一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂及其应用

1.一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂，其特征在于，所述试剂通过以下步骤制备：
在浓度为1-3nM的金纳米粒子溶液中加入2-5μM浓度的核酸适体溶液，反应1h以上，
8000-12000rpm离心，以浓度为不高于0.1M的PBS溶液重悬得到所述试剂；其中，核酸适体的序列为：5’-AGC TTG CTG CAG CGA TTC TTG ATC GCC ACA GAG CT-3’。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，金纳米粒子溶液中金纳米粒子的粒径为
13nm。
3.一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂盒，包括盐溶液和如权利要求1所述的试剂，其中，试剂和盐溶液中的总盐浓度在0.02-0.1M之间。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，盐溶液为NaCl溶液或KCl溶液。
5.如权利要求3-4任一所述的试剂盒在比色检测氧化乐果上的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，首先在试剂中加入待测的氧化乐果溶液后静置10-60秒，然后加入盐溶液，静置1-5分钟后进行检测。

一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果\n的试剂及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于比色试剂研究领域，涉及一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂及应用。\n背景技术\n[0002] 氧化乐果在农业中广泛应用，但是其毒性和不合理利用也使得其在水体、土壤、空气和食物中大量残留，造成环境污染。氧化乐果能够抑制血液、唾液及组织中的神经递质胆碱酯酶的活性，从而损伤人和动物的神经系统，危害人类和动物的健康。\n[0003] 目前的氧化乐果残留检测方式有很多，包括液相色谱、气相色谱、气-液连用、质谱、表面增强拉曼光谱、声表面波等，这些检测方法虽然有较高的灵敏度和可靠性，但是需要有复杂的样品准备过程以及庞大和昂贵的检测设备，以及复杂的检测过程。\n[0004] 电化学和光学生物检测方法凭借快速、高效、简便、灵敏的特点得到广泛的研究。\n目前检测氧化乐果的方法主要有酶法，分为抑制型和水解型；单酶和多酶法等。抑制型酶法是利用氧化乐果对乙酰胆碱酶的抑制作用对有机磷进行检测的；而水解型法是直接利用水解酶水解氧化乐果，对水解产物进行检测而实现氧化乐果检测的。单酶型法只使用一种酶对氧化乐果进行检测；而多酶型法是两种及以上的酶联用对氧化乐果实现检测。在酶型氧化乐果检测方法的设计中，还引入了各种纳米材料，如碳纳米管、金属纳米粒子、量子点等对信号进行放大，从而提高检测的灵敏度。然而，酶分子的储存和活性条件较为苛刻，影响着酶的应用。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的是为快速而简便地检测氧化乐果的残留，提供一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂。\n[0006] 实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂，所述试剂通过以下步骤制备：\n[0007] 在浓度为1-3nM的金纳米粒子溶液中加入2-5μM浓度的核酸适体溶液，反应1h以上，8000-12000rpm离心，以浓度为不高于0.1M的PBS溶液重悬得到所述试剂；其中，核酸适体的序列为：5’-AGC TTG CTG CAG CGA TTC TTG ATC GCC ACA GAG CT-3’。\n[0008] 金纳米粒子溶液中金纳米粒子的粒径为13nm。\n[0009] 一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂盒，包括上述步骤制备的试剂和盐溶液，其中，盐溶液为NaCl溶液或KCl溶液；试剂和盐溶液中的总盐浓度在0.02-0.1M之间。\n[0010] 一种基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果的试剂盒的应用，所述的应用是在试剂中加入待测的氧化乐果溶液后静置10-60秒，然后加入盐溶液，静置1-5分钟后进行检测。\n[0011] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：\n[0012] 1、检测灵敏度高：本发明对氧化乐果的检测下限低于0.2μM，比现有的氧化乐果检测灵敏度更高。\n[0013] 2、检测体系简单：本发明使用的试剂盒能够使用肉眼对颜色变化的观察来实现氧化乐果的检测，检测方式简单易行。\n[0014] 3、实际应用性强：本发明使用的氧化乐果试剂盒对氧化乐果有很好的检测效果，在土壤模拟样本中也有很好的检出率，在环境保护和家庭农药残留方面有很好的应用前景。\n附图说明\n[0015] 图1是本发明基于核酸适体包裹金纳米粒子探针比色检测氧化乐果试剂盒的检测原理示意图。\n[0016] 图2是本发明实施例1中的试剂制备结果图，a为吸附核酸适体前的吸光度曲线，b为吸附核酸适体后的吸光度曲线。\n[0017] 图3是本发明实施例2中的试剂的检测效果对比图，分别为金纳米粒子(a)、试剂(b)、试剂与氧化乐果混合物(c)加入NaCl溶液后的吸光度曲线。\n[0018] 图4是本发明实施例3中对随机核酸(对照试剂)和核酸适体(试剂)制备的金纳米粒子探针溶液检测同一浓度氧化乐果的对比图。\n[0019] 图5是本发明实施例4中的对不同浓度氧化乐果的检测效果图，其中A为吸光度曲线图，B为A615/A521对氧化乐果浓度的对数关系图。\n[0020] 图6是本发明实施例5中的对同一浓度的氧化乐果和水胺硫磷、甲胺磷、皮蝇磷的吸光度对比图。\n[0021] 图7是本发明实施例6中在缓冲溶液和土壤浸出液模拟样本中氧化乐果的A615/A521对比图。\n具体实施方式\n[0022] 下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为了更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围：\n[0023] 基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测有机磷的核酸适体检测氧化乐果的基本原理如图1所示：当金纳米粒子溶液中的盐溶液浓度达到一定高度之后，金纳米粒子会反生聚沉；而核酸适体能够通过静电作用吸附在金纳米粒子的表面，从而提高金纳米粒子的稳定性；当氧化乐果与核酸适体竞争性结合之后，金纳米粒子表面再次裸露，其稳定性会下降，氧化乐果的浓度不同，金纳米粒子的稳定性下降程度也不同；根据金纳米粒子的聚沉程度的不同可以判断氧化乐果的浓度。\n[0024] 实施例1：试剂的制备及其结果\n[0025] 基于核酸适体包裹的金纳米粒子探针比色检测氧化乐果试剂的制备步骤如下：将\n1000mL的金纳米粒子溶液离心浓缩至500μL,其终浓度约为2nmol/L；缓慢加入10μL浓度为\n100μmol/L的核酸适体溶液，其终浓度为2μmol/L；以350rpm转速振荡反应1小时后，以\n10000rpm转速离心15分钟，加入0.01mol/L PBS(PH＝7)重悬，制得试剂。对制备的试剂进行紫外检测，考察其粒径变化，其结果如图2所示，a为吸附核酸适体前的吸光度曲线，b为吸附核酸适体后的吸光度曲线，表明在吸附核酸适体前后金纳米粒子的粒径没有发生很大的变化，也即在制备过程中很好地控制了团聚现象。\n[0026] 实施例2：试剂盒比色检测氧化乐果的检测效果\n[0027] 试剂盒的制备及使用方法：分别往氧化乐果和试剂的混合物、金纳米粒子溶液和试剂加入盐溶液后进行检测，试剂的制备步骤实施例1中所述，其中90μl的金纳米粒子溶液中直接加入10μl浓度为0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测；90μl的试剂中直接加入10μl浓度为0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测；90μl的试剂中先加入10μl浓度为50μM的氧化乐果溶液得到混合物，静置10秒后加入10μl浓度为0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测。检测结果如附图3所示，曲线a所示的金纳米粒子溶液在波长为521nm处的吸收峰值下降，而在波长为\n615nm左右的地方有一很宽的吸收，说明金纳米粒子发生了团聚，而此时金纳米粒子的颜色为很深的紫蓝色；曲线b所示的试剂在波长为521nm处的吸收峰仍然很强，曲线的形状与未加入NaCl溶液的试剂相似，说明试剂在该盐浓度下没有发生明显团聚，并且此时试剂的颜色仍然为红色；曲线c所示的氧化乐果和试剂的混合物在波长为521nm处的吸收峰值下降，下降程度不如金纳米粒子溶液，而在波长为615nm左右的地方有新的吸收，吸收程度也没有金纳米粒子溶液强，说明金纳米粒子发生了团聚，但团聚的程度不如金纳米粒子溶液，而此时混合物颜色为比金纳米粒子溶液浅的紫蓝色；综合三条曲线可以说明试剂可以用于氧化乐果的检测。\n[0028] 实施例3：随机核酸和核酸适体对氧化乐果检测效果的影响\n[0029] 试剂盒的制备及使用方法：以与核酸适体同等长度的随机核酸制备对照试剂，以核酸适体制备试剂，试剂制备步骤如实施例1所述，其中对照试剂制备以随机核酸替代核酸适体，分别往90μl对照试剂和试剂中加入10μl浓度为0和5μM的氧化乐果溶液，充分混合后静置反应10秒，然后加入10μl浓度为0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测；其结果如图4所示，加入0(a)和5μM(b)氧化乐果后对照试剂的吸光度曲线没有明显变化，说明对照试剂没有发生明显聚沉，而加入0(c)和5μM(d)氧化乐果后试剂的吸光度曲线有明显区别，加入氧化乐果之后在在波长为521nm处的吸收峰值下降，而在波长为\n615nm左右的地方有新的吸收，说明试剂反生了聚沉，总之，核酸适体序列对氧化乐果的检测有重要作用。\n[0030] 实施例4：试剂盒比色检测氧化乐果的效果\n[0031] 试剂盒的制备及使用方法：对不同浓度的氧化乐果溶液进行检测，其中试剂的制备步骤实施例1中所述，检测的步骤为往90μl的试剂中加入10μl浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、\n2.5、5和10μM的氧化乐果溶液，充分混合后静置反应10秒，然后加入10μl浓度为0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测；其结果如图5所示，根据A所示的吸光度曲线图看以看出，随着氧化乐果浓度的增加，波长为521nm处的吸收峰下降，而波长为\n615nm处的吸收值增加，当氧化乐果的浓度在0.2-10μM之间时都有较好的区分，并且此时从颜色上看，随着氧化乐果浓度的增加，溶液的颜色逐渐由红色变为蓝紫色；根据B所示的A615/A521对氧化乐果浓度的曲线可以看出，在氧化乐果浓度为0.1-10μM之间时，A615/A521值与浓度的对数呈线性相关；试剂盒对氧化乐果的检测下限低于0.1μM，并且在一定范围内有很好的线性关系，有很好的氧化乐果检测效果。\n[0032] 实施例5：试剂盒比色检测氧化乐果、水胺硫磷、甲胺磷和皮蝇磷的效果对比[0033] 试剂盒的制备及使用方法：以相同浓度的氧化乐果、水胺硫磷、甲胺磷和皮蝇磷进行检测，试剂的制备步骤实施例1中所述，分别往90μl的试剂中加入10μl浓度为5μM的氧化乐果、水胺硫磷、甲胺磷和皮蝇磷溶液，充分混合后静置反应10秒，然后加入10μl浓度为\n0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测其结果如图6所示，从图中可以看出，氧化乐果(a)使得波长为521nm处的吸收峰下降，而波长为615nm处的吸收值增加，而水胺硫磷(b)、甲胺磷(c)和皮蝇磷(d)对试剂的吸收曲线没有明显影响，说明该试剂盒有较好的检测特异性。\n[0034] 实施例6：试剂盒比色检测缓冲溶液和土壤模拟样本中的化乐果的效果对比[0035] 试剂盒的制备及使用方法：对氧化乐果土壤模拟样本溶液进行检测，试剂的制备步骤实施例1中所述，检测步骤为往90μl的试剂中加入10μl浓度为模拟样本氧化乐果溶液，充分混合后静置反应10秒，然后加入10μl浓度为0.2M的NaCl溶液，静置1分钟后进行紫外可见分光吸收光谱检测，其中氧化乐果土壤模拟样本溶液的制备步骤为称取10g干燥的土壤，加入10ml超纯水，反复颠倒离心管，使土壤充分悬浮，静置6h后取上清液；以土壤上清液稀释浓度为469μM的市售氧化乐果标准品，得到浓度为5μM的土壤模拟样本。其检测结果如图7所示，从图中可以看出土壤模拟样本中的有很好的检出效果。