根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法

发明专利无效专利

申请号：
CN200710024145.5
IPC分类号：C12N15/81;C12N1/19;C12N15/31;C12R1/72
申请日期：
2007-07-23
申请人：
江南大学

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专利名称	根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法
申请号	CN200710024145.5	申请日期	2007-07-23
法律状态	撤回	申报国家	中国
公开/公告日	2008-02-27	公开/公告号	CN101130781
优先权	暂无	优先权号	暂无
主分类号	C12N15/81 ? IPC结构图谱： C 化学；冶金 C0 化学 C12 生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程 C12N 微生物或酶；其组合物（杀生剂、害虫驱避剂或引诱剂，或含有微生物、病毒、微生物真菌、酶、发酵物的植物生长调节剂，或从微生物或动物材料产生或提取制得的物质入A01N63/00；药品入A61K；肥料入C05F）；繁殖、保藏或维持微生物；变异或遗传工程；培养基（微生物学的试验介质入C12Q1/00）〔3〕 C12N15/00 突变或遗传工程；遗传工程涉及的DNA或RNA，载体（如质粒）或其分离、制备或纯化；所使用的宿主（突变体或遗传工程制备的微生物本身入C12N1/00、C12N5/00、C12N7/00；新的植物入A01H；用组织培养技术再生植物入A01H4/00；新的动物入A01K67/00；含有插入活体细胞的遗传物质以治疗遗传疾病的药剂的应用，基因疗法入A61K48/00，一般肽入C07K）〔3，5，6，2006.01〕 C12N15/09 DNA重组技术〔5〕 C12N15/63 使用载体引入外来遗传物质；载体；其宿主的使用；表达的调节〔5〕 C12N15/79 专门适用于真核细胞宿主的载体或表达系统〔5〕 C12N15/80 用于真菌〔5〕 C12N15/81 用于酵母〔5〕	IPC分类号	C;1;2;N;1;5;/;8;1;;;C;1;2;N;1;/;1;9;;;C;1;2;N;1;5;/;3;1;;;C;1;2;R;1;/;7;2查看分类表>
申请人	江南大学	申请人地址	江苏省无锡市蠡湖大道1800号变更专利地址、主体等相关变化，请及时变更，防止失效
权利人	江南大学	当前权利人	江南大学
发明人	饶志明;徐美娟;张君胜;沈微;方慧英;诸葛健
代理机构	无锡市大为专利商标事务所	代理人	时旭丹;刘品超

摘要

根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母，将外源基因整合到宿主染色体上，属于基因工程中转化技术领域。本发明通过构建质粒pCAM3300－zeocin，将其电击转化根癌农杆菌。通过将含有目的质粒pCAM3300－zeocin的根癌农杆菌和产甘油假丝酵母共培养，利用zeocin抗性基因为筛选标记，实现了pCAM3300－zeocin对产甘油假丝酵母的转化。根据根癌农杆菌的生长特性，对转化条件进行了优化，在共培养时间为24h，细胞比例为1∶500－1000时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞。初步建立了根癌农杆菌介导转化工业化产甘油假丝酵母的转化方法，为进一步研究产甘油假丝酵母打下基础。

1、根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，其特征是以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得zeocin抗性基因，再与线性化质粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300-zeocin；质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404，再和产甘油假丝酵母共培养，根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母； (1)zeocin基因的克隆根据zeocin基因的特异性设计引物：引物R：5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；引物F：5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’； PCR扩增zeocin基因得到300 bp的特异条带； PCR方法如下：取质粒pPICZB模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL；循环参数：94℃预变性5min，94℃45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35个循环，72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easyvector连接保存；再用相应EcoR I酶切，胶回收zeocin目标基因，EcoR I酶切线性化质粒pCAM 3300；在T4连接酶的作用下连接得到pCAM 3300-zeocin； (2)质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404 将重组质粒pCAM 3300-zeocin通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin ； (3)根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母：将重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin于LB培养基中，30℃，200 r/min摇床培养36 h，离心收集菌体；用等体积的IM培养基重悬，培养6h；接种产甘油假丝酵母WL2002-5于YPD培养基中，30℃、200r/min摇床培养过夜；产甘油假丝酵母的YPD培养液按1∶5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6h；分别离心收集根癌农杆菌菌体和产甘油假丝酵母，用生理盐水清洗一次，用IM培养基重悬菌体，产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL，各取50μL加入20mL IM培养基中30℃200r/min共培养过夜；取200μL培养液涂布铺有玻璃纸的IM+AS固体培养基平板置于25℃培养24h；将玻璃纸转接到SM培养基上培养两天，筛选阳性酵母转化子。
2、根据权利要求l所述的方法，其特征是重组根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'n介导转化产甘油假丝酵母WL2002-5的优化转化条件：(1) IM固体培养基诱导时间优化：优化的共培养时间为24h;(2) 共培养根癌农杆菌菌体浓度优化：产甘油假丝酵母比根癌农杆菌菌体细胞比例为1:500-1000时，最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞。

序号	公开(公告)号	公开(公告)日	申请日	专利名称	申请人
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序号	公开(公告)号	公开(公告)日	申请日	专利名称	申请人
1	CN102286521A	2011-07-18	2011-07-18	一种多功能穿梭表达载体及其构建方法无效专利	江南大学

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