一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治桃流胶病中的应用

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H47，保藏编号为CCTCC NO:M2013283。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在防治桃流胶病中的应用，其特征在于：用该菌株进行液体发酵制备抗流胶病生物制剂，施用于桃树。
3.根据权利要求2所述解淀粉芽孢杆菌在防治桃流胶病中的应用，其特征在于所述液体发酵工艺如下：
（1）斜面菌种活化：将所述解淀粉芽孢杆菌划线接种于斜面培养基，于28～31℃培养
24～36h；所述斜面培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～10，酵母膏4～5，NaCl9～10，琼脂19～21，其余成分为水，pH6.5～7.0;
（2）种子培养：将步骤（1）所述斜面培养基上生长的菌种转移接种至种子培养基，于
28～31℃，150～250r/min振荡培养12～24h；所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～10，酵母膏4～5，NaCl9～10，其余成分为水，pH6.0～7.0；
（3）液体深层发酵培养：将步骤（2）所得活化种子液按体积百分比2～8%的接种量，接种至发酵培养基中，于28～31℃,200～350r/min振荡培养48～72h，通气量
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1～4L/min，得到发酵液，稀释该发酵液至孢子浓度为10～10 个/ml，即得抗流胶病生物制剂成品；所述发酵培养基成分按克/升计为：葡萄糖15～25，L-谷氨酸钠3～7，KH2PO41～2，MgSO4·7H2O0.3～0.8，FeSO4·7H2O0.001～0.002，MnSO4·H2O0.001～0.002，CuSO4·5H2O0.001～0.002，pH6.0～7.0。
4.根据权利要求3所述解淀粉芽孢杆菌在防治桃流胶病中的应用，其特征在于：所述
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抗流胶病生物制剂成品中的孢子浓度为10个/ml。

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治桃流胶病中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于微生物和发酵技术领域，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌及该菌株在防治桃流胶病中的应用。\n背景技术\n[0002] 桃流胶病（peachtreegummosis）又称瘤皮病或皮病，是在全球范围内危害桃树的一种疾病。我国桃园桃流胶病普遍发生且危害严重，该病能引起桃主干、主枝树皮上产生胶状溢出物，溢出物初期为无色透明，后变成黄褐色至深褐色，大量胶体溢出造成桃树树势衰弱，进而导致果实产量和品质下降，严重时引起枝干枯死断裂，甚至整树死亡。20世纪70年代以前，桃流胶病一直被认为是桃的一种生理性病害，直到1974年Weaver首次发现并报道了桃流胶病的病原菌为Botryosphaeriadothidea(Moug.exFr.)Ces.&deNot.（Weaver,D.(1974).AgummosisdiseaseofpeachtreescausedbyBotryosphaeriadothidea.Phytopathology,64(12),1429-1432.），确定桃流胶病为一种侵染性植物病害，其病原微生物为葡萄座腔菌属真菌。\n[0003] 目前，防治桃流胶病常用“多菌灵”、“百菌清”或石硫合剂等药剂。为达到较佳的病害防治效果，必须长期大量施用上述药剂，不仅易使病原菌获得耐药性，还致使水果和土壤中的农药残留严重超标，影响水果品质，而残留农药又可随雨水不断渗入地下水，造成更深层次的污染问题。\n[0004] 鉴于化学农药的大范围使用对农作物、空气、水源和土壤造成严重污染的现状，利用微生物或微生物制品对植物病害进行生物防治成为替代化学农药最具潜力的一种方法之一。目前已有为防治植物病害开发的微生物或生物制剂，并取得了一定的防治效果，但专门针对桃流胶病防治的微生物或生物制剂至今尚未见报道。\n发明内容\n[0005] 针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种对葡萄座腔菌具有极强拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H47，保藏编号为CCTCCNO:M2013283。\n[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌在防治桃流胶病中的应用，即用该菌株进行液体发酵制备抗流胶病生物制剂，施用于桃树。\n[0007] 所述液体发酵工艺如下：\n[0008] （1）斜面菌种活化：将所述解淀粉芽孢杆菌划线接种于斜面培养基，于28～30℃培养24～36h；所述斜面培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～10，酵母膏4～5，NaCl9～\n10，琼脂19～21，其余成分为水，调整pH值至6.5～7.0;\n[0009] （2）种子培养：将步骤（1）所述斜面培养基上生长的菌种转移接种至种子培养基，于28～30℃，150～250r/min振荡培养12～24h；所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～10，酵母膏4～5，NaCl9～10，其余成分为水，调整pH值至6.0～7.0；\n[0010] （3）液体深层发酵培养：将步骤（2）所得活化种子液按体积百分比2～8%的接种量，接种至发酵培养基中，于28～30℃,200～350r/min振荡培养48～72h，通气量2L/\n5 8 5\nmin，得到发酵液，稀释该发酵液至孢子浓度为10～10 个/ml，优选为10 个/ml，即得抗流胶病生物制剂成品；所述发酵培养基成分按克/升计为：葡萄糖15～25，L-谷氨酸钠\n3～7，KH2PO41～2，MgSO4·7H2O0.3～0.8，FeSO4·7H2O0.001～0.002，MnSO4·H2O0.001～\n0.002，CuSO4·5H2O0.001～0.002，调整pH值至6.0～7.0。\n[0011] 本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H47，已于2013年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：CCTCC NO:M2013283，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称：解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283。\n[0012] 本发明的有益效果如下：\n[0013] 本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283，试验证明，无论是该菌株本身或是通过本发明液体发酵工艺制备得到的无菌体、无芽孢发酵液，均可对桃流胶病病原葡萄座腔菌产生较强的拮抗作用，抑制活性高；将上述发酵液进一步加工（稀释至孢子浓度105～108个/ml）得到抗流胶病生物制剂并喷施于受流胶病侵害的桃树，证明该制剂对桃树流胶病起到了显著的防治效果，发病率可降低20%，病情指数可降低55%。综上，本发明成功研制出首款专门针对桃流胶病防治的高效生物制剂，与传统化学药剂相比，其具绿色安全，环境友好等优势，在流胶病生物防治方面拥有广阔的应用前景。\n附图说明\n[0014] 图1为解淀粉芽孢杆菌各测试菌株对葡萄座腔菌的体外拮抗实验结果图，其中，H43、H44、H45、H47、H48为菌株编号。\n具体实施方式\n[0015] 以下结合附图，并通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。\n[0016] 本发明实施例所涉及试验材料如下：\n[0017] 菌株\n[0018] 葡萄座腔菌购自美国模式菌种收集中心（ATCC)，保藏编号：ATCC No.38026，以下简称葡萄座腔菌，于4℃PDA斜面培养基保存。\n[0019] 培养基\n[0020] LB平板/斜面培养基配方（以g/L计)：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl10，琼脂1.5，蒸馏水补齐1000mL,pH7.0；\n[0021] PDA平板/斜面培养基配方（以g/L计)：土豆200，葡萄糖20，琼脂18～20，pH自然。\n[0022] 其它原料和试剂为市售国产或进口分析纯商品。\n[0023] 所使用仪器设备均为本领域常规仪器设备。\n[0024] 实施例1解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283的分离、筛选和鉴定[0025] 1.1解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283的分离筛选\n[0026] （1）于2012年3月自中国广西扶缓县采集未经加工的桉树原蜜样本；\n[0027] （2）将上述原蜜样本用灭菌生理盐水稀释至75%（w/w)，取200μL涂布于LB琼脂培养基上，置于培养箱30℃培养72h，挑取长出的单菌落至新鲜的LB平板培养基进行划线分离纯化，30℃培养48h，再挑取单菌落至LB斜面培养基，4℃保存。\n[0028] （3）接种桃流胶病病原菌葡萄座腔菌至PDA培养基上，于25～30℃培养4～6d；\n切取葡萄座腔菌菌落边缘5～10mm菌饼，接种至新配制的PDA平板培养基中央；\n[0029] （4）将步骤（2）中保存的各个单菌落点接到步骤（3）中接种葡萄座腔菌菌饼的PDA平板培养基中，并距离菌饼2～3cm，25～30℃培养2～5d，挑取对葡萄座腔菌具有最强拮抗能力的菌株（产生抑菌圈最大)，如图1所示，取编号H47菌株，4℃保存。\n[0030] 1.2解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283的鉴定\n[0031] （1）形态学特征\n[0032] H47菌株在LB平板培养基上生长24h，形成白色较大菌落，不透明，直径4～8mm，表面褶皱，中央凸起，边缘不整齐，可扩散生长；油镜观察呈短杆状。\n[0033] （2）生理生化特征\n[0034] 依据《伯杰氏手册》（R.E.布坎南，N.E.基本斯等编，科学出版社，1984）所述鉴定方法，对H47菌株进行生理生化鉴定，其主要生理生化特征参见表1。\n[0035] 表1H47菌株主要生理生化特征\n[0036] \n试验项目 结果\n革兰氏染色 +\n芽孢着生部位 居中\n淀粉水解 +\nV-P +\n过氧化氢酶 +\n反硝化 +\n柠檬酸盐利用 +\n麦芽糖 +\n半乳糖 +\n果糖 -\n[0037] 注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。\n[0038] （3）遗传学特征\n[0039] 将H47菌株接种于LB培养基，于200rpm，30℃振荡培养8～10h，离心收集菌体，重悬后加入溶菌酶破壁，用裂解液破除细菌细胞膜以释放胞内核酸，经酚/氯仿/异戊醇法去除蛋白质及多糖，并用无水乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA。以该提取DNA为模板，利用PCR扩增该菌株的16SrDNA，其中，上游引物：5’-ATGGATCCGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（引物序列如SEQIDNO:1所示）,下游引物：5’-TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTGT-3’（引物序列如SEQIDNO:2所示）。PCR扩增产物经纯化后交由南京金斯瑞科技有限公司进行序列测定，通过测序分析得到该菌株的16SrDNA的碱基序列，如SEQIDNO:3所示。将该序列提交GeneBank进行序列比对和同源性分析，证明该菌株的16SrDNA碱基序列在Genbank中BacillusamyloliquefaciensML265（登入号：KC692168.1）之间具有99%的同源性。\n[0040] 上述鉴定结果证明：H47菌株特征以及生理生化特征上与解淀粉芽孢 杆 菌（Bacillusamyloliquefaciens）相 吻 合，与 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Bacilus amyloliquefaciensML265比对，在16SrDNA碱基序列方面具有99%的同源性，因此可判定本发明H47菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）。\n[0041] 实施例2解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283菌株对葡萄座腔菌的拮抗作用检测[0042] 将斜面保存的葡萄座腔菌接种于PDA平板培养基，在30℃光照条件下活化7d，待葡萄座腔菌长满平板，结束培养，用已灭菌的直径12.00mm的打孔器在活化的病原菌菌落边缘打一菌饼，将菌饼正面向上放置于对峙培养平板的一侧，靠近皿壁约1cm，用接种针挑取一环在LB斜面培养基上活化24h的解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283，在对峙平板内平行于菌块划一条菌线，将对峙培养平板放入30℃培养箱培养，于5d后记录抑菌带宽度。\n[0043] 试验结果：抑菌带的宽度为12.3mm，证明解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283菌株对葡萄座腔菌具有较强的拮抗作用，抑制活性高。\n[0044] 实施例3解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283发酵液和抗流胶病生物制剂的制备[0045] 3.1制备实例1\n[0046] （1）斜面菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283划线接种于斜面培养基，于28℃培养36h；所述斜面培养基成分按克/升计为：蛋白胨9，酵母膏4，NaCl9，琼脂\n19，其余成分为水，调整pH值至6.5;\n[0047] （2）种子培养：将步骤（1）所述斜面培养基上生长的菌种转移接种至种子培养基，于28℃，150r/min振荡培养24h；所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9，酵母膏4，NaCl9，其余成分为水，调整pH值至6.0；\n[0048] （3）液体深层发酵培养：将步骤（2）所得活化种子液按体积百分比2%的接种量，接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，终体积2L，于28℃,200r/min振荡培养72h，通气量\n6\n1L/min，得到发酵液，用水稀释该发酵液至孢子浓度为10个/ml，即得抗流胶病生物制剂成品；所述发酵培养基成分按克/升计为：葡萄糖15，L-谷氨酸钠3，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.3，FeSO4·7H2O0.001，MnSO4·H2O0.001，CuSO4·5H2O0.001，调整pH值至6.0。\n[0049] 3.2制备实例2\n[0050] （1）斜面菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283划线接种于斜面培养基，于29℃培养32h；所述斜面培养基成分按克/升计为：蛋白胨9.5，酵母膏4.5，NaCl9.5，琼脂20，其余成分为水，调整pH值至7.0;\n[0051] （2）种子培养：将步骤（1）所述斜面培养基上生长的菌种转移接种至种子培养基，于29℃，200r/min振荡培养18h；所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9.5，酵母膏\n4.5，NaCl9.5，其余成分为水，调整pH值至7.0；\n[0052] （3）液体深层发酵培养：将步骤（2）所得活化种子液按体积百分比5%的接种量，接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，终体积2L，于29℃,250r/min振荡培养60h，通\n5\n气量2L/min，得到发酵液，用水稀释该发酵液至孢子浓度为10个/ml，即得抗流胶病生物制剂成品；所述发酵培养基成分按克/升计为：葡萄糖20，L-谷氨酸钠5，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.0015，MnSO4·H2O0.0015，CuSO4·5H2O0.0015，调整pH值至\n7.0。\n[0053] 3.3制备实例3\n[0054] （1）斜面菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283划线接种于斜面培养基，于30℃培养24h；所述斜面培养基成分按克/升计为：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，琼脂21，其余成分为水，调整pH值至7.0;\n[0055] （2）种子培养：将步骤（1）所述斜面培养基上生长的菌种转移接种至种子培养基，于30℃，250r/min振荡培养12h；所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，其余成分为水，调整pH值至7.0；\n[0056] （3）液体深层发酵培养：将步骤（2）所得活化种子液按体积百分比8%的接种量，接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，终体积2L，于30℃,350r/min振荡培养48h，通气量\n7\n4L/min，得到发酵液，用水稀释该发酵液至孢子浓度为10个/ml，即得抗流胶病生物制剂成品；所述发酵培养基成分按克/升计为：葡萄糖25，L-谷氨酸钠7，KH2PO42，MgSO4·7H2O0.8，FeSO4·7H2O0.002mg/L，MnSO4·H2O0.002mg/L，CuSO4·5H2O0.002mg/L，调整pH值至7.0。\n[0057] 实施例4解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283无菌体、无芽孢发酵液对葡萄座腔菌的拮抗作用检测\n[0058] 无菌体、无芽孢发酵液的制备：将实施例3/制备例2制备得到的发酵液于\n6000rpm离心15min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，备用。\n[0059] 将保存于斜面的葡萄座腔菌接种于PDA平板培养基中于25～30℃培养4～6d，切取葡萄座腔菌菌落边缘5～10mm菌饼，接种至新配制的PDA培养基中央，距离菌饼2～\n3cm处用打孔器打孔，加180μL除菌发酵上清液入孔，检测发酵液对葡萄座腔菌的拮抗效果。试验结果：孔边缘距离葡萄座腔菌菌丝边缘距离达14.0mm。\n[0060] 将保存于斜面的葡萄座腔菌接种于PDA平板培养基，在30℃光照条件下活化10d，待葡萄座腔菌长满平板产生孢子后结束培养，用无菌水洗下孢子，经无菌脱脂棉过滤，获得孢子悬液；用灭菌后的PDA培养基冷却到45℃左右，加入孢子悬液，混匀后倾倒平板，平板凝固后用灭菌的直径为12.0mm的打孔器在平板中央打孔，向孔中加入除菌发酵上清液，于\n30℃培养5d，测量抑菌圈直径。试验结果：抑菌圈的直径达到42.0mm。\n[0061] 上述试验证明：解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283的无菌体无芽孢发酵液对葡萄座腔菌具有极强的拮抗作用，抑制活性高。\n[0062] 实施例5解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283抗流胶病生物制剂对桃流胶病的防治效果\n[0063] 取实施例3/制备例2制备得到的抗流胶病生物制剂成品，喷施试验田常年发流胶病的桃树。以未喷施该抗流胶病生物制剂的桃树为对照组，以喷施该抗流胶病生物制剂的桃树为试验组，树龄5年，每组设·重复，喷施量500ml/棵，喷施部位为主干和主枝，喷施周期为1次/月，连续喷施5个月。\n[0064] 试验结果：试验组与对照组相比，发病率降低20%，病情指数降低55%。发病率及病情指数计算公式如下：\n[0065] 发病率= 发病总株数/调查总株数\n[0066] 病情指数=Σ（各病级数值×该级株数）×100/（调查总株数×最高病级数值）[0067] 上述试验证明：用本发明解淀粉芽孢杆菌H47CCTCCM2013283通过液体发酵制备得到的抗流胶病生物制剂可对桃树流胶病起到显著的防治效果。