血管生成促进剂

1.通式(I)所示的化合物在制造血管生成促进剂中的用途，

式中，R1表示碳原子数为2-6的酰基，R2表示碳原子数为1-30的烷 基；R3、R4相同或不同，表示氢原子或碳原于数为2～8的酰基或芳烷 基；R5表示碳原子数为1-10的烷基。
2.如权利要求1所述的用途，R1表示碳原子数为2-6的酰基， R2表示碳原子数为1-30的烷基，R3、R4相同或不同，表示氢原子、乙 酰基、丙酰基、苯甲酰基、苯甲基、苯乙基，R5表示碳原子数为1-10 的烷基。
3.如权利要求1所述的用途，R1表示碳原子数为2-4的酰基， R2表示碳原子数为1-4的烷基，R3、R4相同或不同，表示氢原子或碳 原子数为2～8的酰基或芳烷基；R5表示碳原子数为5-7的烷基。
4.如权利要求1所述的用途，R1表示碳原子数为2-4的酰基，R2 表示碳原子数为1-4的烷基，R3、R4相同或不同，表示氢原子、乙酰 基、丙酰基、苯甲酰基、苯甲基、苯乙基，R5表示碳原子数为5-7的 烷基。
5.如权利要求1所述的用途，通式(I)所示的化合物为9-丁酰 氧基-11α，15S-二羟基前列腺-8，13E-二烯-1-羧酸丁酯。
6.如权利要求1所述的用途，该血管生成促进剂是脂肪乳剂的形式。
7.权利要求1所述的化合物在制造对具有血管生成作用的药物能 够增强其作用的增强剂中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，具有血管生成作用的药物是生长因 子、肝素、腺苷或潘生丁。
9.如权利要求8所述的用途，生长因子是b-FGF、TGFβ、VEGF、 HGF或EGF。

                      技术领域\n本发明涉及前列腺腺素E1前体的新用途发明，具体的说是血管生 成的促进剂，及生长因子引起的血管生成作用的增强剂。\n                      背景技术\n已知前列腺腺素E1(PGE1)类在生物体内微量存在，具有多种生理 作用，但其化学稳定性差。因而，对制剂改进及PGE1修饰的研究一直 在进行，特别是PGE1前体(前体药物)受到了瞩目。本发明的目的在于 提供一种PGE1前体的新用途。\n                      发明概述\n本发明人发现特定的PGE1前体具有血管生成的促进作用，另外可 以增强碱性成纤维细胞增殖因子(下面称作“b-FGF”)等生长因子的 血管生成作用，从而完成了本发明。\n也就是说，本发明是以通式(I)所示化合物(下面称作“PGE1前 体”)作为有效成分的血管生成促进剂。另外，本发明是以PGE1前体 作为有效成分，对具有血管生成作用的药物可以增强其作用的增强 剂。\n\n〔式中R1表示酰基，R2表示烷基；R3、R4相同或不同，表示氢原子或 羟基的保护基；R5表示烷基。〕\n通式(I)中R1所示酰基的碳原子数为2～6，优选2～4，合适的物 质例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基、己酰基等烷酰基。R2所 示烷基的碳原子数为1～30，优选1～4，可以举出例如甲基、乙基、 丙基、丁基、己基、辛基、癸基、二十烷基、三十烷基等。R5所示烷 基的碳原子数为1～10，优选5～7，可以举出上述烷基中与该碳原子 数对应的物质。R3、R4所示羟基的保护基，例如酰基(乙酰基、丙酰基、 苯甲酰基等)、芳烷基(苯甲基、苯乙基等)等。\n作为通式(I)所示PG E1前体的具体例子，例如9-乙酰氧基- 11α，15S-二羟基前列腺-8，13E-二烯-1-羧酸甲酯，9，11α， 15S-三乙酰氧基前列腺-8，13E-二烯-1-羧酸甲酯，9，15R-二 乙酰氧基-11α-羟基前列腺-8，13E-二烯-1-羧酸甲酯，9，15S -二乙酰氧基-11α-羟基前列腺-8，13E-二烯-1-羧酸甲酯，9 -乙酰氧基-11α，15S-二羟基-17S，20-二甲基前列腺-8，13E -二烯-1-羧酸丁酯，9-乙酰氧基-11α，15S-二羟基前列腺-8， 13E-二烯-1-羧酸丁酯，9-丁酰氧基-11α，15S-二羟基前列腺 -8，13E-二烯-1-羧酸丁酯，9，11α-二乙酰氧基-15S-羟基- 17S，20-二甲基前列腺-8，13E-二烯-1-羧酸丁酯等。\n通式(I)表示的化合物在特开昭58-39660号公报(对应 USP4363817、USP4543421、EP-A-133450)、特开平3-204853号 公报(对应USP5120870、EP-A-423697)、特开平5-213862号公报 (对应USP5194670、EP-A-624574)等中记载了其制备方法。\n该PGE1前体可以制成例如环糊精(CD)夹杂物、脂质体、乙醇溶 液、脂肪乳剂等适当形式的制剂使用。优选脂肪乳剂的形式，这种制 剂的缓释性、持续性、局部蓄积性优良，同时具有良好的保存稳定性。\n以下说明作为优选形式的脂肪乳剂。本发明中，所谓含有PGE1 前体的脂肪乳剂〔以下称作“含有PGE1前体的脂肪乳剂”〕是指含有 PGE1前体，而且油成分作为液滴分散到分散介质中的制剂。\n油成分例如植物油、中链脂肪酸甘油三酯(即MCT)、鱼油等。可 以使用1种，也可以使用2种以上。植物油例如大豆油、芝麻油、蓖 麻油、棉籽油、橄榄油等。这些物质最好采用公知的方法精制到临床 上能够安全使用的程度。优选高纯度的精制大豆油，更优选采用例如 水蒸气蒸馏法对精制大豆油进一步精制得到的高纯度的精制大豆油 (纯度：甘油三酯、甘油二酯及甘油单酯的含量在99.9％以上)。\n为了使油成分在分散介质中分散，可以使用磷脂等作为乳化剂。 磷脂例如卵磷脂、大豆磷脂等，特别优选使用其精制磷脂。这种精制 磷脂可以依照常规方法，采用有机溶剂分离法进行制备。精制磷脂主 要由卵磷脂、磷脂酰乙醇胺组成，此外的磷脂还含有磷脂酰肌醇、磷 脂酰丝氨酸、鞘髓磷脂等。另外，也可以使用实质上从精制磷脂中除 去磷脂酰乙醇胺的物质，具体来说也可以使用除去磷脂酰乙醇胺直至 其含量约1w/w％以下的物质，这可以使用卵黄、大豆等的磷脂，按照 常规方法用有机溶剂分离，然后通过硅胶、矾土等无机吸附剂精制得 到。因此，得到的磷脂主要由卵磷脂组成〔特开昭60-149524号公 报(对应USP4684633、EP-A-150732)〕。而且，也可以使用卵磷脂、 磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇本身。分散剂例如水等， 优选净化水。该含有PGE1前体的脂肪乳剂主要由植物油5-50％ (w/v)、相对于植物油100重量份的磷脂1-300重量份(优选5-100 重量份，更优选10-50重量份)及适量水组成。\n另外，本发明中含有PGE1前体的脂肪乳剂除了上述成分以外，必 要时还可以加入乳化辅助剂、防腐剂、稳定剂、高分子物质、等渗剂 等。\n乳化辅助剂例如碳原子数为6-22(优选12-20)的脂肪酸或其 可药用盐，及碳原子数为2-22的脂肪胺等。脂肪酸只要是可以添加 到药品中的物质即可，没有特别的限定，可以是直链状或支链状的， 具体的说优选使用直链的硬脂酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、亚麻酸、 肉豆蔻酸等。另外，这些脂肪酸的可药用盐例如碱金属盐(钠盐、钾 盐等)、碱土金属盐(钙盐、镁盐等)等。而且，脂肪胺只要是可以添 加到药品中的物质即可，没有特别的限定，例如直链状或支链状碳原 子数为2-22的伯胺、仲胺等，具体的说例如乙醇胺、丙胺、辛胺、 硬脂酰胺、油酰胺等。该乳化辅助剂的含量优选脂肪酸或其盐在0.3 ％(w/v)以下，另外脂肪胺等在0.1％(w/v)以下。\n稳定剂只要是可以添加到药品中的物质即可，没有特别的限定， 例如胆固醇类、磷脂酸等。其含量为胆固醇类优选0.5％(w/v)以下， 更优选0.1％(w/v)以下，另外，磷脂酸优选5％(w/v)以下，更优选1 ％(w/v)以下。\n高分子物质只要是可以添加到药品中的物质即可，没有特别的限 定，例如白蛋白、葡聚糖、乙烯基聚合物、非离子表面活性剂、明胶、 羟乙基淀粉等。作为白蛋白，由于抗原性的问题等，可以使用由人体 得到的物质。乙烯基聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮等。作为非离子表面 活性剂，可以使用聚亚烷基二醇(例如平均分子量为1000-10000，优 选4000-6000的聚乙二醇等)、聚氧亚烷基共聚物(例如平均分子量 为1000-20000，优选6000-10000的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物 等)、氢化蓖麻油聚氧亚烷基衍生物〔例如氢化蓖麻油聚氧乙烯-(20) -醚、同前-(40)-醚、同前-(100)醚等〕、蓖麻油聚氧亚烷衍生物 〔例如蓖麻油聚氧乙烯-(20)-醚、同前-(40)-醚、同前-(100) 醚等〕等。其含量为相对于PGE1前体100重量份，优选高分子物质 10-500重量份，更优选50-100重量份。\n等渗剂例如甘油、葡萄糖等。\n上述脂肪乳剂中含有的PGE1前体的量可以随乳剂的形态及用途 适当增减，一般的在该乳剂中含有极微量(例如约0.1-100μg/ml)就 足够了。\n含有PGE1前体的脂肪乳剂特别优选的组成如下所示。\n          PGE1前体             1-100μg\n          精制大豆油            50-500mg\n          高度精制卵磷脂        5-50mg\n          油酸                  0.1-5mg\n          浓甘油                5-50mg\n          蒸馏水                适量\n          合计                  1ml\n含有PGE1前体的脂肪乳剂的制造方法并没有特别限定，可以采用 各种方法制备，基本来说可以通过下述方法制得：向由PGE1前体与其 它油成分组成的油状物中加入作为分散介质的水，特别是纯净水，采 用适当的方法乳化直到成为均质。具体例如下述方法：也就是说，将 一定量的PGE1前体、油成分(优选大豆油)、磷脂以及必要时加入的 其它上述添加剂混合，加热形成溶液，使用常用的匀浆机(例如高压 喷射型匀浆机、超声波型匀浆机等)进行匀质处理，制得油包水型分 散液，然后向其中加入必要量的水，再用上述匀浆机进行匀质化，转 变成水包油型乳剂。根据制造中的情况，也可以在脂肪乳剂制备后， 加入稳定剂、等渗剂等添加剂〔特开昭58-222014号公报(对应 USP4493847、EP-A-97481)〕。\n上述处理之后，也可以进行灭菌·除菌处理。灭菌处理可以采用 常规方法，例如灭菌过滤法、γ射线照射法、高压加热处理法等。\n因此，制得的含有PGE1前体的脂肪乳剂可以直接或根据需要添加 其它成分形成本发明的促进剂。其它成分例如二十碳五烯酸(所谓 EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。该脂肪乳剂的平均粒径优选1μm 以下，更优选0.2-0.4μm。\n以下对使用该PGE1前体制备脂肪乳剂以外其它形式制剂的场合 进行说明。\n环糊精(CD)夹杂物可以通过下述方法得到：将PGE1前体溶解于 溶剂(乙醇等)中，向该溶液中加入将环糊精加温溶解于水等得到的 溶液后，冷却，过滤析出的沉淀，减压干燥。\n脂质体可以通过下面的方法得到：将磷脂溶解于溶剂(氯仿等) 中，向该溶液中加入在溶剂(乙醇等)中溶解PGE1前体得到的溶液后， 蒸馏除去溶剂，向其中加入磷酸缓冲液，经振荡、超声波处理及离心 分离后，用膜滤器等过滤上清液而得到。\n乙醇溶液可以通过将PGE1前体溶解于乙醇中得到。另外，该乙醇 溶液可以在使用时用生理盐水或葡萄糖溶液稀释。\n另外，上述脂肪乳剂和其它制剂可以采用常规方法调节pH、盐浓 度、渗透压等。另外，必要时也可以制成冷冻干燥制剂。\n本发明的促进剂中PGE1前体不仅具有促进血管生成的作用，而且 可以增强生长因子引起的血管生成作用。\n本发明的血管生成促进剂能够以注射剂等非口服形式给药，特别 优选静脉内给药。这种给药优选PGE1前体1日1-1000μg，可以按 照0.01-1000ng/kg/分的比例1日1次静脉内持续注射给药。\n另外，本发明的血管生成促进剂可以与具有血管生成作用的公知 药物合用，以增强这种作用。这时最好投予本发明的血管生成促进剂 与具有血管生成作用的药物使之同时存在于生物体。两者可以一起制 成制剂，也可以分别制成制剂。分别制成制剂时，给药途径·用法可 以相同也可以不同。\n作为具有血管生成作用的公知药物，例如生长因子(growth factor)、肝素、腺苷、潘生丁等。生长因子例如b-FGF、TGF(转 化生长因子)β、VEGF(血管内皮细胞增殖因子)、HGF(肝细胞生长 因子)、EGF(上皮细胞生长因子)等。它们的用法、用量只要在已知 的范围内即可，并没有特别的限定。\n                 图面的简单说明\n图1是表示试验例1中溶剂给药组血管生成结果的照片。图2是 表示试验例1中AS给药组结果的照片。图3是表示试验例2中单独 溶剂给药组(第1组)结果的照片。图4是表示试验例2中b-FGF 给药组(第2组)结果的照片。图5是表示试验例2中AS与b-FGF 并用组(第3组)结果的照片。\n                   实施例·试验例\n为了进一步详细说明本发明，列出实施例及试验例，但是本发明 并不只限于此。\n实施例1(CD夹杂物)\n将9-丁酰氧基-11α，15S-二羟基前列腺腺-8，13E-二烯 -1-羧酸丁酯(以下称为“AS”。)17mg溶解于乙醇0.2ml中，再向 该溶液中加入将β-环糊精257mg加温溶解于6ml水制得的溶液，45 ℃下加温溶解后，冷却至室温，使之析出沉淀。将其在0℃下放置一 夜后过滤，用50％的乙醇水溶液洗涤后，减压干燥，得到环糊精(CD) 夹杂物。\n实施例2(脂质体)\n将卵磷脂60mg及油酰胺11mg溶解于氯仿5ml后，加入将AS 30 μg溶解于乙醇100μl中得到的溶液，加入到茄型烧瓶中，用旋转式 蒸发器蒸馏除去溶剂。再向其中加入0.1M的等渗磷酸缓冲液(pH5) 1ml，振荡、超声波处理及离心分离后，用0.2μm的膜滤器过滤上清 液，得到脂质体制剂。\n实施例3(乙醇溶液)\n将AS 500μg溶解于乙醇1ml中，而得到乙醇溶液制剂。使用时， 用生理盐水或葡萄糖溶液等稀释。\n实施例4(脂肪乳剂)\n向精制大豆油30g中加入精制卵磷脂5.4g、AS 1.5mg及油酸 0.72g，40-75℃下加热溶解。向其中加入蒸馏水200ml，然后加入 日本药典甘油7.5g，用20-40℃的注射用蒸馏水加至全量300ml， 用均浆机粗乳化。第1次在120kg/cm2下，合计500kg/cm2的压力下， 通过Manton-Gaulin型匀浆机10次，使其乳化，从而得到匀质且含 有极细微PGE1前体的脂肪乳剂。该乳剂的平均粒径为0.2-0.4μm， 且不含有1μm以上的粒子。\n试验例1\n使用本发明的促进剂，评价其血管生成作用。\n①使用制剂\n作为本发明的促进剂，使用将实施例中4含有AS的脂肪乳剂用 10％脂肪乳剂(Intralipos，由绿十字公司(Green Cross Corporation)生产，另外于1998年4月1日由吉富制药株式会社制 造并出售)稀释得到的物质。作为对照的溶剂给药组只使用上述10％ 的脂肪乳剂。\n②使用方法\n将大鼠麻醉，在背部正中线部切开约1cm，在距尾部一侧2.5cm 处用柯赫尔氏灯在皮下制造气包，埋入吸收了生理盐水的止血用明胶 海绵(Spongel，1.0×1.0×0.5cm，山之内制药公司生产)，制成大鼠 海绵模型。\n然后将切开部位缝合、消毒后，肌肉注射抗生素，送回饲养笼。 从埋入海绵当天开始至第4天，由尾静脉1日1次快速浓注(ボ一ラ ス)各制剂。埋入第4日，将每组8只动物处死后，切开背部，在不 损坏埋入海绵的前提下，剥离周围组织，拍摄海绵表面的照片。之后， 取出所有海绵，加入0.1M氨水2ml，放置4小时，提取海绵内的血红 蛋白。使用测定试剂盒测定提取液100μl中的血红蛋白含量，计算 出海绵内血红蛋白的含量，作为血管生成的指标。\n③统计处理\n血管生成作用的评价是以溶剂给药组作为对照，采用Dunnett法 进行多重比较检验，讨论显著性。危险率低于5％的认为有显著性差 异。\n④结果\ni)海绵内血红蛋白含量(表1)\n如果连日由静脉快速浓注AS(3μg/kg)，与溶剂给药组比较， AS使血红蛋白含量增加，可以认为有显著性差异。\n              表1\n   埋入4日后的    血红蛋白含量(mg/海绵)   溶剂给药组   (1ml/kg)    1.5±0.9   AS给药组   (3μg/kg)    4.4±0.8*\n    表中的数值表示平均±标准误差。\n *P＜0.05相对于溶剂给药组(Dunnett法)\nii)照片观测\n溶剂给药组(图1)中能够观察到海绵表面有一些新生血管。AS 给药组(图2)中能够用肉眼观察到显著的血管网，血管生成良好。\niii)总结\n如果投给AS，能够观察到显著的血管网，与溶剂给药组比较，发 现海绵内血红蛋白含量显著增加，因此说明AS能够促进血管生成。\n实验例2\n使用本发明的促进剂，评价对b-FGF引起的血管生成的促进作 用。\n①使用制剂\n与实验例1相同，作为本发明的促进剂，使用将实施例4含有AS 的脂肪乳剂用10％脂肪乳剂(Intralipos，由绿十字公司(Green Cross Corporation)生产，另外于1998年4月1日由吉富制药株式 会社制造并出售)稀释得到的物质。作为对照的溶剂给药组只用上述 10％的脂肪乳剂。\n②实验方法\n使用吸收了含有0.1％BSA(牛血清蛋白)的生理盐水或b-FGF溶 液(用含有0.1％BSA的生理盐水将b-FGF1mg/ml溶液100μl稀释10 倍制得的物质)的止血用明胶海绵，与实验例1同样制成大鼠海绵模 型(每组6-8只)。从海绵埋入当天起至第4天，以1ml/mg的用量由 尾静脉快速浓注溶剂及AS。埋入4天后，与实验例1同样，拍摄海绵 表面的照片，而且计算出海绵内的血红蛋白含量。\n③统计处理\n血管生成作用的评价是以溶剂单独给药组(海绵内含有BSA的生 理盐水+10％脂肪乳剂静脉注射)为对照，采取Dunnett法进行多重 比较检验(第1组对第2，3组)，讨论显著性。关于AS与b-FGF的 相互作用，以b-FGF单独给药组为对照，进行非对应t检验(第2组 对第3组)，讨论显著性。另外，危险率低于5％的认为有显著性差异。\n④结果\ni)海绵内血红蛋白的含量(表2)\n确认b-FGF单独给药组在埋入4天后，海绵内的血红蛋白含量 增加。另一方面，AS与b-FGF并用组与b-FGF单独给药组相比，显 著使海绵内血红蛋白的含量增加。\n                              表2\n  静脉注射   海绵内    埋如4天后海绵内    血红蛋白含量(mg/海绵)   例数   (n)   投给10％脂肪   乳剂   0.1％BSA/生理盐   水(100μl/海绵)    6.5±0.7   第1组   6   (1ml/kg)   b-FGF   (1μg/kg)    11.8±0.9   第2组   8   投给   AS(3μg/kg)   b-FGF   (1μg/kg)    20.7±3.1    #   第3组   7\n表中的数值表示平均±标准误差。\n#P＜0.05相对于b-FGF单独给药组(非对应t检验)\nii)照片观测\n溶剂单独给药组(第1组)中，只有海绵周围能够观察到血管(图 3)。另外，b-FGF给药组(第2组)中，能够观察到在海绵表面有很多 血管伸展的图象，确认形成了血管网(图4)。另一方面，AS与b-FGF 并用组(第3组)中，可以确认进一步形成了显著的血管网，而且血管 直径也变大了(图5)。\niii)总结\n如果AS与b-FGF并用，能够增强b-FGF的血管生成促进作用。 因而，AS不仅在单独使用时具有促进血管生成的作用，而且由于能够 增强b-FGF的作用，所以在缺血组织及其他病态下在b-FGF局部增 加的部位，通过AS的血管生成促进作用可以进一步发挥作用。\n实验例3(毒性实验)\n即使将实施例4的脂肪乳剂对小鼠、大鼠及狗以PGE1前体 250μg/kg体重的量静脉给药，也没有出现死亡例，没有表现出严重 的毒性。\n                      工业实用性\n本发明促进剂有效成分PGE1前体，不仅其本身在单独使用时具有 促进血管生成的作用，而且能够增强b-FGF等具有血管生成作用药 物带来的血管生成作用。因而，在缺血组织及其他病态下b-FGF局 部增加的部位，可以通过其血管生成促进作用进一步发挥作用。\n本申请是以日本平成9年专利申请231110号为基础的，这些内 容也全部包含在本说明书中。