处理的表面漂洗，并且对漂洗产物进行TMA反应(76个循环)。曲线代表通过荧光检测的扩增的RNA的量。\n[0032] 图3：比较应用于最初包含在微生物(痤疮丙酸杆菌(P.acnes))中的残留RNA的不同去污处理的图。在接受各种处理之一之前将耗材的表面用相同 数量的痤疮丙酸杆菌细胞污染。3A：EO+H2O2(l)(黑色)：通过气相环氧乙烷然后通过气相过氧化氢( )处理。NS(浅灰色)：未处理。3B：H2O2(g)+H2O2(g)(黑色)：包括通过气相过氧化氢()处理的两个循环的处理。NS(浅灰色)：未处理。为了检测可能的来自痤疮丙酸杆菌的残留RNA，然后将这样处理的表面漂洗，并且对漂洗产物进行TMA反应(76个循环)。曲线代表通过荧光检测的扩增的RNA的量。\n[0033] 图4：比较应用于最初包含在微生物(G.stearothermophilus)中的残留DNA的不同去污处理的图。在接受各种处理之一之前将耗材(包含几个滤器的过滤单元)用相同数量的G.stearothermophilus孢子污染。NS(浅灰色)：未处理。EO+H2O2(g)(黑色)：根据本发明用气相环氧乙烷然后通过气相过氧化氢(90%)处理。\n具体实施方式\n[0034] 本发明涉及一种处理物体如分子生物学中的消耗性产品的表面上存在的可扩增的残留核酸的方法，其联合使用气态环氧乙烷处理的阶段以及使用液相或气相过氧化氢处理的第二阶段。\n[0035] 这种方法优选包括以下步骤：\n[0036] i)用气相环氧乙烷处理所述耗材的表面；然后\n[0037] ii)用液相或气相过氧化氢处理所述表面。\n[0038] 术语“耗材”在本文中用来表示用于核酸的操作的任何物体，从环境到实验室中它们的集合。耗材可以由不同材料制成。\n[0039] 本发明涉及的耗材更具体地是包含滤膜的塑料过滤装置，所述滤膜优选聚丙烯、PES或PVDF的，例如申请人商业化的那些过滤装置。\n[0040] 所述耗材更具体地在为了进行核酸扩增的操作的情况下使用，特别是通过这样的技术，如优选在DNA样品的基础上进行的PCR，或者优选对RNA样品进行的TMA。\n[0041] 所述方法的第一步i)一般在密闭室(例如Steri-Vac5XL,3M)中，利用优选大于\n75%、更优选60%-99%、并且仍然更优选70%-90%(v/v)的气态环氧乙烷的浓度常规地进行[Pittet et al.1997,Swiss Noso,4(1)]。\n[0042] 除非另有说明，浓度为体积比体积百分比(%v/v)。\n[0043] 因为环氧乙烷为小分子，其穿透能力高，这又使得能够处理预包装于透气性包装中的耗材。这种穿透能力解释了其在灭菌难以接触的复杂物体中的高效率。环氧乙烷还到达活材料的主要组分(DNA、蛋白质、维生素、酶)，这赋予其高灭菌能力。因此用环氧乙烷处理对所有活细胞具有活性，并且因此具有灭菌效果。处理的有效性受几个参数影响：\n气体的相对湿度，其优选大于或等于30%；以及温度，其优选为40°C-60°C，并且更优选\n50°C-60°C。\n[0044] 取决于假定的孢子和微生物的浓度以及构成耗材的材料，气态环氧乙烷与耗材表面之间接触的持续时间在1小时至6小时之间变化。当事先在待处理的耗材内或周围向处理室施用真空时，这种气相中的处理更有效。\n[0045] 根据本发明，用过氧化氢处理的步骤ii)在液相中使用水溶液进行，或者在气相中进行。\n[0046] 当步骤ii)的过氧化氢为液相时，其浓度优选为25%-60%。根据本发明人进行的实验已证实大于或等于30%的浓度是最佳的(表3)。\n[0047] 在液相中处理具有溶解残留核酸的优点。此外，在这种情况下，液流通过滤器使得其可能更有效地到达位于构成那些滤器的多孔材料中的残留核酸。\n[0048] 当加热至50°C-70°C的温度，优选大于60°C时，液相过氧化氢更有效。\n[0049] 这个温度具有不损坏构成耗材的材料的优点。\n[0050] 一般使液相过氧化氢与待去污的表面接触优选至少40分钟的时间，优选40分钟-1小时。这个时间大于在下文所述的气相中处理的时间，并且一般需要干燥阶段以从耗材表面消除过氧化氢。\n[0051] 步骤ii)的用气相过氧化氢处理是通过过氧化氢的蒸发来进行，优选使其浓度为大于总气体的30%，优选大于50%，并且更优选大于80%。\n[0052] 过氧化氢可以通过施用电场而被转换为等离子体状态，优选在低于70°C的温度下，更优选低于60°C，这使得其降解并因此在处理结束时失活。\n[0053] 上文所示的温度低于常规灭菌方法的温度，更好地保护可以构成耗材的材料的质量，特别是可以组成它们的膜或滤器。\n[0054] 这样的方法可以在专用于利用气相过氧化氢的处理的装置中进行，如 方法(ASP–Johnson&Johnson)，按照那些装置的制造商的推荐进 行。\n[0055] 方法构成步骤ii)的可能但非限制性的实施方案。气相过氧化氢的实施具有能够用于预包装于透气包装中的耗材的优点。因此，当本发明的方法的两个步骤在气相中进行时，在进行这两个步骤之前可以将耗材包装或预包装。\n[0056] 在一实施方案中，本发明的方法还包括在步骤i)和步骤ii)之间的蒸发步骤。在进一步的实施方案中，本发明的方法还包括将分子生物学中的耗材事先包装于部分非织造包装中。在优选的实施方案中，本发明的方法还包括在步骤i)和步骤ii)之一之前施用真空。在进一步优选的实施方案中，本发明的方法还包括在步骤i)和步骤ii)之间消除残留的环氧乙烷。\n[0057] 相似地，当用过氧化氢处理在气相中进行时，步骤i)和ii)可以在相同处理室中互相接替地进行，这限制耗材与环境的残留核酸的接触。\n[0058] 本发明人获得的结果在下文本申请的实施例中说明。图1-4示出本发明的方法使得可能获得残留核酸的更有效处理，无论它们的来源(细胞或游离的)、它们的性质(RNA或DNA)或者设想的扩增模式(PCR或TMA)。这样的有效性水平由本发明的步骤i)和ii)的组合以及它们进行的顺序所致。\n[0059] 本发明的方法导致不含可扩增的核酸的处理的耗材，这在以前是不可能获得的，特别是关于包括一个或多个滤器或膜的耗材，所述滤器或膜优选是聚丙烯、PES或PVDF的。\n[0060] 具体地，因此本发明使得能够在分子生物学中获得不含细菌来源的核酸(保证不含DNA)的耗材，无论其是简单或复杂的。\n[0061] 实施例\n[0062] 方案1\n[0063] 将由1.5ml聚丙烯管组成的几个耗材用已知量的DNA、RNA或微生物平行污染。\n然后将这些耗材γ-灭菌(剂量为0-60kGy)或者用气相环氧乙烷处理。灭菌之后，通过PCR(用于DNA)和TMA(用于RNA)确定残留核酸的存在，并且与未灭菌的对照耗材比较。\n[0064] 获得的结果在下文表1中总结。\n[0065] 表1：通过环氧乙烷(EO)和通过γ辐射进行的残留核酸处理的有效性[0066] \n[0067] 这些结果显示γ处理不完全降解微生物中包含的RNA，也不完全降解游离形式的RNA。对于DNA，这仅部分降解。用环氧乙烷处理有效针对游离形式的RNA，但是对包含在微生物中的RNA没有效果。\n[0068] 方案2\n[0069] 将如方案1所用的相同类型的几个耗材用相同的已知量的DNA、RNA或微生物污染。然后用制备于液体溶液中的过氧化氢(各3%和30%H2O2)处理这些耗材。在该方法结束时通过在60°C的温度下于真空下干燥的步骤将过氧化氢蒸发。处理之后，通过PCR(用于DNA)和TMA(用于RNA)确定残留核酸的存在，并且与未处理的样品比较。\n[0070] 获得的结果在下文表2中总结，其中(-)表示无效，(++)表示核酸的部分降解，而(+++)表示它们完全降解。\n[0071] 表2：通过3%和30%溶液中的过氧化氢进行的残留核酸处理的有效性[0072] \n[0073] *对核酸作用的最小时间60°C下40min\n[0074] 这些结果显示浓度30%的H2O2比浓度3%的H2O2更有效地使得游离核酸降解。然而，该处理对微生物中包含的核酸没有效果。\n[0075] 方案3(根据本发明)\n[0076] 将如方案1所用的相同类型的几个耗材用相同的已知量的DNA、RNA或微生物污染。然后根据本发明将那些耗材的一部分用气态环氧乙烷然后用3%或30%过氧化氢处理。\n将另一部分用γ辐射处理，代替用气态环氧乙烷然后用过氧化氢处理。在两种情况下，通过在60°C的温度下的真空干燥步骤将过氧化氢蒸发。处理之后，通过PCR(用于DNA)和TMA(用于RNA)确定残留核酸的存在，并且与未处理的样品比较。\n[0077] 获得的结果在下文表3中总结，其中(-)表示无效，(++)表示核酸的部分降解，而(+++)表示它们完全降解。这些结果显示，在一定程度上，γ+H2O2处理使得核酸降解，但是这种方法的性能不如EO+H2O2，特别是对于包含在微生物中的RNA。通过环氧乙烷然后用30%过氧化氢溶液处理使得微生物中包含的DNA和RNA完全降解，而仅用3%H2O2的相同处理对DNA效率较低，并且对RNA完全无用。\n[0078] 表3：包含在微生物中的残留核酸的处理的有效性\n[0079] \n[0080] *在60°C下接触1h\n[0081] 方案4\n[0082] 将 包括 几 个 滤 器 的 几 个复 杂 耗 材 用 相 同 的已 知 量 的 微 生 物(G.stearothermophilus)污染。然后根据本发明的方法将那些耗材的一部分用气态环氧乙烷然后用约90%的气态过氧化氢处理。用作对照的另一部分的耗材未处理。通过PCR确定残留核酸(DNA)的存在。图4记录不同PCR循环中扩增的DNA的量。可以注意到处理的样品中不存在扩增。