具有改良生长特性的植物及其制备方法

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具有改良生长特性的植物及其制备方法\n发明领域\n[0001] 本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于相应的野生型植物或其他对照\n植物改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及改良植物生长特性的方法，包括调节\n植物中I类同源域亮氨酸拉链(Homeodomainleucine zipper，HDZip)hox5多肽或其同源物\n编码核酸的表达；或包括调节植物中硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的表达；\n或包括调节植物中命名为增产蛋白质16(YieldEnhancingProtein 16，下文称为YEP16)的\n多肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中I型糖原合酶激酶(I型shaggy样激\n酶)或其同源物编码核酸的表达。本发明还涉及具有调节的I类HDZip hox5多肽或其同源\n物编码核酸表达的植物；或具有调节的NRT多肽或其同源物编码核酸表达的植物；或具有\n调节的YEP16编码核酸表达的植物；或具有调节的I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸\n表达的植物；所述植物相对于相应的野生型或其他对照植物具有改良的植物生长特性。本\n发明还提供在发明方法中有用的构建体。\n[0002] 发明背景\n[0003] 鉴于世界人口不断增长而农业可耕种土地面积逐渐缩小，激起提高农业效率方面\n的研究。作物和园艺改良的常规方法是利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，\n这样的选育技术有若干缺点，即这些技术通常是劳动密集型的，并且产生通常含有异源遗\n传组分的植物，这些遗传组分并非总是产生从亲本植物遗传的期望性状。分子生物学的进\n展已经允许人类改造动物和植物的种质(germplasm)。植物遗传工程需要分离和操作遗传\n物质(通常为DNA或RNA的形式)及随后将所述遗传物质引入植物。这样的技术能够提供\n具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。\n[0004] 特别具有经济利益的性状是产率。产率通常定义为来自作物经济价值的可测量产\n出。其可以根据数量和/或质量来定义。产率直接取决于几种因素，例如：器官的数量和大\n小，植物构造(例如分枝数)，种子产量，叶衰老等等。根的发育，营养吸收和胁迫耐受性也\n是决定产率的重要因素。因此优化上述因素之一可以有助于增加作物的产率。\n[0005] 种子产率是尤其重要的性状，原因在于许多植物的种子对于人类和动物营养至关\n重要。诸如谷物、稻类、小麦、芸苔和大豆的作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是\n通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工\n业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳\n(在萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代\n谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前\n体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒长大。\n[0006] 特别具有经济利益的另一性状在于具有提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是\n导致全世界作物损失的首要原因，使大多数主要作物植物的平均产率下降超过50％(Wang\n等，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以因干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁\n迫而引起。提高植物非生物胁迫耐受性的能力将对全世界的农场主带来重大的经济利益，\n并将使我们能够在不利条件下以及在否则将不可能栽培作物的地域来栽培作物。\n[0007] 增加植物种子产率的能力将在诸如农业等领域中具有许多应用，包括观赏植物的\n生产、树木栽培、园艺和森林业。增加产率也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用\n于诸如药物、抗体或疫苗等物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这\n类领域。\n技术背景\n[0008] 同源域亮氨酸拉链(HDZip)蛋白\n[0009] 同源域亮氨酸拉链(HDZip)蛋白构成转录因子家族，其特征在于存在DNA结合结\n构域(HD)和邻近的亮氨酸拉链(Zip)基序。同源域通常包括60个保守的氨基酸残基，形\n成与DNA结合的螺旋1-环-螺旋2-转角-螺旋3。此DNA结合位点通常为假回文结构。\n亮氨酸拉链邻近于同源域的C-末端，包括几个七肽重复单位(至少4个)，其中通常每隔6\n个氨基酸就出现亮氨酸(偶尔为缬氨酸或异亮氨酸)。亮氨酸拉链对于蛋白质二聚化非常\n重要。二聚化是DNA结合的前提条件(Sessa等(1993)EMBO J 12(9)：3507-3517)，并且可\n以发生在两个相同的HDZip蛋白之间(同源二聚体)，或者两个不同的HDZip蛋白之间(异\n源二聚体)。\n[0010] 同源域基因存在于所有真核细胞中，并构成拟南芥(Arabidopsisthaliana)中至\n少89个成员的基因家族。亮氨酸拉链本身也见于除植物外的真核细胞中。不过，同源域和\n亮氨酸拉链两者同时存在却是植物所特有的(在拟南芥89个蛋白质中的至少47个中发\n现)，并且除了维管束植物之外，还已经在藓类植物(moss)中遇到(Sakakibara等(2001)\nMol Biol Evol 18(4)：491-502)。亮氨酸拉链则位于同源域的C-末端，这两个要素特征彼\n此重叠3个氨基酸。\n[0011] 基于序列相似性标准，已将拟南芥HDZip基因分为四个不同的类别：HDZip I至\nIV(Sessa等(1994)In Plant Molec Biol，412-426页)。同其他三类HDZip蛋白一样，I类\nHDZip蛋白在同源域和亮氨酸拉链以外的一级氨基酸结构方面差异相当大。I类HDZip蛋\n白的特征还在于同源域和亮氨酸拉链内的两个特定特征：\n[0012] 1)在同源域中，除了不变的氨基酸Leu16Trp48Phe49Asn51Arg53之外，第46位为\nAla(A)，而第56位为Try(W)(或者偶尔为Phe(F))(Sessa等(1997)J Mol Biol 274(3)：\n303-309；见图1)，这称为I类同源域，且\n[0013] 2)亮氨酸拉链包括6个七肽，除了呈现7个七肽的蕨类植物Ceratopteris \nrichardii之外(每个七肽内的位置命名为a、b、c、d、e、f和g位，保守的亮氨酸在d位；\nSakakibara等(2001)Mol Biol Evol 18(4)：491-502；见图2)。HDZip II、III和IV呈现\n仅具5个七肽的亮氨酸拉链。\n[0014] 至于其DNA结合特性，I类HDZip蛋白优先结合在中心位置处重叠的5bp半位点，\n即CAA(A/T)ATTG(sessa等(1993)EMBO J 12(9)：3507-3517)。\n[0015] 已证明不同的HDZip蛋白要么激活要么阻遏转录。已利用报告基因(荧光素酶；\nHenriksson等(2005)Plant Phys 139：509-518)在拟南芥中证明：I类HDZip ATHBl、-5、-6\n和-16在拟南芥叶子的瞬时表达测定中作为转录激活因子起作用。利用另一报告基因(葡\n萄糖醛酸酶；Meijer等(2000)MolGen Genet 263：12-21)，证明两种稻I类HDZip蛋白即\nOshox4和Oshox5在稻细胞悬浮培养物的瞬时表达测定中作为激活因子起作用。相反，两种\n稻II类HDZip蛋白即Oshox1和Oshox3在相同的试验中作为转录阻遏物起作用(Meijer\n等(1997)Plant J 11：263-276；Meijer等(2000)，同前)。\n[0016] 已证明多种I类HDZip蛋白参与光应答并且参与脱落酸(ABA)/水缺乏相关的\n应答 等(2003)Plant Cell Environ 26：1127-1136)。过表达I类HDZip \nATHBl、-3、-13、-20和-23的转基因拟南芥表明这些基因参与调控子叶以及叶子发育\n(Aoyama等(1995)Plant Cell 7：1773-1785；Hanson(2000)In Comprehensive summaries \nof Uppsala Dissertationsfrom the Faculty of Science and Technology,Uppsala)。\nATHB3、-13、-20和-23基因彼此相似，并构成I类HDZip一个独特的亚类。由于当这些基因\n组成型表达的时候引起相似的子叶形状变化，它们被称为尖子叶(pointedcotyledon，POC)\nHDZip基因。Hanson推断在系统发生方面密切相关的I类HDZip蛋白大多数情况下在功能\n方面也是相关的。\n[0017] 硝酸盐转运蛋白(NRT)\n[0018] 植物营固着生活，不得不依赖于土壤中的资源提供养分。土壤中的氮主要作为胺\n- -\n盐或硝酸盐存在。植物的氮吸收可以借助于三种NO3 吸收系统进行：NO3 浓度大于1mM时激\n-\n活的低亲和力转运系统，针对1μM至1mMNO3 浓度的组成型及诱导型高亲和力转运系统。这\n三种吸收系统以复杂的方式调控。硝酸盐一经吸收，便被转运至液泡或被还原成亚硝酸盐，\n后者依次又在叶绿体中被进一步代谢。硝酸盐也可以在质外体(apoplasm)中再次分泌，或\n分泌至木质部转运至枝条(shoot)。根细胞中负责硝酸盐吸收的蛋白质(NRT，硝酸盐转运\n蛋白)属于所谓的主要易化子超家族(MajorFacilitator Superfamily)，包括参与小分子\n溶质转运的蛋白质，且长度通常为450至600个氨基酸，具有12个跨膜结构域。NRT蛋白被\n归为两个家族：NRT1和NRT2(Crawford & Glass，Trends Plant Sci.3，389-395，1998)，且\n由多基因家族编码。NRT蛋白序列高度保守，例如来自藓类植物的NRT2蛋白与来自双子叶\n植物的NRT2蛋白享有60％的序列同一性，在双子叶植物群中，NRT2蛋白之间的序列同一性\n约为81％，而单子叶NRT2蛋白的序列同一性可高达89％。Orsel等深入研究了拟南芥的\nNRT2家族蛋白(Plant Physiol.129，886-896，2002)。该家族包括7个成员，分布在三条染\n色体上。蛋白质结构保守，且7个NRT2蛋白中的5个在初生植物的根中偏好表达。就结构\n而言，NRT2蛋白包括跨越蛋白质约90％的MFS_1结构域，以及C-末端跨膜结构域。MFS_1\n结构域本身据推测包括10或11个跨膜结构域。\n[0019] 认为NRT2蛋白主要与高亲和力转运系统有关。在高等植物中，这种高亲和力吸收\n系统据认为受由NRT2和NAR组成的双蛋白复合物控制，所述NAR蛋白功能尚不清楚(Zhou\n等FEBS Letters 466，225-227；Tong等Plant J.41，442-450，2005)。过表达NRT2提高这\n种高亲和力吸收系统的能力(Fraisier等Plant J.23，489-496)。NRT2可能也发挥硝酸盐\n感受器的功能(Little等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，13693-13698，2005)。\n[0020] Mori等研究了过表达稻NRT2基因的转基因稻类植物，并表明硝酸盐饥饿的幼苗\n-\n与野生型植物相比具有更好的NO3 吸收。Good等(US20050044585)公开了氮利用蛋白质特\n别是转氨酶水平升高的转基因植物，处于可能是也可能不是胁迫诱导型根特异性启动子的\n控制之下。这些植物表现出氮吸收效率提高，但是未报道对于种子产率的影响。另外，这篇\n文献还公开在植物中过表达硝酸盐转运蛋白并不为这些植物带来有利的生长特性。此外，\n尚未在正常生长条件下或就完整的植物生命周期研究过NRT蛋白。\n[0021] 增产蛋白质16(YEP16)\n[0022] YEP16多肽与F1F0-ATP合酶中ATPase δ结构域δ亚基的N-末端结构域享有一\n定的相似性(有关δ亚基的的细节，参阅InterPro IPR000711)。\n[0023] Shaggy样激酶\n[0024] 植物shaggy样激酶由多基因家族编码。已发现拟南芥基因组含有10个shaggy样\n激酶编码基因，它们被归为四个不同的亚家族。不同家族成员的蛋白质序列在全部激酶结\n构域中高度保守，不过N-和C-末端区域差异相当大，表明多种植物shaggy样激酶参与多\n种多样的生物过程，例如激素信号传导、发育和胁迫应答。基于蛋白质序列的同源性，可将\n植物shaggy样激酶归为四型(I-IV)，其中四型中的每一型都参与不同的过程(见图13)。\n除了可以获得拟南芥shaggy样激酶的全长cDNA序列以外，还可以在公共数据库中获得来\n自欧洲油菜(Brassica napus)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、\n稻(oryza sativa)、矮牵牛(Petunia hybrida)和玉蜀黍(Zea mays)等物种的shaggy样\n激酶的全长cDNA序列。AtGSK1为II型拟南芥shaggy样激酶的编码基因，已经报道其补偿\n酵母钙调磷酸酶突变体的盐敏感表型。已经表明幼苗中同一shaggy样激酶的产生被NaCl\n和脱落酸诱导。已经报道AtGSK1基因的过量产生诱导胁迫应答基因和花青素累积，并改变\n胞内阳离子水平，从而导致盐和干旱耐受性增强。\n[0025] 考虑到不同型的shaggy样激酶公知参与多种多样的生物过程，我们令人惊讶地\n发现两种不同型的shaggy样激酶参与同一生物过程即胁迫应答。我们出乎意料地发现不\n同于II型的其他型shaggy样激酶能够赋予植物对非生物胁迫增加的耐受性。\n[0026] 现已发现，调节植物中I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的表达；或调节\n植物中硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的表达；或调节植物中YEP16多肽编码\n核酸的表达；或调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物的表达，使植物相对于相应的野\n生型植物或其他对照植物具有改良的植物生长特性。\n发明内容\n[0027] 本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类HDZip hox5多\n肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中NRT或其同源物编码核酸的表达；或包\n括调节植物中YEP16多肽编码核酸的表达；或包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源\n物的表达。\n[0028] 选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或\n不含目的基因的相应植物。对照植物通常为同一植物物种，或者甚至与待评估植物为同一\n品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子(nullizygote)。如本文所用的“对照植\n物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。\n[0029] 有利地，实施根据本发明的方法产生相对于相应的野生型植物或其他对照植物生\n长特性改良的植物，特别是产率增加、生长改良、生物量改良、构造改良、细胞分裂改良和非\n生物胁迫耐受性提高中的一个或多个方面。\n[0030] 文中所定义的术语“增加的产率”是指以下任意一个或多个方面的增加，每种都相\n对于相应的野生型或其他对照植物而言：(i)植物一个或多个部分，特别是地上(可收获)\n部分增加的生物量(重量)，或增加的根生物量，增加的根体积，增加的根数量，增加的根直\n径或增加的根长度(粗根或细根)，或任何其它可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子\n总产率，这包括种子生物量(种子重量)的增加，并且其可以是每棵植株或单粒种子基础上\n的种子重量增加和/或每公顷或每英亩种子重量的增加；(iii)增加的每个圆锥花序的花\n(小花floret)的数量，其表达为饱满种子数占初期(primary)圆锥花序数的比率；(iv)增\n加的种子饱满率(以百分比表示，为饱满种子数占小花数的比例)；(v)增加的(饱满)种\n子数量；(vi)增加的种子大小，这也可以影响种子的组成；(vii)增加的种子体积，这也可\n以影响种子的组成(包括油、蛋白质和糖的总含量和组成)；(viii)增加的(单个或平均)\n种子面积；(ix)增加的(单个或平均)种子长度；(x)增加的(单个或平均)种子宽度；(x)\n增加的(单个或平均)种子周长；(xi)增加的收获指数(HI)，其表达为可收获部分如种子\n的产率占总生物量的比率；和(xii)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数量及其总\n重量外推得到。增加的TKW可来自于种子大小和/或种子重量的增加。增加的TKW还可以\n来自胚大小和/或胚乳大小的增加。\n[0031] 以谷物为例，产率增加可以表现为以下一个或多个方面：每公顷或每英亩建立的\n植物数量的增加，每棵植株谷穗数量的增加，行数、行粒数、粒重量、千粒重、谷穗长度/直\n径的增加，种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数乘以100)的增加，等等。以稻为例，\n产率增加可以表现为以下一个或多个方面：每公顷或每英亩的植物数量、每棵植株的圆锥\n花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序的花朵(小花)数量(其表达为饱满种\n子数占初期圆锥花序的比率)、种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数乘以100)的增\n加、千粒重的增加，等等。\n[0032] 由于本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于对照植物在其生命周期相应阶\n段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。增\n加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或者可以基本上遍及整\n株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为\n表示从成熟干种子生长至植物产生类似于起始材料的成熟干种子阶段所需的时间。此生\n命周期可以受到诸如早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影\n响。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个\n植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的\n活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比其他可能的情况更晚播种\n和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，\n可以允许播种同一植物物种更多的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻\n类植物、接着播种和收获更多的稻类植物)。与之类似，如果生长速率充分地增加，可以允\n许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，例如，播种和任选的\n收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。在一些作物植物的情况下，也有可能从同一根\n茎收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每英亩年生物量产量的增加(这是由于\n(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获次数的增加)。与野生型对应物相比，生\n长速率的增加还能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植作物的地域限制通常由种\n植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，可以避免这\n类不利条件。可以由生长曲线获取多种参数，来确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植\n物达到其最大大小50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需的时间)，等\n等。\n[0033] 实施本发明的方法产生与具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加\n植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸\n的表达；或包括调节植物中NRT或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中YEP16多\n肽编码核酸的表达；或包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物的表达。\n[0034] 无论植物处于非胁迫条件下，还是植物相对于对照植物接触多种胁迫，都发生产\n率和/或生长速率的增加。通常植物通过更加缓慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条\n件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致\n植物完全停止生长丧失重新开始生长能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致胁迫\n植物的生长与非胁迫条件下的对照植物相比，下降低于40％、35％或30％，优选低于25％、\n20％或15％，更优选低于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于耕作方法(灌溉、施肥、\n杀虫剂处理)的发展，栽培的作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受\n损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫可以是植物接触的日常的生物和/或非\n生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、无氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化\n胁迫以及热、冷或冰冻温度而引起。非生物胁迫可以是由于水胁迫(特别是由于干旱)、盐\n胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌\n和昆虫引起的那些胁迫。\n[0035] 实施根据本发明的方法导致植物对非生物胁迫具有增加的耐受性。如Wang等\n(Planta(2003)218：1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物\n化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁\n迫相互联系，并可以通过相似的机制诱导生长和细胞损害。例如，干旱和/或盐度主要表现\n为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱\n胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相\n似的细胞信号传导路径和细胞应答，例如应激蛋白的产生，抗氧化剂的上调、相容溶质的累\n积以及生长阻抑。\n[0036] 既然多种多样的环境胁迫激活相似的路径，本发明关于干旱胁迫的举例说明(在\n本发明涉及I类HDZip hox5多肽及其编码核酸的用途的情况下)不应视为局限于干旱胁\n迫，而更应视为表明I类HDZip hox5多肽或其同源物总体而言参与非生物胁迫的屏显信息\n(screen)。此外，本发明的方法可以在非胁迫条件下或者轻度干旱条件下实施，以提供相对\n于相应的野生型或其他对照植物具有改良的生长特性(特别是增加的产率)的植物。本文\n所用的术语“非胁迫”条件优选为植物最可能遇到的那些不显著背离平常气候的条件及其\n他非生物条件，优选为允许植物最佳生长的那些条件。本领域技术人员知晓给定地点的正\n常土壤条件和气候条件。\n[0037] 在干旱胁迫和高盐度胁迫之间报道存在特别高程度的“对话”(Rabbani等(2003)\nPlant Physiol 133：1755-1767)。因此，显然I类HDZiphox5多肽或其同源物连同其赋予\n植物干旱耐受性的用途一起，也将会在保护植物抵御多种其他非生物胁迫方面找到用武之\n地。与之相似，显然I型shaggy样激酶(如本文所定义的)连同其赋予植物盐耐受性的用\n途一起，也将会在保护植物抵御多种其他非生物胁迫方面找到用武之地。此外，Rabbani等\n(2003，Plant Physiol 133：1755-1767)报道，在双子叶和单子叶植物之间存在胁迫耐受性\n和应答的相似的分子机制。因此本发明的方法可以有利地应用于任何植物。\n[0038] 如本文所定义的术语“非生物胁迫”应理解为表示如下一个或多个方面：水胁迫\n(由于干旱或过量的水)、无氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冰冻温度)、化学毒性\n胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自水胁迫、盐胁迫、氧\n化胁迫和离子胁迫。优选水胁迫是干旱胁迫。术语盐胁迫不局限于常见盐，而可以是如下\n任何一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等等。\n[0039] 增加的非生物胁迫耐受性表现为非生物胁迫条件下增减的植物产率。特别是在本\n发明涉及I类HDZip hox5多肽及其编码核酸的用途的情况下，此类增加的产率可以包括如\n下一个或多个方面：增加的饱满种子数、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花数、\n增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度或增加的根直径，其中每一方面\n都相对于相应的野生型植物而言。\n[0040] 实施本发明的方法提供具有增加的非生物胁迫耐受性的植物。实施本发明的方法\n提供相对于在相当条件下生长的相应野生型植物或其他对照植物而言在非胁迫条件下或\n轻度干旱条件下生长的具有改良生长特性(特别是增加的产率)的植物。\n[0041] 根据本发明，提供了增加植物非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括调节植物\n中I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫\n是渗透胁迫，选自如下一个或多个方面：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选水胁迫\n是干旱胁迫。\n[0042] 本发明还提供了提高植物非生物胁迫耐受性的方法，包括增加植物中I型shaggy\n样激酶或其同源物的活性，所述I型shaggy样激酶具有：(i)与SEQ ID NO：147所示的氨\n基酸序列至少77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/V/N/Q E/G LK G/N和基序II：K \nQ/N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。\n[0043] 本发明还提供了改良在非胁迫条件下或轻度干旱条件下生长的植物的生长特性\n(特别是增加产率)的方法，所述方法包括调节植物中NRT多肽或其同源物编码核酸的表达\n(特别是增加其表达)。在本发明优选的实施方案中，根据本发明的方法在非胁迫条件下发\n生产率和/或生长速率的增加。\n[0044] 特别是在本发明涉及I类HDZip hox5多肽及其编码核酸的用途的情况下，实施本\n发明的方法导致绿度指数相对于相应的野生型植物增加。如本文所定义的绿度指数是数码\n相机记录的植物图像中黄色象素的比例(表达为％)。增加的绿度指数可以表明降低或延\n迟的衰老，这依次能够延长植物的光合作用活性，进而带来本领域众所周知的多种有益效\n果。\n[0045] 本发明因此提供了增加植物绿度指数的方法，所述方法包括调节植物中I类\nHDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的表达。优选绿度指数在非生物胁迫条件下增加，更\n优选在水胁迫条件下，还优选在干旱胁迫条件下。\n[0046] 在本发明的方法包括调节植物中I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸表达\n的情况下，优选增加的产率包括如下一个或多个方面：增加的饱满种子数、增加的种子总产\n率、增加的每个圆锥花序的花数、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度\n或增加的根直径，其中每一方面都相对于相应的野生型或其他对照植物而言。\n[0047] 根据本发明优选的方面，提供了相对于相应的野生型或其他对照植物增加植物产\n率的方法，所述方法包括调节植物中I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的表达。\n[0048] 在本发明的方法包括调节植物中NRT或其同源物编码核酸表达的情况下，优选所\n产生的植物具有增加的产率，且更特别地具有增加的生物量和/或增加的种子产率。优选\n增加的种子产率包括如下一个或多个方面的增加：(饱满)种子数量、种子总重量、种子大\n小、千粒重和收获指数，其中每一方面都相对于相应的野生型或其他对照植物而言。\n[0049] 根据本发明另一优选的方面，提供了增加植物产率的方法，所述方法包括调节植\n物中NRT多肽或其同源物编码核酸的表达(优选增加其活性和/或表达)。\n[0050] 在本发明的方法包括调节植物中YEP16多肽编码核酸表达的情况下，优选增加或\n提高的产率是相对于相应野生型植物种子产率而言提高的种子产率。\n[0051] 因此根据本发明另一优选的方面，提供了相对于相应的野生型或其他对照植物增\n加种子产率的方法，包括调节植物中YEP16多肽或其同源物编码核酸的表达。\n[0052] 在本发明的方法包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸表达的\n情况下，优选改良的生长特性是提高的非生物胁迫耐受性。\n[0053] 根据本发明另一优选的方面，提供了提高植物非生物胁迫耐受性的方法，包括调\n节植物中I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的表达(优选增加其活性和/或表达)\n所述I型shaggy样激酶具有(i)与SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列至少77％的序列同\n一性以及(ii)基序I：R/H/V/N/Q E/GLK G/N和基序II：K Q/N CXXX G/A/S，其中X可以是\n任意氨基酸。\n[0054] 因此可以有利地对任何植物应用本发明的方法。\n[0055] 本文所用术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、\n枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都包含目的基因/核酸。\n术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉\n和小孢子，同样其中上述每一种都包含目的基因/核酸。\n[0056] 在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于植物界(Viridiplantae)超家族\n的植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自以下的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、\n粮食作物、乔木或灌木：金合欢属物种(Acacia spp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴\n桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis \naustralis)、Albizia amara、三色桫椤(Alsophila tricolor)、须芒草属物种(Andropogon \nspp.)、落花生属物种(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Asteliafragrans、黄\n芪(Astragalus cicer)、Baikiaea plurijuga、桦木属物种(Betula spp.)、芸苔属物\n种（Brassica spp.)、木 榄（Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆 (Butea \nfrondosa)、Cadaba frinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、\n美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距瓣\n豆(Centroema pubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、\n小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermummopane、变异小冠花(Coronillia varia)、\n枸子(Cotoneaster serotina)、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis \nspp.)、柏木属物种(Cupressusspp.)、Cyathea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、圆球\n柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属物种(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、木梨\n(Cydoniaoblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蝗\n属物种(Desmodium spp.)、迪卡兰(Dicksonia squarosa)、Diheteropogonamplectens、\nDioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、锥穗稗(Echinochloa \npyramidalis)、Ehrartia spp.、穇 子(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺 桐\n属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、金茅\n(Fulalia villosa)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约罗(Feija sellowiana)、草\n雷属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、\nGeranium thunbergii、 银 杏 (Ginkgobiloba)、Glycine javanica、Gliricidia \nspp、陆 地 棉(Gossypium hirsutum)、银 桦 属 物 种(Grevillea spp.)、Guibourtia \ncoleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭\n黄茅(Heteropogoncontortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翅\n(Hypericumerectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物\n种(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、莴苣属物种\n(Lettuca spp.)、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、Lotonusbainesii、百脉根属\n物种(Lotus spp.)、硬皮豆(Macrotyloma axillare)、苹果属物种(Malus spp.)、Manihot \nesculenta、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉\n(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食草属物种(Onobrychis spp.)、\nOrnithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、非洲双翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草\n属物种(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、\n菜豆属物种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormiumcookianum、\n石楠属物种(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinus spp.)、豌\n豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、\nPogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花\n旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属\n物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、\nRhus natalensis、欧洲醋粟(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐\n(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属\n物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、\n北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍\n(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus \nalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium \ndistichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(TRifolium spp.)、小麦属\n物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、\n野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramida)、\n马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属植物(amaranth)、洋蓟\n(artichoke)、天门冬属(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brussels sprouts)、\n甘蓝、芸苔(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻、无头甘蓝\n(kale)、兵豆属(lentil)、油菜籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱、马铃薯、稻、大\n豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻类等等。\n[0057] 根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物如大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜\n籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。还优选植物为单子叶植物如甘蔗。更优选植物是谷类，例如\n稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。\n[0058] 可用于本发明方法的I类HDZip hox5多肽及其同源物I类HDZip hox5核酸/基\n因\n[0059] 如本文所定义的术语“I类HDZip hox5多肽或其同源物”是指这样的多肽，其从\nN-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮\n氨酸拉链。\n[0060] 另外，I类HDZip hox5多肽或其同源物可以包含如下任一或两者兼而有之：(a)\nTrp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe。在此基序中允许进\n行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。当从\nN-末端到C-末端研究蛋白质时，(b)中的基序位于酸性盒之前。\n[0061] 如上文所定义的I类HDZip hox5多肽的一个实例从N-末端到C末端包含：(i)\n酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链；并且另外包含：(a)\nTrp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe，如SEQ ID NO：2所\n示。更多这样的实例在本文实施例1表A中给出。\n[0062] I类HDZip hox5多肽或其同源物由I类HDZip hox5核酸/基因编码。因此如本\n文所定义的术语“I类HDZip hox5核酸/基因”是编码如上文定义的I类HDZip hox5多肽\n或其同源物的任何核酸/基因。\n[0063] 利用本领域众所周知的常规技术如通过序列比对，可以容易地鉴定I类HDZip \nhox5多肽或其同源物。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、\nBESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48；\n443-453)的算法寻找可以使匹配数最大化并使空位数最小化的两完整序列的比对。BLAST\n算法(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)计算序列同一性百分比，并统计分析\n两序列间的相似性。实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开地获得。例\n如，使用获自http://clustalw.genome.jp/sit-bin/nph-ClustalW的ClustalW多重序列\n比对算法(1.83版)，采用缺省的两两比对参数和百分比评分方法，可以容易地鉴定包含I\n类同源域和具5个以上七肽的亮氨酸拉链的I类HDZip hox5同源物。可以进行细微的手\n工编辑，以优化保守基序间的比对，这对于本领域技术人员将是显而易见的。\n[0064] 可以利用专业数据库来鉴定I类HDZip hox5蛋白的多种结构域，如同源域和\n亮氨酸拉链，例如：SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；\nLetunic 等 (2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.\nde/)、InterPro(Mulder 等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318；http://www.ebi.\nac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax \nfor biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence \ninterpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on \nIntelligent Systems forMolecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，\nLathrop R.，Searls D编 著，53-61 页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo 等，Nucl.Acids.\nRes.32：D134-D137，(2004)，http://www.expasy.org/prosite/) 或 Pfam(Bateman 等，\nNucleic Acids Research 30(1)：276-280 (2002)，http://www.sanger.\nac.uk/Software/Pfam/)。可以利用专业数据库进行亮氨酸拉链预测和七肽鉴定，如2ZIP，\n该数据库将标准卷曲螺旋预测算法和特征性亮氨酸重复单位的模拟搜索结合在一起\n(Bornberg-Bauer等(1998)Computational Approaches to Identify Leucine Zippers，\nNucleic Acids Res.，26(11)：2740-2746，http://2zip.molgen.mpg.de)。\n[0065] 此外，也可以容易地鉴定酸性盒的存在。可以利用来自ExPASy服务器的软件程\n序计算一级氨基酸组成(以％表示)，以确定多肽结构域是否富含特定的氨基酸，特别是\nProtParam工具(Gasteiger E等(2003)ExPASy：the proteomics server for in-depth \nprotein knowledge and analysis.NucleicAcids Res 31：3784-3788)。然后可以将目的\n蛋白质的组成与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均氨基酸组成(以％表示)进行比\n较。在该Swiss-Prot数据库内，平均Asp(D)和Glu(E)含量分别为5.3％和6.6％，组合平\n均值为11.9％。作为实例，SEQ ID NO：2的酸性盒含9.1％的D和54.5％的E，组合平均\n值为63.6％。如本文所定义的那样，酸性富含盒具有高于Swiss-Prot蛋白质序列数据库\n中蛋白质平均氨基酸组成(以％表示)的组合Asp(D)和Glu(E)含量(以％表示)。酸性\n盒可以是转录激活结构域的一部分。已根据真核转录激活结构域的氨基酸含量对其进行\n了分类，且主要的类别包括酸性、谷氨酰胺富含和脯氨酸富含激活结构域(Rutherford等\n(2005)Plant J.43(5)：769-88，及其中的参考文献)。\n[0066] I类HDZip hox5多肽或其同源物中的一部分蛋白质还包含RPFF氨基酸基序，其中\nR为Arg，P为Pro，而F为Phe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，\n和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，此基\n序位于酸性盒之前(见图2)。可以利用上文所述的用于比较的序列比对方法来鉴定RPFF\n的存在。在一些情况下，可以调整缺省参数，以更改搜索的严格度。例如利用BLAST，可以增\n加用于报告数据库序列匹配事件的统计学意义阈值(称为“预期”值，即E值)，以显示低严\n格度的匹配事件。通过这种方式可以鉴定短的几乎精确匹配的事件。\n[0067] I类HDZip hox5多肽或其同源物中的一部分蛋白质还包含Trp尾巴。如本文所定\n义的Trp尾巴是蛋白质C-末端包含至少一个Trp残基的最后10个氨基酸(见图2)。\n[0068] I类HDZip hox5多肽或其同源物的实例(由括号中的多核苷酸序列登录号编码)\n在表A中给出。\n[0069] 应该理解的是，落入“I类HDZip hox5多肽或其同源物”定义的序列不限于表A\n中所给出的氨基酸序列，而是任何这样的多肽，其从N-末端到C末端包含：(i)酸性盒；和\n(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链，均适用于实施本发明的方法。\n[0070] I类HDZip hox5多肽或其同源物具有DNA结合活性，优选结合在中心位置处重叠\n的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母单杂交试验中检测到的那样(Meijer等(2000)\nMol Gen Genet 263：12-21)。在稻细胞悬浮液的瞬时测定中，与GUS报告基因共同轰击I\n类HDZip hox5多肽导致染色斑点数目增加，这些斑点颜色也更深(Meijer等，同前)。此测\n定可用于证明I类HDZip hox5多肽或其同源物的激活因子功能。\n[0071] 可用于本发明方法的NRT多肽及其同源物和编码它们的核酸\n[0072] 如本文所定义的术语“NRT或其同源物”是指这样的多肽，其包含(i)MFS_1结构\n域(Pfam登录号PF07690，InterPro登录号IPR011701)，接着的(ii)跨膜结构域。图6给\n出了一个实例。优选NRT蛋白或其同源物具有NRT活性如高亲和力硝酸盐转运，并且不含\nPTR2结构域(Pfam登录号PF00854，InterPro登录号IPR000109)。\n[0073] 优选NRT蛋白或其同源物包含标签序列1(SEQ ID NO：57)：\n[0074] (N/S)(Y/P)(T/G/S/A)W(I/V/L)(F/L/T)(V/A/F/L)(L/V/M/I)(L/T/I/A/N)YG(Y/\nF)(S/C/T)(M/F/Y)G(V/I)EL(T/S)(T/I/V)(D/G/N)N(V/I/N)(I/V)(A/S/H/V)(E/Q/G)Y。\n[0075] 还优选NRT蛋白或其同源物包含如下一项或多项：\n[0076] 标签序列2(SEQ ID NO：58)：\n[0077] LG(P/A)RYG(C/T)AF(L/S)；\n[0078] 标签序列3(SEQ ID NO：59)：\n[0079] STFAA(A/R)PL(V/I)(P/V)(I/L/V)IR(D/E)NL(N/D)(L/P)；\n[0080] 标签序列4(SEQ ID NO：60)：\n[0081] VRF(L/M)IGF(S/C)LA；\n[0082] 标签序列5(SEQ ID NO：61)：\n[0083] FVSC(Q/R)YW(M/T)S(T/V)(M/S)(F/M)。\n[0084] 更优选NRT蛋白或其同源物包含如下一项或多项：\n[0085] 标签序列6(SEQ ID NO：62)：\n[0086] K(A/Q/S/M/H/T)D(I/V)GNAGVASV(S/T)G(S/A)I(F/L)SR(L/G)；\n[0087] 标签序列7(SEQ ID NO：63)：\n[0088] NG(L/T/C)A(A/G)GWG；\n[0089] 标签序列8(SE ID NO：64)：\n[0090] G(A/S)G(L/V/Q)TQ(L/P)(L/V/I)(F/E)F(T/S/D)(S/T)(S/A/T)。\n[0091] 最优选NRT蛋白如SEQ ID NO：53所示。\n[0092] 跨膜结构域长约15至30个氨基酸，并且通常由形成α螺旋的疏水残基构成。它\n们通常是基于疏水性预测的(例如Klein等，Biochim.Biophys.Acta 815，468，1985；或\nSonnhammer等，In J.Glasgow，T.Littlejohn，F.Major，R.Lathrop，D.Sankoff和C.Sensen\n编著，Proceedings ofthe SixthInternational Conference on Intelligent Systems for \nMolecular Biology，第175-182页，Menlo Park，CA，1998.AAAI Press)。\n[0093] 可选地，NRT蛋白的同源物按照递增的优选顺序与SEQ ID NO：53所示的氨基酸具\n有50％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、\n69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、\n84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或\n99％的总体序列同一性。总体序列同一性利用全局比对算法进行确定，例如GAP程序(GCG \nWisconsin软件包，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用缺省参数。\n[0094] 可以利用专业数据库来鉴定NRT蛋白的多种结构域，例如SMART(Schultz等\n(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic 等 (2002)Nucleic Acids \nRes 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.de/)InterPro(Mulder 等，(2003)\nNucl.Acids.Res.31，315-318；http://www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher\n和Bairoch(1994)，Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences \nmotifs and itsfunction in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；\nProceedings2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular \nBiology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D 编 著，53-61 页，\nAAAIPress，Menlo Park；Hulo 等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)，http://\nwww.expasy.org/prosite/) 或 Pfam(Bateman 等，Nucleic AcidsResearch 30(1)：\n276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。\n[0095] 搜索和鉴定NRT同源物的方法完全落入本领域技术人员的能力范围之类。这类\n方法包括将计算机可读形式SEQ ID NO：1或2所代表的序列与公共数据库中可用的序\n列进行比较，如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/\nGenbank/index.html)或EMBL核苷酸数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，\n使用本领域公知的序列比对或比较算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；\n443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in \nApplied Mathematics 2；482-489(1981)))、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，\nW.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.，J.Mol. Biol.215：403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W. \nR.Pearson和D.J.LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448(1988))。执行BLAST分\n析的软件可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。\n[0096] 落入“NRT多肽或其同源物”定义的蛋白质的实例包括稻类蛋白质以及来自其他\n物种的蛋白质，如玉蜀黍、芦苇(Phragmites australis)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦\n(Triticum aestivum)、欧洲油菜、蕃茄(Lycopersiconesculentum)、烟草、胡萝卜(Daucus \ncarota)、欧洲山杨(Populus tremulus)、Lotus japonica、桃(Prunus persica)、大豆\n(Glycine max)和拟南芥，等等。NRT蛋白实例的非限制性列表在本文实施例14的表I中\n给出。\n[0097] 不过，考虑来自其他植物分类如藓类植物或蕨类植物的NRT蛋白可以等同地用于\n本发明的方法。例如，藓类植物小立碗藓(Physcomitrellapatens)拥有至少5种NRT蛋白\n(GenBank登录号BAD00097、BAD00098、BAD00099、BAD00100、BAD00101)。\n[0098] 应当理解，术语“NRT多肽或其同源物”不局限于SEQ ID NO：53所示的或表I中所\n给出的序列，而是任何满足如下标准的多肽：包含功能性MFS 1结构域，和一个或多个SEQ \nID NO：57至64的保守标签序列，以及位于上文定义的MFS_1结构域C-末端的跨膜结构域；\n或者与SEQ IDNO：53的序列具有至少50％的序列同一性，均适用于实施本发明的方法。\n[0099] 为确定NRT的转运蛋白活性，采用Tong等(Plant J.41，442-450，2005)所述的硝\n15\n酸盐吸收测定。简言之，在爪蟾(Xenopus)卵母细胞中表达目的NRT蛋白，并测量 N富集\n硝酸盐的吸收。如果需要，可以共表达nar2基因，以增加硝酸盐转运。\n[0100] 可选地，NRT蛋白或其同源物的活性可以通过在稻栽培种日本晴(Oryza sativa \ncultivar Nipponbare)中表达处于GOS2启动子控制之下的NRT多肽或其同源物来进行测\n定，这将产生与相应的野生型植物相比具有增加的地上生物量和/或增加的种子产率的植\n物。这种种子产率的增加可以通过多种方式衡量，例如种子总重量、饱满种子数量或种子总\n数的增加，收获指数的增加或每个圆锥花序花朵的增加。\n[0101] NRT蛋白或其同源物由NRT核酸/基因编码。因此如本文所定义的术语“NRT核酸\n/基因”是编码如上文定义的NRT蛋白或其同源物的任何核酸/基因。\n[0102] 可用于本发明方法的YEP16多肽及其同源物和编码它们的核酸\n[0103] 术语“YEP16多肽”是指SEQ ID NO：128的序列。YEP16多肽的同源物是指按照\n递增的优选顺序与SEQ ID NO：128的氨基酸序列享有至少30％、35％、40％、45％、50％、\n55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性的任何氨基酸序列。因此本\n文述及的“YEP16多肽或其同源物编码核酸”是指编码如上文定义的YEP16多肽的任何核酸\n序列，或编码如上文定义的YEP16多肽同源物的任何核酸。\n[0104] 可用于本发明方法的I型shaggy样激酶及其同源物和编码它们的核酸\n[0105] 如本文所定义的术语“I型shaggy样激酶或其同源物”是指这样的多肽，其具有：\n(i)与SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列至少77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/\nV/N/Q E/G LK G/N和基序II：K Q/N CXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。满足前述要求\n的多肽能够使I型shaggy样激酶区别于其他型shaggy样激酶。\n[0106] 可以利用本领域技术人员熟知的常规技术容易地鉴定落入上文定义的“I型\nshaggy样激酶或其同源物”。例如，通过序列比对可以容易地确定与SEQ ID NO：147所示\n的氨基酸具有至少77％同一性的多肽。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的，此\n类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch(J.Mol.\nBiol.48；443-453，1970)的算法寻找可以使匹配数最大化并使空位数最小化的两完整序\n列的比对。BLAST算法计算序列同一性百分比，并统计分析两序列间的相似性。实施BLAST\n分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开地获得。例如，利用VNTI AlignX多重比对程\n序，基于改进的clustal W算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)，\n采用缺省设置，空位开放罚分为10且空位延伸为0.05，通过将查询氨基酸序列与已知的I\n型shaggy样激酶序列进行比对(例如参见图14所示的比对)，可以容易地鉴定与SEQ ID \nNO：147所示的氨基酸具有至少77％同一性的shaggy样激酶或其同源物。\n[0107] 本领域技术人员也能够容易地鉴定这样的序列，其具有基序I：R/H/V/N/Q E/G LK \nG/N和基序II：K Q/N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。这可以通过进行比对以及搜\n索同源区域来实现。\n[0108] 下表1显示了SEQ ID NO：147的序列中发现的基序I：R/H/V/N/Q E/GLK G/N和\n基序II：K Q/N CXXX G/A/S(其中X可以是任意氨基酸)，以及同源序列中相应的基序。表\n1所示的总体同一性百分比系将SEQ ID NO：147与表中所示的登录号进行比较(全长序列\n对全长序列)。\n[0109] 表1：I型shaggy样激酶及其同源物中发现的保守基序\n[0110] \n 登录号： 基因名称 基序1 基序2 与SEQ ID NO：147\n I型shaggy样激酶 的总体同一性％\n (EMBOSS)\n BAB40983.1 稻OSKγ HELKG KQCSYAG -\n (SEQ ID NO：147)\n AY103545 玉米 HELKG KQCSYVG 94.4％\n AY108486 玉米 HELKN KQCAFVG 84.4％\n AAM77397.1 小麦 HELKG KNCAFVG 80.9％\n[0111] \n CAA48538.1， 拟南芥ASKα HELKG KQCPWLG 85.6％\n At5g26750\n CAA48474.1 苜蓿MSK-1 HELKG KQCPFLG 83.5％\n CAA04265 拟南芥Askα HGLKG KQCPWLG 84.6％\n CAA54803.1 烟草NtK1 HELKG KQCPSLG 85.3％\n CAA48472.1 苜蓿MSK3 NELKG KQCALFG 85.0％\n CAA48473.1 苜蓿MSK2 VELKG KQCSLFA 82.0％\n CAA58594.1 矮牵牛Shaggy4 QELKG KQCTFLG 81.5％\n At5g14640 拟南芥ASKε QELKG KQCSFLA 83.9％\n At3g05840 拟南芥ASKγ HELKG KQCPWLS 84.6％\n CAA04265 稻shaggyα HGLKG KQCPWLG 84.6％\n AK058276 稻shaggy HELKG KQCAFVG 83.2％\n AK099599 稻Shaggy RELKG KQCAFLG 78.5％\n 其他型shaggy样\n At4g18710 拟南芥Askη 无 无 70.0％\n At2g30980 拟南芥Askζ 无 无 72.9％\n At4g00720 拟南芥Askθ 无 无 64.1％\n At1g57870 拟南芥Askδ 无 无 73.4％\n At1g09840 拟南芥Askκ 无 无 72.4％\n At1g06390 拟南芥Askι 无 无 71.6％\n At3g61160 拟南芥Askβ 无 无 61.3％\n[0112] 落入“shaggy样激酶或其同源物”定义的多肽的实例包括如下序列：来自稻的\nshaggy样激酶γSEQ ID NO：147(NCBI登录号AB059621)；来自稻的shaggy样激酶SEQ \nID NO：149(NCBI登录号AK058276)；来自稻的shaggy样激酶SEQ ID NO：151(NCBI登录号\nAK099599)；来自拟南芥的shaggy样激酶αSEQ ID NO：153(NCBI登录号At5g26750)；来自\n拟南芥的shaggy样激酶γSEQ ID NO：155(NCBI登录号At3g05840)；来自拟南芥的shaggy\n样激酶αSEQ ID NO：157(NCBI登录号CAA48538.1)；来自拟南芥的shaggy样激酶εSEQ \nID NO：159(NCBI登录号At5g14640)；来自拟南芥的shaggy样激酶γSEQ ID NO：161(NCBI\n登录号CAA73247.1)；来自玉蜀黍的SEQ ID NO：163(NCBI登录号AY103545)；来自玉蜀黍\n的SEQ ID NO：165(NCBI登录号AY108486.1)；来自苜蓿的SEQ ID NO：167(NCBI登录号\nCAA48472.1)；来自苜蓿的SEQ ID NO：169(NCBI登录号CAA48474.1)；来自苜蓿的SEQ ID \nNO：171(NCBI登录号CAA48473.1)；来自烟草的SEQ ID NO：173(NCBI登录号CAA54803.1)；\n来自小麦的shaggy样激酶的蛋白质推测物SEQ ID NO：175(NCBI登录号AAM77397.1)；来\n自矮牵牛的SEQ ID NO：177(NCBI登录号CAA58594.1)。\n[0113] 术语“shaggy样激酶或其同源物”不局限于前述段落提及的SEQ IDNO所示的序\n列，而是任何满足如下标准的多肽：其具有(i)与SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列至少\n77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/V/N/QE/G LK G/N和基序II：K Q/N CXXX G/A/\nS，其中X可以是任意氨基酸，均适用于实施本发明的方法。\n[0114] Shaggy样激酶正如其名字所暗示的那样，具有激酶活性。《生物化学》杂志\n(The Biochemical Journal，卷303(Pt3)，1994年11月1日，701-704页(Stambolic和\nWoodgett))报道了有关其动物同源物糖原合酶激酶-3(GSK-3)的测定。\n[0115] 可用于本发明方法的序列不局限于前述I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5核\n酸和多肽；或前述NRT多肽及其编码核酸；或前述YEP16多肽及其编码核酸；或前述I\n型Shaggy样激酶及其编码多肽。根据本发明的方法也可以利用I类同源域亮氨酸拉链\n(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的变体；或利用NRT多肽或其同源物编码核酸的变\n体；或利用YEP16多肽或及同源物编码核酸的变体；或利用I型Shaggy样激酶及其同源物\n编码核酸的变体来实施。\n[0116] 这类变体的实例包括“部分”、杂交序列、等位基因变体、剪接变体以及通过基因改\n组获得的变体。\n[0117] 例如，可以通过对核酸进行一处或多处缺失来制备“部分”。“部分”可以以分离的\n形式使用，或者可以与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如，生产组合了若干活性的\n蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比预测的“部分”要大。\n[0118] 在用于本发明方法的序列为I类HDZip hox5的情况下，“部分”编码的多肽从N-末\n端到C末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉\n链。优选“部分”为表A所示核酸之一的部分。最优选“部分”为SEQ ID NO：1所示核酸的\n部分。\n[0119] 在用于本发明方法的序列为NRT编码核酸的情况下，“部分”是指编码这样的多肽\n的DNA片段，所述多肽包含MFS 1结构域和位于所述MFS 1结构域C-末端的跨膜结构域。\n优选“部分”包含上文定义的一个或多个标签序列。优选“部分”为表I所示核酸之一的部\n分。最优选“部分”为SEQ ID NO：52所示核酸的部分。\n[0120] 在用于本发明方法的序列为YEP16编码核酸的情况下，“部分”是指编码YEP16多\n肽或其同源物的DNA片段，按照递增的优选顺序，具有SEQID NO：127或SEQ ID NO：129所\n示核酸序列的至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、\n475、500、525、550、575个连续核苷酸，或者其中“部分”按照递增的优选顺序，具有YEP16\n多肽或其同源物编码核酸序列的至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、\n375、400、425、450、475、500、525、550、575个连续核苷酸。优选“部分”为SEQ ID NO：127或\nSEQ IDNO：129所示核酸的部分。\n[0121] 在用于本发明方法的序列为I型Shaggy样激酶的情况下，“部分”是指编码Shaggy\n样激酶的长度至少为1,200个核苷酸的DNA片段，且所述“部分”编码的多肽具有：(i)与\nSEQ ID NO：147所示的氨基酸序列至少77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/V/N/Q \nE/G LK G/N和基序II：KQ/N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。优选“部分”为SEQ \nID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：\n156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、\nSEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：176中任\n一所示核酸的部分。\n[0122] 本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中编码I类同源域亮\n氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物的核酸的部分的表达；或包括调节植物中编码NRT\n多肽或其同源物的核酸的部分的表达；或包括调节植物中编码YEP16多肽或其同源物的核\n酸的部分的表达；或包括调节植物中编码I型shaggy样激酶或其同源物的核酸的部分的表\n达。\n[0123] 另一类核酸变体为这样的核酸，其能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与I\n类HDZip hox5核酸/基因或其同源物编码核酸；或与NRT多肽或其同源物编码核酸；或与\nYEP16多肽或其同源物编码核酸；或与I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸杂交。\n[0124] 本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交\n过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以如此进行，即互补\n核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此\n进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者例如用照相\n平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。\n为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除\n去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和\n杂交缓冲液组成等条件的影响。\n[0125] 在核酸杂交实验，如DNA和RNA杂交(Southern和Northern杂交)的情况下，“严\n格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”取决于序列，并且在不同的环境参数下不同。熟练的\n技术人员知晓可以在杂交和洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。\n[0126] Tm是在确定的离子强度和pH值下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。\nTm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。\n在低于Tm值16℃到32℃获得最大杂交率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链\n之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显。每个百\n分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲\n酰胺能够使杂交在30到45℃完成，不过这将降低杂交率。碱基对错配降低杂交率和双链体\n的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。Tm值可以\n用取决于杂合体类型的下列方程式计算：\n[0127] 1.DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：\n[0128] Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61×％甲酰胺\n[0129] 2.DNA-RNA或RNA-RNA杂合体：\n[0130] Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc\n[0131] 3.寡DNA或寡RNAd杂合体：\n[0132] ＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)\n[0133] 20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)\n[0134] a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围精确。\n[0135] b仅对于范围30％到75％的％GC精确。\n[0136] cL＝双链体的碱基对长度。\n[0137] d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。\n[0138] 注释对于每1％甲酰胺，Tm值降低约0.6到0.7℃，而6M尿素的存在可使Tm值降\n低约30℃。\n[0139] 杂交特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释\n的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越\n低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性条件下进\n行。一般地，如上设置适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的严格条件。也可以选择\n更高或更低的严格性条件。通常，对于在确定的离子强度和pH值下的特定序列，选择比热\n解链温度(Tm)低约50℃的低严格条件。中等严格条件是温度比Tm低20℃，高严格条件是\n温度比Tm低10℃。例如，严格条件是至少像例如条件A-L一样严格；降低的严格条件是至\n少像例如条件M-R一样严格。可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，所述\n技术诸如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及\n用RNA酶处理。下表2列出了杂交和洗涤条件的实例。\n[0140] 表2：杂交和洗涤条件的实例\n[0141] \n[0142] \n[0143] “杂合体长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对\n序列及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。\n[0144] 在杂交和洗涤缓冲液中，可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和\n1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤\n15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt′s试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变\n性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠、和高达50％的甲酰胺。\n[0145] ＊Tb-Tr：对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链\n温度Tm低5-10℃；根据上述方程式确定Tm。\n[0146] ±本发明还包括以PNA或修饰的核酸来取代任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。\n[0147] 为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)《分子克隆：实验室手册》第3\n版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John \nWiley & Sons，N.Y.(1989)。\n[0148] 在用于本发明方法的序列为I类HDZip hox5的情况下，杂交序列编码的多肽从\nN-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮\n氨酸拉链。优选杂交序列能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与表A所示的核酸之\n一或如上文所定义的其部分杂交。最优选所述部分为SEQ ID NO：1所示的核酸的部分。\n[0149] 在用于本发明方法的序列为NRT多肽或其同源物编码核酸的情况下，杂交序列为\n能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与NRT核酸/基因杂交的核酸/基因，所述NRT\n核酸/基因编码的多肽包含MFS_1结构域和位于所述MFS_1结构域C-末端的跨膜结构域，\n且优选还包含上文定义的一个或多个标签序列。优选杂交序列能够与实施例14表I所示\n核酸或与表I所示任一核酸的部分杂交，其中“部分”如上文所定义。最优选杂交序列能够\n与SEQ ID NO：52杂交。\n[0150] 在用于本发明方法的序列为YEP16多肽或其同源物编码核酸的情况下，杂交序列\n为这样的核酸序列，其能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与编码YEP16多肽或其\n同源物的核酸序列杂交。优选杂交序列能够在降低的严格条件下与SEQ ID NO：127或SEQ \nID NO：129所示的核酸杂交。\n[0151] 在用于本发明方法的核酸为I型shaggy样激酶编码核酸的情况下，杂交序列为这\n样的核酸，其能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与上文定义的I型shaggy样激酶\n编码核酸/基因杂交，所述杂交序列编码的多肽具有：(i)与SEQ ID NO：147所示的氨基酸\n序列至少77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/V/N/Q E/G LK G/N和基序II：K Q/N \nCXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。杂交序列长度至少为1,200个核苷酸。优选杂交\n序列能够与SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQID NO：152、SEQ ID NO：\n154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ \nID NO：166、SEQID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：174和SEQID NO：\n176中任一所示的核酸杂交。\n[0152] 本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中能够在降低的严格\n条件、优选在严格条件下与I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸\n杂交的核酸的表达；或包括调节植物中能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与NRT\n多肽或其同源物编码核酸杂交的核酸的表达；或包括调节植物中能够在降低的严格条件、\n优选在严格条件下与YEP16多肽或其同源物编码核酸杂交的核酸的表达；或包括调节植物\n中能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸杂\n交的核酸的表达。\n[0153] 核酸或其变体可以来自任何天然或人工的来源。核酸/基因或其变体可以分离自\n微生物来源如酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物(包括人类)来源。可以通过仔细的\n人为操作在组成和/或基因组环境方面修饰所述核酸的天然形式。优选植物来源的核酸，\n无论来源于同一植物物种(例如对于其待引入的物种而言)或来源于不同植物物种。可以\n从单子叶物种，优选从禾本科(Poaceae)，更优选从稻属，最优选从稻中分离所述核酸。可以\n从双子叶物种，优选从十字花科(Brassicaceae)，更优选从拟南芥分离所述核酸。\n[0154] 可以通过引入遗传修饰(优选在所讨论的基因座)来调节核酸的表达。本文所定\n义的基因座意指基因组区，其包括目的基因和编码区上游或下游的10kb。\n[0155] 例如，可以通过如下任何一种(或多种)方法引入遗传修饰：T-DNA激活、\nTILLING、定点诱变、定向进化和同源重组，或通过在植物中引入和表达I类HDZip hox5多\n肽或其同源物编码核酸；或通过在植物中引入和表达NRT或其同源物编码核酸；或通过在\n植物中引入和表达YEP16或其同源物编码核酸；或通过在植物中引入和表达I型shaggy样\n激酶或其同源物编码核酸。引入遗传修饰之后的步骤是选择表达经调节的核酸，所述表达\n调节使植物具有改良的植物生长特性，特别是增加的产率。\n[0156] T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子\n(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游\n或下游10kb，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶向基\n因表达的调控被破坏，基因受新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。此T-DNA\n随机插入植物基因组，例如，通过农杆菌(Agrobacterium)感染插入，并导致在插入T-DNA\n附近的基因过表达。得到的转基因植物由于引入的启动子附近基因过表达而表现出显性表\n型。待引入的启动子可以是任意能够在期望生物体内[在本案中是植物]指导基因表达\n的启动子。例如，组成型的、组织偏好型的、细胞类型偏好型的和诱导型的启动子都适用于\nT-DNA激活。\n[0157] 也可以通过TILLING(靶向诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰引入所讨论\n的基因座。这是一种诱变技术，用于产生和/或鉴定并分离诱变的变体。TILLING还允许\n选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体甚至可能表现出比天然形式的基因所表现的\n更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的\n步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)In Methods in Arabidopsis Research，\nKoncz C，Chua NH，Schell J编著Singapore，World Scientific PublishingCo，16-82页；\nFeldmann等(1994)In Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.Cold Spring \nHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172页；Lightner J和Caspar \nT(1998)In J Martinez-Zapater，JSalinas编著，Methods on Molecular Biology，卷82 \nHumana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩\n增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中库中存在的杂双链体会在色谱图上检\n测到额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领\n域众所周知的(McCallum等(2000)NatBiotechnol 18：455-7，由Stemple综述(2004)Nat \nRev Genet 5(2)：145-50)。\n[0158] 定点诱变可用于产生变体核酸。多种方法可用来实现定点诱变，最常用的是基\n于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著，www.4ulr.com/\nproducts/currentprotocols/index.html)。\n[0159] 定向进化或者说基因改组也可以用来产生核酸变体。这包括DNA改组的重复，\n随后是适当的筛选和/或选择，以产生具有修饰的生物活性的变体(Castle等，(2004)\nScience 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。\n[0160] TDNA激活、TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生新的等位基因和变体的技术\n的实例。\n[0161] 同源重组能够向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸。同源重组是生物\n科学中常规使用的标准技术，其用于低等生物体如酵母或小立碗藓。在植物中实施同源\n重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，\n而且也在作物植物如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和\nTerada(2004)Curr Opin Biotech15(2)：132-8)。所靶向的核酸无需靶向所讨论的基因座，\n而是可以引入到例如高表达区域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替换内源\n基因或除内源基因之外再额外引入。\n[0162] 引入遗传修饰的优选方法是在植物中引入和表达I类HDZip hox5多肽或其同\n源物编码核酸；或在植物中引入和表达NRT或其同源物编码核酸；或在植物中引入和表达\nYEP16或其同源物编码核酸；或在植物中引入和表达I型shaggy样激酶或其同源物编码核\n酸。引入植物的核酸可以是全长的核酸或者是上文定义的“部分”或杂交序列。\n[0163] 在用于本发明方法的序列是YEP16多肽或其同源物的情况下，优选靶向质体；这\n样将蛋白质靶向质体的方法是本领域众所周知的，就如同使用转运肽进行此类靶向那样。\n下表3显示了适于将任何YEP16多肽或其同源物靶向质体、优选叶绿体的转运肽的实例。优\n选使用对于SEQ ID NO：128的YEP16多肽序列而言天然的转运肽，其天然转运肽如SEQ ID \nNO：131所示。SEQ ID NO：130代表YEP16多肽连同其用于靶向叶绿体的天然转运肽(SEQ \nID NO：129代表编码SEQ ID NO：130的氨基酸序列的核酸序列)。最优选使用SEQ ID NO：\n131所示的天然转运肽来靶向SEQ ID NO：128所示的YEP16多肽，不过任何转运肽都可与\nYEP16多肽或其同源物一起使用。\n[0164] 表3：用于将氨基酸靶向质体的转运肽序列的实例\n[0165] \n NCBI登录号 来源生物 蛋白质功能 转运肽序列\n /SEQ ID NO\n SEQ ID NO：131 MDTLSASVSSLNLPSLPPPPQPPLRSISSRF\n KSTVNATTSASSTNLSKPTSSSPSSS\n SEQ ID NO：132- 衣藻 铁氧还蛋白 MAMAMRSTFAARVGAKPAVRGARPASR\n P07839 (Chlamydomonas) MSCMA\n SEQ ID NO：133- 衣藻 Rubisco活化酶 MQVTMKSSAVSGQRVGGARVATRSVRR\n AR23425 AQLQV\n SEQ ID NO：134- 拟南芥 asp转氨酶 MASLMLSLGSTSLLPREINKDKLKLGTSA\n AA56932 SNPFLKAKSFSRVTMTVAVKPSR\n SEQ ID NO：135- 拟南芥 酰基载体蛋白1 MATQFSASVSLQTSCLATTRISFQKPALIS\n CAA31991 NHGKTNLSFNLRRSIPSRRLSVSC\n SEQ IDNO：136- 拟南芥 酰基载体蛋白2 MASIAASASISLQARPRQLAIAASQVKSF\n CAB63798 SNGRRSSLSFNLRQLPTRLTVSCAAKPET\n VDKVCAVVRKQL\n SEQ IDNO：137- 拟南芥 酰基载体蛋白3 MASIATSASTSLQARPRQLVIGAKQVKSF\n CAB63799 SYGSRSNLSFNLRQLPTRLTVYCAAKPET\n VDKVCAVVRKQLSLKE\n SEQ ID NO： 拟南芥 ATP硫酸化酶 MASSAAAIVSGSPFRSSPLIHNHHASRYA\n 138-NP_199191 PGSISVVSLPRQVSRRGLSVKS\n SEQ IDNO：139- 欧洲油菜 RuBisCO亚基 MATANALSSPSVLCSSRQGKLSGGSQQK\n CAA81736 结合蛋白α亚基 GQRVSYRKANRRFSLRANVKEIAFDQSS\n[0166] \nVVNRGRPGLTLGVADALKDIGAQLAAR AITVGDNVVKPSGFEDL SVPLGATSKLGQFPAVSTASSAMVTPAM KIGEIPWVQMCRIRGGNSVSAS SANSRR VWKSRILYDVQKLLAETSLPPLYSLTEFK HERFIFGVKSFELCP STKRIHFNHPTADHRLSPSSSSALRFITTM AAVIFRRSGGSTLIRKFSLSNKSSFSFTNSI TKCGSALYDILDQKTLPETAVVADETPPS HETGIRWKDK ISSPVLASSHQPSVRPLVISRSCCAMSTEM AKNVRVSSKTTMRLSEGFLSSSKLSKLN ILGKDTTAKALFEELSDGLECKTVLSSNK ITRLAEGMCMMLR \n羧 合 磷\n酸磷二- 酸氨胱 二-7，1-\n5，1- 基亚 半酰氨 糖酮\n糖 小 谷 庚\n酮 酶 - 酶 天 酶\n核 化 γ 成 景 酸 \n)\naeca\n) relo\n蓿 oga alut aic\n麦 苜藜 cide acnu 菜 anip\n大 蒺 M( rt 菠 S( \n-0 -14 -2\n41： 1：O 41：\nONDI 9307 N DI 4332 ONDI 4011\n QES 8AAA QES 8CAA QES 8BAA\n \n[0167] 蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰\n蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其衍生自的未修饰蛋白质具有相似的\n生物活性和功能活性。为产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸可以由具有相似特性(如\n相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它\n氨基酸所替换。保守取代表是本领域众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.\nW.H.Freemanand Company和下表4)。用于根据本发明方法的同源物优选为这样的多肽，其\n按照递增的优选顺序与本文提及的可用于本发明方法的序列[例如本文表A和I所示的序\n列]具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％\n或更高的序列同一性或相似性(功能同一性)。\n[0168] 术语“同源物”也包括两种特殊形式的同源物，这包括直系同源序列和旁系同源序\n列，其涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。术语“旁系同源物”与产生旁系同源基因的\n物种基因组内的基因复制有关。术语“直系同源物”与不同生物体中源于物种形成的同源\n基因有关。\n[0169] 例如，可以通过进行所谓的交互blast搜索容易地找到单子叶植物物种中的直系\n同源物。以寻找I类HDZip hox5核酸或I类HDZip hox5多肽的直系同源物和旁系同源物\n为例，这可以通过一次BLAST而实现，包括使用所讨论的序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID \nNO：2)针对任何序列数据库如可公共获得的见于http://www.ncbi.nlm.nih.gov的NCBI\n数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，可使用BLASTN或TBLASTX，利用标准缺省值，\n而当从蛋白质序列开始时，可使用BLASTP或TBLASTN，利用标准缺省值。BLAST结果可以任\n选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对所讨论的序列源自的\n生物体的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较一次BLAST和二次BLAST的结果。\n如果二次BLAST的结果将I类HDZip hox5核酸或I类HDZip hox5多肽作为最高相似性的\n命中事件，则找到了旁系同源物，如果其与一次BLAST中所用的序列来自相同生物的话。在\n其来自不同于一次BLAST中所用序列的生物，则找到了直系同源物。在大家族的情况下可\n以使用ClustalW，接着建立邻近连接树，来辅助聚类可视化。\n[0170] 也可以利用相同的方法寻找NRT编码核酸及NRT多肽的直系同源物和旁系同源\n物；寻找YEP16编码核酸及YEP16多肽的直系同源物和旁系同源物；以及寻找I型shaggy\n样激酶编码核酸及I型shaggy样激酶多肽的直系同源物和旁系同源物。\n[0171] 同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即在氨基酸序列中至少有一个残基被除\n去，并在其位置上插入不同的残基。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽\n的功能性限制而定也可以是成簇取代；插入通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。优\n选氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。保守取代表是本领域众容易获得的。下表给出了保\n守氨基酸取代的实例。\n[0172] 表4：保守氨基酸取代的实例\n[0173] \n 残基 保守取代 残基 保守取代\n Ala Ser Leu Ile；Val\n Arg Lys Lys Arg；Gln\n Asn Gln；His Met Leu；Ile\n Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr\n Gln Asn Ser Thr；Gly\n Cys Ser Thr Ser；Val\n Glu Asp Trp Tyr\n Gly Pro Tr Trp；Phe\n His Asn；Gln Val Ile；Leu\n Ile Leu；Val\n[0174] 同源物也可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即在蛋白质的预定位置引入一个或\n多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端的融合，以及单个或多个氨基酸的\n内部序列插入。通常，氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级为约1到\n10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活\n因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶\n标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、\n表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。\n[0175] 蛋白质“缺失变体”形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。\n[0176] 可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作\n容易地得到蛋白质的氨基酸变体。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列\n操作方法是本领域众所周知的。例如，本领域技术人员熟知在DNA预定位置产生取代突变\n的技术，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变\n(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。\n[0177] I类HDZip hox5多肽或其同源物；硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸；\nYEP16多肽编码核酸；以及I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸可以是衍生物。“衍生\n物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与天然产生形式蛋白质的氨基酸序列相比，其可以包\n括取代、缺失或添加的天然的和非天然产生的氨基酸残基。与天然产生形式多肽的氨基酸\n序列相比，衍生物可以包括天然存在的改变的、糖基化的、酰基化的、异戊烯化的或非天然\n产生的氨基酸残基。衍生物还可以包括相对于其源自的氨基酸序列的一个或多个非氨基酸\n取代，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与之结合有利\n于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然产生蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨\n基酸残基。\n[0178] I类HDZip hox5多肽或其同源物可以由选择性剪接变体编码；NRT多肽或其同源\n物可以由选择性剪接变体编码；YEP16多肽或其同源物可以由选择性剪接变体编码；且I型\nshaggy样激酶或其同源物可以由选择性剪接变体编码。\n[0179] 在用于本发明方法的序列是I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的情况下，\n剪接变体编码的多肽从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)\n具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。另外，I类HDZip hox5多肽或其同源物可以包含如下之\n一或两者兼而有之：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为\nPhe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或\n两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，(b)中的基序位于酸性盒之前。还\n优选表A所示核酸序列的剪接变体。最优选SEQID NO：1所示核酸序列的剪接变体。\n[0180] 在用于本发明方法的序列为NRT多肽或其同源物或其编码核酸的情况下，剪接变\n体编码的多肽包含MFS_1结构域和位于所述MFS_1结构域C-末端的跨膜结构域，且优选还\n包含上文定义的一个或多个SEQ ID NO：57至64的保守标签序列。还优选表I所示任一核\n酸的剪接变体。最优选SEQ ID NO：52的核酸的剪接变体。\n[0181] 在用于本发明方法的序列为YEP16编码核酸的情况下，剪接变体为SEQ ID NO：\n127或SEQ ID NO：129所示核酸序列的剪接变体。\n[0182] 在用于本发明方法的序列为I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的情况下，选\n择性剪接变体为SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ IDNO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID \nNO：154、SEQ ID NO：156、SEQ IDNO：158、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、\nSEQ IDNO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172、SEQ IDNO：174和SEQ ID \nNO：176中任一所示的核酸的剪接变体。还优选剪接变体编码的多肽具有：(i)与SEQ ID \nNO：147所示的氨基酸序列至少77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/V/N/Q E/G LK \nG/N和基序II：K Q/NCXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。\n[0183] 本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨酸\n拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达；或包括调节植物中\nNRT多肽或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达；或包括调节植物中YEP16多肽或\n其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达；或包括调节植物中I型糖原合酶激酶(I型\nshaggy样激酶)或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达。\n[0184] 本文所用的术语“选择性剪接变体”包括这样核酸序列变体，其中选择的内含子和\n/或外显子已被切除、替换或添加、或其中内含子已被缩短或加长。这样的变体将是保留蛋\n白质生物活性的变体，这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性片段来实现。这样的剪接\n变体可以是天然的或人工的。产生这类剪接变体的方法是本领域众所周知的。\n[0185] 同源物可以由I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体编码；或\n由硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的等位基因变体编码；或由YEP16多肽编码\n核酸的等位基因变体编码；或由I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的等位基因变体编\n码。\n[0186] 在用于本发明方法的序列是I类HDZip hox5多肽或其同源物编码核酸的情况下，\n等位基因变体编码的多肽从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和\n(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。另外，I类HDZip hox5多肽或其同源物可以包含\n如下之一或两者兼而有之：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，\n而F为Phe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的\n一个或两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，(b)中的基序位于酸性盒\n之前。还优选表A所示核酸序列的等位基因变体。最优选SEQ ID NO：1所示核酸序列的等\n位基因变体。\n[0187] 在用于本发明方法的序列为NRT多肽或其同源物或其编码核酸的情况下，等位基\n因变体编码的多肽包含MFS_1结构域和位于所述MFS_1结构域C-末端的跨膜结构域，且优\n选还包含上文定义的一个或多个SEQ IDNO：57至64的保守标签序列。还优选表I所示任\n一核酸的等位基因变体。最优选SEQ ID NO：52的核酸的等位基因变体。\n[0188] 在用于本发明方法的序列为YEP16编码核酸的情况下，等位基因变体为SEQ ID \nNO：127或SEQ ID NO：129所示核酸序列的等位基因变体。\n[0189] 在用于本发明方法的序列为I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的情况下，等\n位基因变体为SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID \nNO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、\nSEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：174和SEQ \nID NO：176中任一所示的核酸的等位基因变体。还优选等位基因变体编码的多肽具有：(i)\n与SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列至少77％的序列同一性；以及(ii)基序I：R/H/V/N/\nQ E/G LK G/N和基序II：K Q/NCXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。\n[0190] 本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨\n酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达；或包括调节植物\n中NRT多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达；或包括调节植物中YEP16多肽\n或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达；或包括调节植物中I型糖原合酶激酶(I型\nshaggy样激酶)或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达。\n[0191] 等位基因变体天然存在，并且包括在本发明方法中的有这些天然等位基因的用\n途。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL\n的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大\n的一类序列变体。\n[0192] 根据本发明，考虑调节核酸或其变体的表达。调节基因或基因产物表达的方法在\n本领域有详细的记载，并且包括例如用适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增\n强子的使用。可以将作用为启动子或增强子元件的分离的核酸引入至非异源形式多核苷酸\n的适当位置上(一般为上游)，从而上调核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失\n和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利5,565,350号；Zarling等，PCT/\nUS93/03868)，或者可以将分离的启动子与本发明的基因以适当的方向和距离引入植物细\n胞中，从而控制基因的表达。\n[0193] 降低基因或基因产物表达的方法在本领域有详细的记载。\n[0194] 如果期望多肽表达，通常要在多核苷酸编码区的3’端纳入多聚腺苷酸化区域。多\n聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其他植物基因或T-DNA。例如，加入的3’端序列可\n以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或源自任何其他真核\n基因。\n[0195] 也可以在5’非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，以增加在细\n胞溶质中累积的成熟信使的量。已表明纳入植物和动物表达构建体转录单位中的可剪接内\n含子均可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达提高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.\nCell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。通常这类内含子\n放置在转录单位5’端附近时，其提高基因表达的作用最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、\n2和6以及Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。通常见The MaizeHandbook，116章，\nFreeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。\n[0196] 本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法的核苷酸序列的引入和\n/或表达。\n[0197] 因此，提供的基因构建体含有：\n[0198] (i)I类HDZip hox5核酸或其变体；或NRT编码核酸或其变体；或YEP16编码核酸\n或其变体；或I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；\n[0199] (ii)一个或多个能够驱动(i)中核酸序列表达的控制序列；和任选的\n[0200] (iii)转录终止序列。\n[0201] 可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可\n以将基因构建体插入可商购的、适合于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因\n的载体中。本发明因此提供了如上文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。\n[0202] 用含有目的序列的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列\n(至少连接于启动子)。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文都可互换使用，\n从广义上是指能够影响与之相连的序列表达的调控核酸序列。上述术语包括源自典型真核\n生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的\n转录起始是必需的)，以及其他的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应\n答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生\n物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术\n语“调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核\n酸分子的表达。本文所用的术语“有效连接”指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，\n从而启动子序列能够起始目的基因的转录。\n[0203] 有利地，可以使用任何类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是组成型\n启动子，即应答发育、化学、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始。诱导型启动\n子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物接触多种胁迫条件时激活的启动子。另外或可选\n的，启动子可以是组织偏好型的启动子，即能够在某些组织，如在叶、根、种子等组织中优先\n起始转录的启动子。能够仅在某些组织中起始转录的启动子在本文称为“组织特异性”启\n动子。\n[0204] 优选I类HDZip hox5核酸或其变体；NRT编码核酸或其变体；YEP16编码核酸或\n其变体；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体有效连接于组成型启动子。组成型启动子在\n大多数但无需所有生长和发育阶段转录激活，并且是基本上普遍表达的。组成型启动子优\n选为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子如基本上类\n似于SEQID NO：33或SEQ ID NO：178的核酸序列所示，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：\n33或SEQ ID NO：178所示。应该明确本发明的应用并不局限于由GOS2启动子驱动的I类\nHDZip hox5核酸或其变体；NRT编码核酸或其变体；或I型shaggy样激酶编码核酸或其变\n体。其它也可用于实施本发明方法的组成型启动子的实例显示于下表5。\n[0205] 表5：组成型启动子的实例\n[0206] \n 基因来源 参考文献\n 肌动蛋白 McElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990\n CAMV 35S Odell等，Nature，313：810-812，1985\n CaMV 19S Nilsson等，Physiol.Plant.100：456-462，1997\n GOS2 de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，WO 2004/065596\n 泛素 Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992\n 稻亲环蛋白 Buchholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994\n 玉米H3组蛋白 Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992\n 苜蓿H3组蛋白 Wu等Plant Mol.Biol.11：641-649，1988\n 肌动蛋白2 An等，Plant J.10(1)；107-121，1996\n[0207] \n 34S FMV Sanger et al.，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443\n Rubisco小亚基 US 4,962,028\n OCS Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：2553\n SAD1 Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696\n SAD2 Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696\n Nos Shaw等(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846\n V-ATPase WO 01/14572\n 超级启动子 WO 95/14098\n G盒蛋白质 WO 94/12015\n[0208] 优选的编码YEP16多肽或其同源的核酸序列有效连接于种子特异性启动子。种子\n特异性启动子主要在种子组织中转录激活。种子特异性启动也可以在其他部分具有一定的\n残留活性。优选种子特异性启动为胚特异性和/或糊粉特异性启动子，即所述启动子主要\n在种子胚乳组织和/或糊粉层中转录激活，不过在别处可能具有一定的残留活性或渗漏表\n达。优选启动子为油质蛋白启动子，例如来自稻(SEQ ID NO：143)。应该明确本发明的应\n用并不局限于SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：129所示的YEP16编码核酸，且本发明的应用\n也不局限于由油质蛋白启动子驱动的YEP16编码核酸的表达。其它也可用于驱动YEP16多\n肽或其同源物编码核酸表达的种子特异性启动子的实例显示于下表6。\n[0209] 表6：种子特异性启动子的实例\n[0210] \n 基因来源 表达模式 参考文献\n 种子特异性基因 种子 Simon等，Plant Mol.Biol.5：191，1985；\n Scofield等，J.Biol.Chem.262：12202，1987；\n Baszczynski等，Plant Mol.Biol.14：633，1990.\n 巴西果白蛋白 种子 Pearson等，Plant Mol.Biol.18：235-245，1992.\n[0211] \n 豆球蛋白 种子 Ellis等，Plant Mol. Biol.10：203-214，1988.\n 谷蛋白(稻) 种子 Takaiwa等，Mol.Gen.Genet.208：15-22，1986；\n Takaiwa等，FEBS Letts.221：43-47，1987.\n 玉米醇溶蛋白 种子 Matzke等Plant Mol Biol，14(3)：323-32 1990\n napA 种子 Stalberg等，Planta 199：515-519，1996.\n 小麦LMW和HMW 胚乳 Mol Gen Genet 216：81-90，1989；\n 麦谷蛋白-1 NAR 17：461-2，1989\n 小麦SPA 种子 Albani等，Plant Cell，9：171-184，1997\n 小麦α、β、γ-小麦醇溶蛋白 胚乳 EMBO J.3：1409-15，1984\n 大麦Itr1启动子 胚乳\n 大麦B1、C、D 胚乳 Theor Appl Gen 98：1253-62，1999；Plant J\n 大麦醇溶蛋白 4：343-55，1993；Mol Gen Genet 250：750-60，1996\n 大麦DOF 胚乳 Mena等，The Plant Journal，116(1)：53-62，1998\n blz2 胚乳 EP99106056.7\n 合成启动子 胚乳 Vicente-Carbajosa等，Plant J.13：629-640，1998.\n 稻醇溶谷蛋白NRP33 胚乳 Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998\n 稻α-球蛋白Glb-1 胚乳 Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998\n 稻OSH1 胚 Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，\n 1996\n 稻α-球蛋白REB/OHP-1 胚乳 Nakase等Plant Mol. Biol.33：513-522，1997\n 稻ADP-葡萄糖PP 胚乳 Trans Res 6：157-68，1997\n 玉米ESR基因家族 胚乳 Plant J 12：235-46，1997\n 高粱γ-高梁醇溶蛋白 胚乳 PMB 32：1029-35，1996\n KNOX 胚 Postma-Haarsma等，Plant Mol. Biol.39：257-71，\n 1999\n 稻油质蛋白 胚和糊粉 Wu等，J.Biochem.，123：386，1998\n 向日葵油质蛋白 种子(胚和 Cummins等，Plant Mol.Biol.19：873-876，1992\n[0212] \n 干种子)\n 推定的稻40S核糖体蛋白 弱，胚乳\n 稻α-球蛋白 强，胚乳\n 稻丙氨酸转氨酶 弱，胚乳\n 胰蛋白酶抑制剂ITR1 弱，胚乳\n (大麦)\n 稻WSI18 胚+胁迫\n 稻RAB21 胚+胁迫\n 稻油质蛋白18kd 糊粉+胚\n[0213] 为了鉴定功能等同的启动子，可以通过例如将启动子有效连接于报告基因并在多\n种植物组织中测定报告基因的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子长度和/或表\n达模式。适宜的众所周知的报告基因包括例如β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。通过\n测量β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶促活性来测定启动子活性。然后可以将启动\n子长度和/或表达模式与参照启动子(例如本发明方法中所用的启动子)进行比较。可选\n地，可以通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S \nrRNA的mRNA水平相比较来测定启动子长度，利用本领域公知的方法，如Northern印迹联合\n放射自显影图像的光密度分析、实时定量PCR或RT-PCR (Heid等，1996Genome Methods 6：\n986-994)。“弱启动子”通常指以低水平驱动编码序列表达的启动子。“低水平”指每个细胞\n中约1/10,000的转录物到约1/100,000的转录物，到约1/500,0000的转录物。相反，“强\n启动子”以高水平驱动编码序列表达，或每个细胞中约1/10的转录物到约1/100的转录物\n到约1/1,000的转录物。\n[0214] 任选地，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止\n子”包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递初级转录物的3’加工和多聚腺\n苷酸化信号以及转录终止信号。另外的调控元件可以包括转录及翻译增强子。本领域技术\n人员将知道适用于实施本发明的终止子和增强子的序列。这类序列为本领域技术人员所公\n知或者可以容易地获得。\n[0215] 本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制\n起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细\n菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于fl-ori和colE1。\n[0216] 遗传构建体可任选地含有可选择标记基因。如本文所用，术语“可选择标记基因”\n包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和/或选择经本发明的\n核酸构建体转染或转化的细胞。\n[0217] 为检测本发明方法所用核酸序列的成功转移，和/或选择含有这些核酸的转基因\n植物，最好使用标记基因(或报告基因)。因此遗传构建体可任选地含有可选择标记基因。\n如本文所用，术语“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任\n何基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化\n的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同的原理鉴定核酸分子的成功转移。适当的标\n记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选\n择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，\n或磷酸化潮霉素的hpt、或者赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆\n大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)，赋予除草剂抗性的基因\n(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox、或者赋予对例如咪唑啉酮、膦\n丝菌素或磺胺脲的抗性的基因)，或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作\n为唯一碳源的manA，或木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性)。\n可视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡萄糖醛酸酶GUS或β-半乳糖苷酶及其着\n色底物，例如X-Gal)、发光(例如荧光素/荧光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其\n衍生物)。此清单仅仅代表一小部分可能的标记。技术人员对这类标记极为熟悉。优选根\n据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。\n[0218] 已知核酸稳定或瞬时整合进植物细胞，仅少数细胞摄入外来DNA，并整合进其基因\n组，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可\n选择标记(如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记可在突\n变体中使用，所述突变体中原有的这些基因没有功能，例如通过常规方法而缺失。此外，编\n码可选择标记的核酸分子与编码本发明或本发明方法所用多肽的序列可以在同一个载体\n中引入宿主细胞，或者在单独的载体中。由所引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选\n择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。\n[0219] 一旦成功引入核酸，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别\n是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸的方法有利地采用能够除去或切除\n这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时\n进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带一个或多个标记基因。较大比例\n的转化体接收或者对于植物而言含有(高达40％或以上的转化体)两个载体。对于农杆菌\n转化，转化体通常只接收载体的一部分，即为T-DNA所侧接的序列，其通常指表达盒。随后\n可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因\n与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予\n转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10％)，一旦成功进行\n了转化，转座子跳出宿主细胞基因组并丢失。在其他一些情况下，转座子跳至不同的位置。\n在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在微生物学领域，研发了有可能或便于检测此\n类事件的技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消\n除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之\n间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，由于该重组酶的表\n达，其得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.\nChem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。根据\n本发明的核酸序列有可能位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微\n生物如酵母、真菌或细菌。\n[0220] 在优选的实施方案中，提供的基因构建体含有：\n[0221] (i)I类HDZip hox5核酸或其变体；或NRT编码核酸或其变体；或I型shaggy样\n激酶编码核酸或其变体；\n[0222] (ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的组成型启动子；和任选的\n[0223] (iii)转录终止序列。\n[0224] 组成型启动子优选为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选\n组成型启动子如基本上类似于SEQ ID NO：33或SEQ IDNO：178的核酸序列所示，最优选组\n成型启动子如SEQ ID NO：33或SEQID NO：178所示。本发明还提供了如上文所定义的构建\n体在本发明方法中的用途。\n[0225] 在另一优选的实施方案中，提供的基因构建体含有：\n[0226] (i)YEP16编码核酸或其变体；\n[0227] (ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的种子特异性启动子；和任选的\n[0228] (iii)转录终止序列。\n[0229] 本发明还包括可由本发明方法获得的植物。本发明因此提供可由本发明方法获得\n的植物、植物部分(包括植物细胞)，所述植物或部分(包括细胞)I类HDZip hox5核酸或\n其变体转基因；或NRT编码核酸或其变体转基因；或YEP16编码核酸或其变体转基因；或I\n型shaggy样激酶编码核酸或其变体转基因。\n[0230] 本发明还提供相对于相应的野生型或其他对照植物生产具有改良的生长特性、特\n别是增加的产率的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达本文所述的用于本发明方\n法的任何核酸。\n[0231] 出于本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指，例如，核酸序列、含有所\n述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、根据本发明的表达盒或载体\n转化的生物体，通过重组方法产生的所有那些构建体，其中：\n[0232] a)编码用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或\n[0233] b)有效连接于根据本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或\n[0234] c)a)和b)\n[0235] 不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，有可能修饰采取的形式\n为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为原\n始植物中的天然基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况\n下，优选维持核酸序列的天然遗传环境，至少是部分地维持。至少在核酸序列一侧侧接的环\n境序列长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当\n天然存在的表达盒——例如核酸序列的启动子与编码如上文定义的用于本发明方法的蛋\n白质的相应核酸序列之间天然存在着的组合——经非天然的合成(“人工”)方法如诱变\n处理修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。例如，合适的方法描述在US 5,565,350或WO \n00/15815中。\n[0236] 更具体地，本发明提供生产具有改良的生长特性(特别是增加的产率)的转基因\n植物的方法，所述方法包括：\n[0237] (i)向植物、植物部分或植物细胞中引入和表达I类HDZip hox5核酸或其变体；\nNRT编码核酸或其变体；YEP16编码核酸或其变体；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；\n和\n[0238] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。\n[0239] 可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其\n它部分)。根据本发明的优选方面，优选通过转化将核酸引入植物。\n[0240] 本文所提及的术语“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用\n的方法。能够通过器官发生或者胚胎发生随即克隆增殖的植物组织都可以用本发明的遗传\n构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可提供和最适于转化的具体物种\n的克隆增殖系统而变。示例性的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、胚轴、雌配子、愈伤组织、\n既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子\n叶分生组织和胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，\n例如作为质粒保持非整合的状态。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物\n细胞可以接着以本领域技术人员公知的方式再生为转化的植物。\n[0241] 植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用多种转化方法的\n任一向适当的祖先细胞引入目的基因。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄\n取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化以及显微注射。方法\n可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等(1882)Nature 296，72-74；\nNegrutiu I.等(1987)Plant Mol.Biol.8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito \nR.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等(1986)\nMol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(KleinT.M.等(1987)Nature \n327：70)；(非整合的)病毒感染，等等。优选使用任何熟知的稻转化方法，通过农杆菌介导\n的转化，产生表达基因的转基因稻植物，例如在以下任一文献中描述的方法：公开的欧洲专\n利申请EP1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等(Plant \nMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开的内容\n如同充分阐述的那样并入本文作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.\nBiotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)中所\n述，其公开的内容如同充分阐述的那样并入本文作为参考。\n[0242] 通常在转化后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目\n的基因共转移的植物可表达基因编码，其后将转化的材料再生成完整植物。\n[0243] 在DNA转移和再生之后，可评估推定转化的植物，例如用Southern分析评价目的\n基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western\n分析(蛋白质印迹)或定量PCR监测新引入DNA的表达水平，所有技术都是本领域普通技\n术人员所熟知的。\n[0244] 产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例\n如，第一代(或T1)转化的植物可自交以得到纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可\n进一步通过经典育种技术繁殖。\n[0245] 产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的\n嵌合体；克隆的转化体(例如经过转化包含表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接\n体(例如在植物中，转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。\n[0246] 本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植\n物部分和其繁殖体。本发明还延及涵盖由任意上述方法产生的初级转化或转染的细胞、组\n织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法中亲本呈现相同的基因\n型和/或表型特性。\n[0247] 本发明也包括含有分离的I类HDZip hox5核酸或其变体的宿主细胞；含有分离的\nNRT编码核酸或其变体的宿主细胞；含有分离的YEP16编码核酸或其变体的宿主细胞；含有\n分离的I型shaggy样激酶编码核酸或其变体的宿主细胞。优选的宿主细胞是植物细胞。\n[0248] 本发明也延及植物可收获的部分，例如但不限于：种子、叶、果实、花、茎、根茎、块\n茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分直接衍生的产品，如干丸或干粉、油\n类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。\n[0249] 本发明还包括I类HDZip hox5核酸或其变体的用途以及I类HDZiphox5多肽或\n其同源物的用途；NRT编码核酸或其变体的用途以及NRT多肽或其同源物的用途；YEP16编\n码核酸或其变体的用途以及YEP16多肽或其同源物的用途；I型shaggy样激酶编码核酸或\n其变体的用途以及I型shaggy样激酶多肽或其同源物的用途。这样的用途涉及改良如上\n文所定义的任何植物生长特性。\n[0250] 可以在育种程序中使用I类HDZip hox5核酸或其变体、或者I类HDZip hox5多\n肽或其同源物；NRT编码核酸或其变体、或者NRT多肽或其同源物；YEP16编码核酸或其变\n体、或者YEP16多肽或其同源物；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体、或者I型shaggy样\n激酶多肽或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于前述基因或其变体之一的DNA标记。可\n以使用所述核酸或变体或者多肽或其同源物界定分子标记。然后可以在育种程序中使用此\nDNA或蛋白质标记，以选择具有改良的生长特性(如增加的产率)的植物。所述核酸或变体\n如上文所定义。\n[0251] I类HDZip hox5核酸/基因；NRT编码核酸/基因；YEP16编码核酸/基因；I型\nshaggy样激酶编码核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种\n程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变体；可选地，此程序可\n以以收集无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位\n基因变体。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体\n提供改良的生长特性，如增加的产率。一般通过监测含有所研究序列不同等位基因变体的\n植物的生长行为来进行选择，例如任何本文所述的用于本发明方法的核酸/基因的不同等\n位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括将经鉴定含有较好\n等位基因变体的植物与其他植物杂交。例如，可使用这种方法产生目的表型特征的组合。\n[0252] 前述核酸及变体还可以作为探针，用于对为那些基因的一部分并作为其连锁性状\n标记的基因进行遗传和物理作图。这样的信息可以在植物育种中使用，以得到具有期望表\n型的品系。所述核酸或变体的这类应用仅需要长至少15个核苷酸的核酸序列。所述核酸\n或变体可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用所述核酸或变体探测限制酶切\n消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)\n《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics \n1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用核酸探测含有\n一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述一组个体为代表明确的\n遗传杂交(genetic cross)的亲本和子代的一组个体。记录DNA多态性的分离，并用于计算\n在先前用此群体获得的遗传图谱中所示核酸或变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.\nGenet.32：314-331)。\n[0253] 在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和\nTanksley (1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方\n法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、\n随机交配群体、近亲同基因系及其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。\n[0254] 核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图谱上安置序列；见Hoheisel等，In \nNon-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academicpress 1996，319-346\n页，及其中引用的参考文献)。\n[0255] 在另一实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask \n(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向施用大的克隆(几个kb\n到几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图\n中应用较短的探针。\n[0256] 用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包\n括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态\n性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等\n(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：\n3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和\nCook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产\n生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知\n的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图\n的亲本之间的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。\n[0257] 根据本发明的方法得到如前所述具有改良的生长特性的植物。这些改良的生长特\n性还可以组合其它经济上有利的性状，如其他增产性状、对其他生物和非生物胁迫的耐受\n性、改良多种构造特征和/或生物化学和/或生理学特征的性状。\n附图说明\n[0258] 现参考以下附图描述本发明，其中：\n[0259] 图1显示了不同植物来源的I类HDZip同源域的多重比对，使用的是VNTI \nAlignX多重比对程序，基于改进的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.\ninformaxinc.com)，采用缺省设置，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.05。同源域不变\n氨基酸L16、W48、F49、N51和R53纵向加框表示。I类HDZip偏好氨基酸A46和W56同样纵向加框\n表示。DNA结合所必需的3个螺旋在比对上方以黑框标注。6个七肽以垂直线隔开。每个\n七肽内的7个位置命名为a、b、c、d、e、f和g位。Leu位于每个七肽的d位，且纵向加框表\n示。\n[0260] 图2显示了多个植物I类HDZip hox5多肽的多重比对，使用的是VNTI AlignX\n多重比对程序，基于改进的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.\ninformaxinc.com)，采用缺省设置，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.05。从N-末端\n到C-末端方向表征的3个主要结构域重度加框表示，并鉴定为酸性盒、I类同源域和6个\n七肽亮氨酸拉链。另外，Trp尾巴和RPFF氨基酸基序轻度加框表示。\n[0261] 图3显示了双元载体，用于在稻中表达处于GOS2启动子控制之下的稻I类HDZip \nhox5。\n[0262] 图4详述了用于实施本发明方法的I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5序列的实\n例。多个序列来自于公共EST拼接(见表A)，测序质量较低。因此预期可能存在少数核酸\n取代的情况。核酸序列以起始(ATG)和终止密码子界定。\n[0263] 图5显示了用于本发明方法的NRT蛋白的典型结构域结构，此处以SEQ ID NO：53\n作为示范。SEQ ID NO：53的蛋白质包含始于S69止于F432的以粗体显示的MFS_1结构域。\n此MFS_1结构域C末端存在推定的跨膜结构域(T441至P463，以下划线标出)。\n[0264] 图6显示了(a)系统发生树，其中SEQ ID NO：126表示稻NRT1蛋白序列，含PTR2\n结构域；和(b)实施例14表I所示序列的多重比对。多重比对中的星号表示氨基酸在所比\n对的序列中相同，分号表示保守取代，而点表示次保守取代。\n[0265] 图7显示了双元载体，用于在稻中表达处于GOS2启动子控制之下的稻NRT蛋白编\n码核酸。\n[0266] 图8详述了用于(除SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126之外)实施本发明方法的\nNRT序列的实例。SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126序列很可能不是全长序列。\n[0267] 图9显示了双元载体，用于在稻中表达处于油质蛋白启动子控制之下的拟南芥\nYEP16编码核酸。\n[0268] 图10显示了用于本发明方法的YEP16序列。\n[0269] 图11摘自Planta(2003)218：1-14(Wang等)，显示了植物对非生物胁迫的应答。\n初级胁迫如干旱、盐度、冷、热和化学污染通常互相联系，并引起细胞损害和次级胁迫，如渗\n透和氧化胁迫。初始的胁迫信号(如渗透和离子效应、或温度、膜流动性变化)触发下游信\n号传导过程和转录控制，从而激发胁迫应答机制以重建稳态，并保护和修复受损的蛋白质\n和膜。信号传导和基因激活过程中一个和多个步骤应答不足，可能会最终引起细胞稳态不\n可逆的变化，并引起功能和结构蛋白以及膜的破坏，导致细胞死亡。\n[0270] 图12摘自TRENDS in plant Science Vol.7，No.10，2002年10月(Claudia Jonak\n和Heribert Hirt)，显示了植物中可能的shaggy样激酶路径。AtGSK1为高盐应答的正调\n控因子。WIG(创伤诱导型GSK)牵涉到创伤信号传导。AtSK11和AtSK12参与正确的开花\n模式。遗传和生物化学分析表明了BIN2(油菜素甾醇非敏感型-1)介导的油菜素甾醇(BR)\n信号传导，这控制着BES1(BR11-EMS-阻遏物1)和BRZ1(brassinazole-抗性因子1)的核\n累积。\n[0271] 图13摘 自TRENDS in plant Science Vol.7，No.10，2002年10月 (Claudia \nJonak和Heribert Hirt)，显示了(a)10种拟南芥糖原合酶激酶3/SHAGGY样蛋白质激\n酶(GSK)的系统发生分析。拟南芥GSK可以归为4个亚型。(b)从多次BLAST搜索获\n得的不同植物物种的全长GSK cDNA的系统发生树。欧洲油菜BSK θ(Y12674)；紫花苜\n蓿MSK1(X68411)、MSK2(X68410)、MSK3(X68409)、MSK4(AF432225)、WIG(AJ295939)；烟草\nNSK6(Y08607)、NSK59(AJ002315)、NSK91(AJ224163)、NSK111(AJ002314)、NTK-1(X77763)；\n稻 OSKγ(AB59612)、OSKη(Y13437)； 矮 牵 牛 PSK4(X83619)、PSK6(AJ224164)、\nPSK7(AJ224165)、SPK6(X83620)。比对利用Clustal X通过邻近连接法以拟南芥\nMPK1(Q39021)作为外类群(out-group)进行；系统发生树以TreeView程序设计。\n[0272] 图14显示了植物I型shaggy样激酶的CLUSTAL多重比对。基序I和基序II加\n框表示。\n[0273] 图15显示了双元载体，用于在稻中表达处于GOS2启动子控制之下的稻I型\nshaggy样激酶。\n[0274] 图16详述了用于实施本发明方法的I型shaggy样激酶序列的实例。\n[0275] 实施例\n[0276] 现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明，而非旨在彻底地限\n定或以其他方式限制本发明的范围。\n[0277] 除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验\n室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，Current \nProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷的标准方法执\n行。植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology \nLabfax(1993)，BIOS ScientificPublications Ltd(UK) 和 Blackwell Scientific \nPublications(UK)出版。\n[0278] 实施例 I类HDZip hox5多肽及编码序列\n[0279] 实施例1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关序列的鉴定\n[0280] 利用数据库序列搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)\nJ.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在美\n国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定序列(全长cDNA、\nEST或基因组)。通常BLAST程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通\n过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，对核酸SEQ \nIDNO：1所编码的多肽运用TBLASTN算法，使用缺省设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序\n列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶\n然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百\n分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸\n(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整缺省参数以更改搜索的严格度。例如，可以增加\nE值以显示低严格度的匹配事件。通过这种方式可以鉴定短的几乎精确匹配的事件。\n[0281] 下表A提供了与SEQ ID NO：1的核酸序列相关的核酸序列列表。\n[0282] 表A：与SEQ ID NO：1的核酸序列相关的序列的实例\n[0283] \n 名称 NCBI核苷酸 核苷酸 翻译的多肽 来源\n 登录号 SEQ ID NO SEQ ID NO\n Orysa_hox5 XM 482406 1 2 稻\n Orysa_hox16 XM 467603 3 4 稻\n Zeama_hox5＊ CO458693 5 6 玉蜀黍\n DV024016\n Zeama_hox16 AY105265 7 8 玉蜀黍\n Sacof_hox5＊ CA088615 9 10 甘蔗\n CA115362 (Saccharum\n CA142506 officinarum)\n Sorbi_hox5＊ BE363386 11 12 两色蜀黍\n CD432381\n＊\n Triae_hox16 DR735359 13 14 小麦\n DR741379\n[0284] \nx as snec\nam m omro sebu\ngits ueni f ai p ai\n芥 卜 oret gatn 棉 蓿苜 geli geli 杨山 杨山 杨山\n南拟 萝胡 豆大 arC alp 地陆 茄蕃 茄蕃 花紫 uqA uqA 洲欧 洲欧 洲欧 \n \n61 81 02 22 42 62 82 03 23 14 34 54 \n \n51 71 91 12 32 52 72 92 13 04 24 44 \n \n9381\n9 94 .III\n8 8 1 9 4 1.3 1 9 7 34.V 6.II V_ff\n8461 128 575 7248 2634 4656 3168 1241 749 6029 5085 4285 X_ff X_ff acs|\n9DC 85X 62D 1FA 4FA 4TD 4DC 0TB 49X 8BC 8AC 7TD acs acs lcl \n \n1 ＊＊ ＊＊ 7 5- ＊ 1X ＊ 6 1_6 2_6 3_6\nBHTA 3BHC 51DH BHPC 5xoh 5xoh OHaV 1xoh 5xoh 1xoh 1xoh 1xoh\n_hta _acu _amy _lpa _ihs _sec _sec _asd _ofu _rtp _rtp _rtp\nrA aD lG rC oG yL yL eM qA oP oP oP\n) )\nsira suta\ngluv luci\n sul nroc\n蓿苜 oesa 根 sut\n藜蒺 豆菜 hP( 脉百 oL( \n \n74 94 15 \n \n64 84 05 \n \n2.7 5 4\n9145 0620 6360\n9RC 4FA 0PA \n \n16 6 6\n1xoh 1xoh 1xoh\n_rtd _uva _oct\neM hP oL\n[0285] ＊由多个EST登录号(显示了主要的EST)拼接的重叠群；EST测序质量通常较低，\n预期可能会有少数核酸取代。\n[0286] ＊＊来自胡萝卜和大豆的序列，与其登录号相比进行了订正。\n[0287] 实施例2：I类HDZip hox5多肽序列的比对\n[0288] 使用来自Vector NTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX，其基于流行的渐进式比\n对Clustal算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等(2003)\nNucleic Acids Res 31：3497-3500)。可利用邻近连接聚类算法构建系统发生树。缺省值\n为空位开放罚分10，空位延伸罚分0,1，且选择的权重矩阵为Blosum 62(如果比对多肽的\n话)。\n[0289] 所述多重序列比对的结果示于图2。从N-末端到C-末端方向表征的3个主要结\n构域重度加框表示，并鉴定为酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链。“保守结构域”包\n含这3个结构域。另外，Trp尾巴和RPFF氨基酸基序轻度加框表示。\n[0290] 实施例3：I类HDZip hox5多肽序列之间全局同一性百分比的计算\n[0291] 全长I类HDZip hox5多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用矩阵全\n局比对工具(MatGAT)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application \nthat generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences.\nCampanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)来确定。MatGAT\n软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序\n利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系\n列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排\n列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。\n[0292] 比较所用的参数有：\n[0293] 记分矩阵：Blosum 62\n[0294] 首个空位：12\n[0295] 延伸空位：2\n[0296] 多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分\n析结果示于表B1。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。\n[0297] 与SEQ ID NO：2比较，多肽序列之间的同一性百分比显示可低至29％。\n[0298] 表B1：多肽序列全长范围的全局相似性和同一性的MatGAT结果\n[0299] \n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22\n 1.Aqufo_Hox5 56 54 37 34 64 36 64 35 34 36 47 37 36 38 38 36 42 41 46 49 42\n 2.Arath_ATHB1 73 52 34 34 59 36 57 33 34 36 44 34 35 40 35 35 39 39 41 43 39\n 3.Crapl_CPHB-5 69 66 33 35 56 37 59 33 33 33 45 39 34 37 36 36 41 39 41 44 41\n 4.Dauca_CHB3 52 52 48 44 39 53 35 46 49 46 30 33 47 58 56 43 32 33 31 33 33\n 5.Glyma_HD157 50 47 48 58 33 44 32 43 43 72 33 31 84 48 48 47 32 31 31 31 32\n 6.Goshi_Hox5 79 74 71 53 49 38 64 36 36 37 46 38 35 39 36 35 40 39 46 49 40\n 7.Lotco_Hox16 51 53 51 66 62 53 35 45 66 50 29 31 49 62 59 49 30 31 30 32 31\n 8.Lyces_Hox5 75 70 72 51 45 75 50 34 34 36 46 38 34 37 36 33 41 41 45 47 41\n 9.Lyces_VaHOX1 49 48 47 63 58 48 62 47 45 44 31 32 47 53 49 44 33 33 32 33 33\n 10.Medtr_Hox16 48 48 50 65 64 49 78 48 63 46 30 30 45 59 55 42 31 30 31 31 30\n 11.Medtr_Hox16_1 52 49 50 61 81 49 67 49 61 64 33 28 77 51 48 50 32 31 29 29 32\n 12.Orysa_Hox16 62 59 58 50 50 60 47 58 45 50 51 49 34 32 31 30 46 45 73 76 45\n 13.Orysa_Hox5 53 47 52 48 48 52 48 50 44 45 46 59 32 32 32 30 66 66 49 50 65\n 14.Phavu_HOX16 51 51 48 64 89 49 65 47 63 65 88 49 48 56 55 51 34 32 31 32 33\n 15.Poptr_HOX16_1 54 54 52 71 66 52 75 50 66 73 69 48 49 71 92 48 35 35 32 34 34\n 16.Poptr_HOX16_2 51 49 51 70 66 50 73 49 65 70 66 47 46 71 96 47 34 33 32 32 34\n 17.Poptr_HOX16_3 52 51 47 59 59 52 63 45 59 59 62 44 44 65 63 63 34 33 30 31 33\n 18.Sacof_Hox5 62 58 57 47 44 60 48 57 44 45 46 56 69 46 48 47 47 95 46 46 94\n 19.Sorbi_Hox5 62 57 55 46 45 58 51 58 45 44 46 56 69 47 50 47 46 97 43 46 94\n 20.Triae_Hox16 62 54 56 48 48 59 47 58 47 49 47 82 61 48 52 51 46 56 55 72 45\n 21.Zeama_Hox16 63 58 59 51 49 62 51 60 49 50 47 81 62 51 49 48 46 56 57 81 45\n 22.Zeama_Hox5 62 58 56 46 44 59 49 57 45 45 45 55 68 46 50 46 48 96 96 57 56\n[0300] 如上文所定义的那样，I类HDZip hox5多肽序列的“保守结构域”从N-末端到\nC-末端包含酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链(见图2)。当对保守结构域而不是\n全长多肽序列进行同一性百分比分析时，观察到同一性百分比升高，如表B2所示。与SEQ \nID NO：2比较，现在最低值高于50％氨基酸同一性。\n[0301] 表B2：多肽序列“保守结构域”的全局相似性和同一性MatGAT结果\n[0302] \n02 76 76 56 85 76 35 07 85 75 28 49 06 95 75 \n91 67 17 86 75 57 45 67 75 95 69 48 85 16 85 \n81 37 17 66 75 37 45 57 75 85 49 18 75 85 65 \n71 76 66 46 95 66 25 96 85 75 28 39 06 06 75 \n61 86 76 56 85 76 35 17 85 75 28 29 06 95 75 \n51 06 95 56 66 46 46 06 06 26 85 75 56 56 26 \n41 36 26 85 57 36 37 26 86 17 85 75 17 39 \n31 76 56 26 08 86 77 66 37 57 06 85 17 89 \n21 16 36 26 46 36 26 36 26 16 85 95 68 58 \n11 66 66 36 75 66 25 86 75 75 48 57 08 57 \n01 57 17 96 75 47 45 57 65 95 19 67 97 57 \n9 16 16 06 96 36 58 16 17 57 47 08 78 48 \n8 26 16 75 66 36 76 75 48 47 17 57 48 28 \n7 28 58 77 26 38 26 47 57 29 88 67 97 67 \n6 26 16 26 07 66 77 48 39 97 77 18 09 78 \n5 28 28 87 46 08 29 67 77 29 88 97 28 97 \n4 66 95 16 18 18 97 97 18 77 87 08 88 58 \n3 47 47 57 98 47 88 17 47 58 38 57 57 47 \n2 18 58 97 59 87 29 57 57 29 78 97 08 77 \n1 39 58 18 49 08 19 77 77 39 09 97 18 97 \nDC_5xoh_ofuqA.1 DC_1BHTA_htarA.2 DC_5-BHPC_lparC.3 DC_3BHC_acuaD.4 DC_5xoh_ihsoG.5 DC_61xoh_octoL.6 DC_5xoh_secyL.7 DC_1XOHaV_secyL.8 DC6_1xoh_rtdeM.9 DC_61xoh_asyrO.01 DC_5xoh_asyrO.11 DC_61xoh_uvahP.21 DC_1_61xoh_rtpoP.31 DC_2_61xoh_rtpoP.41 \n85 89 89 97 28 \n85 28 28 59 19 \n65 97 87 89 98 \n75 89 98 19 001 \n75 99 88 09 99 \n27 27 37 47 27 \n77 57 67 77 67 57 \n77 97 97 08 08 97 \n87 47 47 77 97 47 \n17 69 79 19 29 79 \n37 88 98 89 89 98 \n77 37 37 57 77 37 \n67 17 17 47 57 17 \n17 68 78 29 29 78 \n67 77 77 08 18 77 \n57 78 78 29 29 78 \n08 77 77 97 87 77 \n37 08 18 58 68 18 \n57 68 68 29 29 68 \n47 98 98 39 39 98 \nDC361xoh_rtpoP.51 DC_5xoh_focaS.61 DC_5xoh_ibroS.71 DC_61xoh_eairT.81 DC_61xoh_amaeZ.91 DC_5xoh_amaeZ.02 \n[0303] 实施例4：I类HDZip hox5多肽序列包含的结构域的鉴定\n[0304] 蛋 白 质 家 族、结 构 域 和 位 点 整 合 资 源 (Integrated Resource of \nProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜\n索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利用不同\n的方法学和关于充分表征蛋白质的多样化角度生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库\n包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro\n由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。\n[0305] SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C。\n[0306] 表C：SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果\n[0307] \nR\nSSER\nPERH\nTH \n物\n遏\n阻\n样\nλ\n，\n序\n基\n旋\n螺\n-\n角\n转- 130\n旋螺 00RP\n \n7400 S\n00RP TNIR\nI P \norP\nretn\nI \n[0308] \nxo XO xo 1_XO 2_XO\nboem BOEM boem X BOEM BOEM\noH OH oH OH OH OH \n)x\noboe\nmoh(盒 0100 420 640 983 720 170\n源同 00DP 00RP 00FP 00MS 00SP 05SP\n \n6531 M S EL EL\n00RP ODOR TNIR MAF TRAM IFOR IFOR\nI P P P S P P \norP\nretn\nI \n[0309] \nZL\nAH \n的\n关\n相\n盒\n源\n同，\n链\n拉酸 381\n氨亮 20FP\n \n601\n300R MA\nPI FP \norP\nretn\nI \n[0310] \n样\n域\n源\n同 \n样域 9866\n源同 4FSS\n \nY\n750 LIMA\n900R FREP\nPI US \norP\nretn\nI \n[0311] \n的\n关\n相\n域\n源\n同 \n0\n6.01\n的关 .01.\n相 1：\n域 A\n源同 SD3G\n \n782\n210R D3EN\nPI EG \norP\nretn\nI \n[0312] 用以确定多肽结构域是否富含特定氨基酸(例如酸性盒)的一级氨基酸组成\n(以％计)可以利用来自ExPASy服务器的软件程序，特别是ProtParam工具(Gasteiger \nE 等 (2003)ExPASy：the proteomics server for in-depthprotein knowledge and \nanalysis.Nucleic Acids Res 31：3784-3788)进行计算。然后可以将目的多肽序列的组\n成与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均氨基酸组成(以％计)进行比较。\n[0313] 下表(表D)对SEQ ID NO：2的酸性盒中的％Asp(D)、％Glu(E)及其组合含量\n与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均值进行了比较。\n[0314] 表D\n[0315] \n ％Asp(D) ％Glu(E) ％Asp(D)+％Glu(E)\n Swiss-Prot蛋白质序列 5.3％ 6.6％ 11.9％\n 数据库中的平均值\n SEQ ID NO：2的酸性盒 9.1％ 54.5％ 63.6％\n[0316] 酸性盒可以是转录激活结构域中的一部分。已根据真核转录激活结构域的氨基\n酸含量对其进行了分类，且主要的类别包括酸性、谷氨酰胺富含和脯氨酸富含激活结构域\n(Rutherford等(2005)Plant J.43(5)：769-88，及其中的参考文献)。\n[0317] 基因本体论(GO)联合会是多种生物学数据库科学家之间的国际性合作，其编辑\n部建在欧洲生物信息学研究所。GO的目标在于为描述基因产物的分子功能、生物过程和细\n胞组分提供可控的词汇表。当进行上文所述的InterPro扫描时，我们也对GO数据库进行\n了搜索。I类HDZip hox5多肽序列具有的分子功能为转录因子活性和序列特异性DNA结合\n活性，并位于植物细胞的细胞核中(见下表(表E))。\n[0318] 表E\n[0319] \n 基因本体论记录\n 分子功能：转录因子活性(GO：0003700)\n 同源域\n 细胞组分：细胞核(GO：0005634)\n 分子功能：序列特异性DNA结合(GO：0043565)\n 亮氨酸拉链， 分子功能：DNA结合(GO：0003677)\n 同源盒相关的 细胞组分：细胞核(GO：0005634)\n[0320] 实施例5：I类HDZip hox5多肽序列的拓扑预测\n[0321] 利用专业软件如2ZIP进行亮氨酸拉链预测和七肽鉴定，该软件将标准卷曲螺旋\n预测算法和特征性亮氨酸重复单位的模拟搜索结合在一起(Bornberg-Bauer等(1998)\nComputational Approaches to Identify LeucineZippers，Nucleic Acids Res.，26(11)：\n2740-2746，由位于德国Golm的马克斯普朗克研究所(Max Planck Institut)托管)。利用\n此软件可以鉴定潜在的亮氨酸拉链、亮氨酸重复单位和卷曲螺旋。\n[0322] I类HDZip hox5多肽序列含亮氨酸拉链预测，具有至少5个、优选6个七肽。当对\nSEQ ID NO：2的多肽运行此算法时，发现潜在的亮氨酸来联位于第143-178位，如下文输出\n所示(数字表示氨基酸位置，C表示卷曲螺旋区域，而L表示七肽内部的亮氨酸)：\n[0323] 1---------11---------21---------31---------41---------51-----\n[0324] MDPGRVVFDSGVARRACPGGAQMLLFGGGGSANSGGFFRGVPAAVLGMDESRSSSSAAGA\n[0325] 61--------71--------81--------91--------101--------111-------\n[0326] GAKRPFFTTHEELLEEEYYDEQAPEKKRRLTAEQVQMLERSFEEENKLEPERKTELARRL\n[0327] 121-------131--------141--------151---------161-------171-----\n[0328] GMAPRQVAVWFQNRRARWKTKQLEHDFDRLKAAYDALAADHHALLSDNDRLRAQVISLTE\n[0329] CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC\n[0330] L------L------L------L------L------L\n[0331] LZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZ\n[0332] 181-------191-------201-------211-------221-------231-------\n[0333] KLQDKETSPSSATITTAAQEVDQPDEHTEAASTTGFATVDGALAAPPPGHQQPPHKDDLV\n[0334] CCCCCCCC\n[0335] 241-------251-------261-------271-------281-------291-------\n[0336] SSGGTNDDGDGGAAVVVFDVTEGANDRLSCESAYFADAAEAYERDCAGHYALSSEEEDGG\n[0337] 301-------311-------321-------331-------341-------\n[0338] AVSDEGCSFDLPDAAAAAAAMFGAAGVVHHDAADDEEAQLGSWTAWFWS\n[0339] 实施例6：I类HDZip hox5多肽序列的测定\n[0340] I类HDZip hox5多肽或其同源物具有DNA结合活性，优选结合在中心位置处重叠\n的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母单杂交试验中检测到的那样(Meijer等(2000)\nMol Gen Genet 263：12-21)。在稻细胞悬浮液的瞬时测定中，与GUS报告基因共同轰击I类\nHDZip hox5多肽据报道导致染色斑点数目增加，这些斑点颜色也更深(Meijer等，同前)。\n此测定可用于证明I类HDZip hox5多肽或其同源物的激活因子功能。\n[0341] 实施例7：稻I类HDZip hox5核酸序列的克隆\n[0342] 使用稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增稻I类\nHDZip hox5核酸序列。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMV Sport 6.0中。\n7 10\n该库平均插入物大小为1.6kb，并且原始克隆数的数量级为1.67×10cfu。在6×10 cfu/\n6\nml的第一次扩增之后，确定原始滴度为3.34×10cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板\n用于50μlPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm06000(SEQ ID NO：34；有义，起始密\n码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’-\nCTTAAACA GATCCCGGCCG 3’)和prm06001(SEQ ID NO：35；反向互补，AttB2位点为斜\n体：5’ GATCAGCTCCAGAACCAGG 3’)，\n它们包括进行Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用HifiTaq DNA聚合酶进行\nPCR。同样用标准方法扩增和纯化1116bp的PCR片段(包括attB位点；从开始到终止为\n1050bp)。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201\n质粒在体内重组以产生(根据Gateway术语)“进入克隆”。作为 技术一部分\n的质粒pDONR201购自英骏公司。\n[0343] 实施例8：载体构建\n[0344] 随后使用含所述核酸序列的进入克隆和用于稻转化的指定载体一起进行LR反\n应。此载体在T-DNA边界内包含这样的功能元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达\n盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成\n型表达的稻GOS2启动子(SEQID NO：33或SEQ ID NO：178)位于此Gateway盒的上游。\n[0345] LR重组步骤之后，按照本领域众所周知的方法将所产生的表达载体(图3)转化进\n入农杆菌菌株LBA4044。\n[0346] 实施例9：植物转化\n[0347] 稻转化\n[0348] 用含表达载体的农杆菌转化稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通\n过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6次，每次15\n分钟进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D(愈伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。\n在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。\n两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之\n前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(为了促进细胞分裂活性)。\n[0349] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合\n适的抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基\n中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液15分\n钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25℃孵育3天。在\n选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28℃暗培养四周。在此期\n间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛(resistant callus islands)。将该物质转移至再\n生培养基之后在光照下孵育，显示出胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽\n从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变\n硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。\n[0350] 由一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。将初级转化体从组织培养室转移\n到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的\n单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单基因\n座转化体的比率超过50％(Aldemita和Hodges 1996；Chan等，1993；Hiei等，1994)。\n[0351] 实施例10：表型评估方法\n[0352] 10.1评估设置\n[0353] 产生了大约35个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长\n并收获T1种子。7个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过\n监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1\n幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子\n在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿\n度70％。\n[0354] 按照T1代相同的评估方法对所有T1事件的T2代进行进一步的评估。从播种期\n到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度\n获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。\n[0355] 盐胁迫筛选\n[0356] 在由椰子纤维和argex(3比1的比例)制成的基质上培养来自4个事件(T2种\n子)的植物。在将幼苗移植至温室后的前两周使用正常的营养液。前两周过后，向营养液\n中添加25mM的盐(NaCl)，直到收获植物为止。\n[0357] 干旱筛选\n[0358] 在正常条件下在花盆土中培养来自5个事件(T2种子)的植物，直到进入抽穗期。\n然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土\n壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。\n然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生\n物胁迫条件下培养的植物相同。用在正常条件下培养的植物收获的T2种子重复筛选进行\n一轮验证，而不用从首次干旱筛选的植物收获的T2种子。\n[0359] 降低的营养(氮)利用度筛选\n[0360] 在除营养液以外正常的条件下在花盆土中培养稻植物。从植物移植到成熟一直用\n特定的营养液对花盆浇水，所述营养液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培\n(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。然后测量种子相关参\n数。\n[0361] 10.2统计分析：F检验\n[0362] 利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对\n用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F检验。进行F检验以检查\n基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基\n因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，\n这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。\n[0363] 10.3测量的参数\n[0364] 10.3.1生物量相关参数的测量\n[0365] 从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至\n少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。\n[0366] 植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分数码图像\n的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转\n换为以平方毫米表示的物理表面值(physicalsurface value)。实验表明通过这种方法测\n量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。地上面积在植物达到其最大叶生物量的\n时间点取值。早期活力表现为萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。\n[0367] 必要时还利用另一参数测量非生物胁迫耐受性：干旱后的绿度指数，其提供植物\n衰老的指标。绿度指数为干旱后首次成像时黄色象素的比例(表达为％)。\n[0368] 为测量根相关参数，在特别设计的具有透明盆底的花盆中培养植物以便能够对根\n进行观察。在植物生长期间用数码相机透过盆底拍摄照片。利用适当的软件由照片推断根\n的特征，如总投影面积(这与根总体积有关)、平均直径以及超过一定粗度阈值的根的长度\n(一个或多个粗根的长度)。根生物量的增加表达为根总生物量(测量为植物生命周期中\n观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/冠比(root/shoot index)(测量为根和\n芽活跃生长期时根质量与芽质量的比率)的增加。\n[0369] 10.3.2种子相关参数的测量\n[0370] 收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干\n燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳\n分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离\n步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳\n来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每株植物的种子总数。从计数\n的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总\n2 6\n产率和地上面积(mm)之间的比值，再乘以因子10。每个圆锥花序的花总数在本发明中定\n义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子\n数占种子总数的比例(以％表示)。\n[0371] 实施例11：在正常生长条件下表达I类HDZip hox5核酸的转基因稻植物的结果\n[0372] 在正常生长条件下表达I类HDZip hox5核酸的转基因稻植物的评估结果示于表\nF。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比，其中F检验的P值低于0.05。\n[0373] 表F：在正常生长条件下\n[0374] 表达I类HDZip hox5核酸的转基因稻植物的评估结果\n[0375] \n 性状 T1代差异百分比 T2代差异百分比\n 平均根直径 2 1\n 粗根长度 9 17\n 种子总产率 17 19\n 饱满种子数 15 17\n 饱满率 7 9\n 种子总数 6 9\n 每个圆锥花序的花数 8 9\n TKW 2 2\n 收获指数 16 16\n 开花前的绿度指数 2 4\n[0376] 实施例l2：在盐胁迫生长条件下表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因\n稻植物的结果\n[0377] 在盐胁迫生长条件下表达I类HDZip hox5多肽序列编码核酸的转基因稻植物的\n评估结果示于表G。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比，其中F检验的P\n值低于0.05。\n[0378] 表G：在盐胁迫生长条件下\n[0379] 表达I类HDZip hox5核酸的转基因稻植物的评估结果\n[0380] \n 性状 T1代差异百分比\n 种子总产率 41\n 饱满种子数 40\n 饱满率 30\n TKW 1\n 收获指数 36\n 开花前的绿度指数 7\n[0381] 实施例13：在干旱胁迫生长条件下表达I类HDZip hox5核酸的转基因稻植物的\n结果\n[0382] 在干旱胁迫生长条件下表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的\n评估结果示于表H。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比，其中F检验的P\n值低于0.05。\n[0383] 表H：在干旱胁迫生长条件下\n[0384] 表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的评估结果\n[0385] \n 性状 T1代差异百分比 T2代差异百分比\n 平均根直径 2 1\n 粗根长度 9 14\n 种子总产率 18 31\n 饱满种子数 21 33\n 饱满率 15 33\n 收获指数 18 34\n 干旱后的绿度指数 2 3\n[0386] 实施例NRT多肽及编码核酸\n[0387] 实施例14：SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53相关序列的鉴定\n[0388] 利用数据库序列搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)\nJ.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在\n美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定与SEQ ID NO：\n52相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)和/或与SEQ ID NO：53相关的蛋白质序列。通\n常BLAST程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学\n显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，对核酸SEQ ID NO：52所编码的\n多肽运用TBLASTN算法，使用缺省设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序列。分析的输出视\n窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值\n越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性\n百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。\n在有些情况下，可以调整缺省参数以更改搜索的严格度。\n[0389] 除了可由NCBI获得的公共核酸序列之外，我们还按照上文所述的相同方法对私\n有序列数据库进行了搜索。\n[0390] 下表I提供了与SEQ ID NO：52所示的核酸序列以及SEQ ID NO：53所示的蛋白质\n序列相关的核酸和蛋白质序列列表。\n[0391] 表I：与用于实施本发明方法的\n[0392] 核酸序列(SEQ ID NO：52)相关的核酸序列以及相应的推断多肽\n[0393] \n 蛋白质 核酸\n 物种 GenBank登录号\n SEQ ID NO： SEQ ID NO：\n 稻 BAA33382 53 52\n 芦苇 BAC76606 66 65\n 玉蜀黍 AAT66252 68 67\n 玉蜀黍 AAN05088 70 69\n[0394] \n 大麦 AAC49531 72 71\n 小麦 AAK19519 74 73\n 大麦 AAC49532 76 75\n 小麦 AAG01172 78 77\n 小麦 AAL11016 80 79\n 大麦 AAD28364 82 81\n 大麦 AAD28363 84 83\n 桃 BAD02939 86 85\n 桃 BAD04063 88 87\n 大豆 AAC09320 90 89\n Lotus japonicus Q9ARC5 92 91\n 烟草 CAD89799 94 93\n 番茄 AAK72402 96 95\n 杨属物种 CAG26716 98 97\n 烟草 CAD89798 100 99\n 野生烟草\n CAA69387 102 101\n (Nicotiana plumbaginifolia)\n 番茄 AAF00053 104 103\n 拟南芥 AAC64170 106 105\n 番茄 AAF00054 108 107\n 欧洲油菜 CAC05338 110 109\n 拟南芥 AAY78876 112 111\n 拟南芥 NP_172289 114 113\n 拟南芥 AAC35884 116 115\n 拟南芥 NP_200886 118 117\n 拟南芥 AAU05505 120 119\n 胡萝卜 AAL99362 122 121\n[0395] \n 玉蜀黍 CAC87729 124 123\n[0396] 实施例15：相关多肽序列的比对\n[0397] 使用来自Vector NTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX，其基于流行的渐进式比\n对Clustal算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等(2003)\nNucleic Acids Res 31：3497-3500)。可利用邻近连接聚类算法构建系统发生树。缺省值\n为空位开放罚分10，空位延伸罚分0,1，且选择的权重矩阵为Blosum 62(如果比对多肽的\n话)。\n[0398] 鉴定用于实施本发明方法的多肽的相关多肽的多重序列比对的结果示于图6。多\n重比对显示了多种物种之间的NRT蛋白序列高度保守。含PTR2结构域的蛋白质(以SEQ \nID NO：126为例)显然并不属于本文所定义的NRT蛋白质类型。\n[0399] 实施例16：NRT多肽序列之间全局同一性百分比的计算\n[0400] 用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利\n用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an \napplication that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA \nsequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)来\n确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性\n矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为\n2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然\n后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半\n部。\n[0401] 比较所用的参数有：\n[0402] 记分矩阵：Blosum 62\n[0403] 首个空位：12\n[0404] 延伸空位：2\n[0405] 多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分\n析结果示于表I。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。\n[0406] 与SEQ ID NO：53比较，用于实施本发明方法的多肽序列之间的同一性百分比显示\n通常超过60％氨基酸同一性(不过可能存在例外情况)；而含PTR2结构域的蛋白质(如\nSEQ ID NO：126所示的稻硝酸盐转运蛋白，下表第31行)与NRT蛋白仅表现出极其有限的\n序列同一性(17％或更低)。\n[0407] \n[0408] 实施例17：用于实施本发明方法的多肽序列所包含的结构域的鉴定\n[0409] 蛋白质家族、结构域和位点整合资源(InterPro)数据库是进行基于文本以及序\n列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利\n用不同的方法学和关于充分表征蛋白质的多样化角度生物信息，以获得蛋白质标签。合作\n数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。\nInterpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所托管。\n[0410] SEQ ID NO：53所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表K。\n[0411] 表K：SEQ ID NO：53所示多肽序列的InterPro扫描结果\n[0412] \n 数据库 登录号 登录名\n Pfam PF07690 MFS_1\n[0413] 实施例18：NRT多肽序列的拓扑预测(亚细胞定位、跨膜...)\n[0414] 利用TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。定位比对基于任一N-末端前\n序列预测的存在进行：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌通路信号肽(SP)。\n以之为基础进行预测的分值并非真正的概率，且加起来并不必然为1。不过，得分最高的定\n位最可能符合TargetP，且分值(可靠性级别)之间的关系可作为所述预测多么可靠的指\n标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学生\n物序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis，Technical University \nofDenmar)的服务器维护。\n[0415] 对于经预测含有N-末端前序列的序列，还可以预测潜在的切割位点。\n[0416] 选择了多种参数，例如生物体类型(非植物或植物)、截断值设置(无、预先规定的\n截断值设置或者用户指定的截断值设置)以及切割位点的预测计算(是或否)。\n[0417] SEQ ID NO：53所示多肽序列的TargetP 1.1分析结果示于表L。选择的是“植物”\n生物体类型，未规定截断值，并要求转运肽的预测长度。未能预测到亚细胞定位。\n[0418] 表L：SEQ ID NO：53所示多肽序列的TargetP 1.1分析\n[0419] \n 长度(AA) 533\n 叶绿体转运肽 0.116\n 线粒体转运肽 0.060\n 分泌通路信号肽 0.008\n 其他亚细胞靶向 0.874\n 预测的定位 -\n 可靠性级别 2\n 预测的转运肽长度 -\n[0420] 可以利用许多其他的算法进行这样的分析，包括：\n[0421] ●ChloroP 1.1，由丹麦技术大学服务器托管；\n[0422] ● 蛋 白 质 寻 觅 亚 细 胞 定 位 预 测 软 件 (Protein Prowler \nSubcellularLocalisation Predictor)，1.2版，由澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生\n物科学研究所(Institute for Molecular Bioscience，University of Queensland，\nBrisbane，Australia)的服务器托管；\n[0423] ●PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5，由加拿大大阿尔贝塔埃德蒙顿阿尔\n贝塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器托管；\n[0424] 利用TMHMM程序(丹麦技术大学生物序列分析中心)预测的跨膜螺旋数为11，见\n下文表M。\n[0425] 表M：\n[0426] \n 定位 参与的氨基酸区域\n 外侧 1 67\n 跨膜螺旋 68 90\n 内侧 91 129\n 跨膜螺旋 130 152\n 外侧 153 155\n 跨膜螺旋 56 178\n 内侧 179 184\n 跨膜螺旋 185 207\n 外侧 208 221\n 跨膜螺旋 222 244\n 内侧 245 272\n 跨膜螺旋 273 295\n 外侧 296 314\n 跨膜螺旋 315 332\n 内侧 333 352\n 跨膜螺旋 353 375\n 外侧 376 379\n 跨膜螺旋 380 402\n 内侧 403 408\n 跨膜螺旋 409 431\n 外侧 432 440\n 跨膜螺旋 441 463\n 内侧 464 533\n[0427] 跨膜螺旋中预期的氨基酸数预测至少为242个(如果大于18，则蛋白质极有可能\n为跨膜蛋白质)。此外，不太可能存在分泌信号，因为在头60个氨基酸内没有预测的跨膜螺\n旋，也没有N-末端信号序列(预期数，头60个氨基酸：0.00085)。\n[0428] 实施例19：NRT的测定\n[0429] 为确定NRT的转运蛋白活性，采用Tong等(Plant J.41，442-450，2005)所述的硝\n酸盐吸收测定。简言之，由构建体制备mRNA，在所述构建体中，目的NRT蛋白编码ORF之前\n为爪蟾β-球蛋白基因的5’-UTR，之后为所述爪蟾β-球蛋白基因的3’-UTR。将此mRNA\n15 -\n注射到卵母细胞V期和VI期中，之后表达目的NRT蛋白。在 NO3 溶液中于18℃孵育卵母\n15 14\n细胞3到12小时。然后洗涤卵母细胞并于60℃干燥。用质谱仪通过测量 N/ N之比来\n15\n测量 N富集硝酸盐的吸收。测量NO3吸收的其他适宜的测定法为本领域技术人员所熟知，\n15 -\n例如参见Filleur等( NO3uptake in roots，FEBSLetters 489，220-224，2001)或Zhou\n等(measurement of anion-elicitedcurrents with the two-electrode voltage-clamp \nmethod，J.Biol.Chem.275，39894-39899，2000)。如果需要，可以共表达nar2基因，以增加\n硝酸盐转运。\n[0430] 可选地，NRT蛋白或其同源物的活性可以通过在稻栽培种日本晴中表达处于GOS2\n启动子控制之下的NRT蛋白或其同源物来进行测定，这将产生与相应的野生型植物相比具\n有增加的地上生物量和/或增加的种子产率的植物。这种种子产率的增加可以通过多种方\n式衡量，例如种子总重量、饱满种子数量或种子总数的增加，收获指数的增加或每个圆锥花\n序花朵的增加。\n[0431] 实施例20：SEQ ID NO：52所示核酸序列的克隆\n[0432] 使用稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增稻NRT\n基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMVSport 6.0中。该库平均插入物\n7 11\n大小为1.5kb，并且原始克隆数的数量级为1.59×10cfu。在6×10 cfu/ml的第一次扩增\n5\n之后，确定原始滴度为9.6×10cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50μl PCR混合\n物中。PCR扩增所用引物为prm07061(SEQ ID NO：54；有义，起始密码子为粗体，AttB1位点\n为斜体：5’ gactcgtcgacggtg-3’)和\nprm07062(SEQ ID NO：55；反向互补，终止密码子为粗体，AttB2位点为斜体：AttB2 site in \nitalic：5’ ctcggtcgcagaattgt c-3’)，它们包括\n进行Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用Hifi TaqDNA聚合酶进行PCR。同样用\n标准方法扩增和纯化1683bp的PCR片段(包括attB位点)。接着进行Gateway操作的第\n一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生(根据Gateway\n术语)“进入克隆”。作为 技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。\n[0433] 实施例21：利用SEQ ID NO：52所示的核酸序列构建表达载体\n[0434] 随后使用进入克隆和用于稻转化的指定载体一起进行LR反应。此载体在T-DNA\n边界内包含这样的功能元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到\n进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启\n动子(SEQ ID NO：56第1-2188位核苷酸，启动子-基因组合)位于此Gateway盒的上游。\n[0435] LR重组步骤之后，将所产生的NRT表达载体(图7)转化进入农杆菌菌株LBA4044，\n随后转化进稻植物。\n[0436] 实施例22：植物转化\n[0437] 稻转化\n[0438] 用含表达载体的农杆菌转化稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通\n过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6次，每次15\n分钟进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D(愈伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。\n在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。\n两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之\n前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(为了促进细胞分裂活性)。\n[0439] 将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适\n的抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中\n至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。\n随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择\n剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28℃暗培养四周。在此期间，发\n育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，显示出\n胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培\n养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温\n室中培养。\n[0440] 由一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。将初级转化体从组织培养室转移\n到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的\n单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单基因\n座转化体的比率超过50％(Aldemita和Hodges 1996；Chan等，1993；Hiei等，1994)。\n[0441] 实施例23：表型评估方法\n[0442] 23.1评估设置\n[0443] 产生了大约35个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长\n并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过\n监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1\n幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子\n在随机位置上并排生长，环境设置如下：光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000勒克斯或\n更多、日间温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。\n[0444] 按照T1代相同的评估方法对4个T1事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事\n件使用更多的个体。从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每\n株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。\n[0445] 23.2统计分析：\n[0446] 利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对\n用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F检验。进行F检验以检查\n基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基\n因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，\n这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。\n[0447] 为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基\n因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”\n是与转基因植物以相同的方式处理、但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物\n描述为纯合的阴性转化植物。将t检验的显著性阈值设定为10％概率水平。一些事件的结\n果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这样的假设，即基因可以仅在基因组中的某些\n位置中具有效应，且这种位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文此类基因效应也称为“基\n因的品系效应(line effect of the gene)”。通过将t值与t分布比较得到p值，或者可\n选地通过将F值与F分布比较得到p值。p值则给出了无效假设(即不存在转基因效应)\n正确的概率。\n[0448] 由于进行的两种实验具有重叠事件，因此进行组合分析。这可用于检查两种实验\n中效应的一致性，并且如果情况果真如此，其可用于从两种实验中收集证据从而增加结论\n的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方\n法。通过比较卡方分布的似然比测试来获得p值。\n[0449] 23.3测量的参数\n[0450] 生物量相关参数的测量\n[0451] 从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至\n少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。\n[0452] 植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分数码图像\n的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转\n换为以平方毫米表示的物理表面值。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地\n上部分的生物量相关。地上面积在植物达到其最大叶生物量的时间点取值。早期活力表现\n为萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。\n[0453] 种子相关参数的测量\n[0454] 收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干\n燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳\n分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离\n步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳\n来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每株植物的种子总数。从计数\n的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总\n2 6\n产率和地上面积(mm)之间的比值，再乘以因子10。每个圆锥花序的花总数在本发明中定\n义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子\n数占种子总数(或小花)的比例(以％表示)。每个圆锥花序的花数是估算植物上每个圆\n锥花序的平均小花数的参数，由种子总数除以一次圆锥花序(first panicles)数获得。当\n垂直成列观察时，最高的圆锥花序以及与最高的圆锥花序重叠的圆锥花序被视为一次圆锥\n花序，并进行人工计数。\n[0455] 实施例24：转基因植物的表型评估结果\n[0456] 当如上所述对种子进行分析时，发明人发现用NRT基因构建体转化的植物比缺乏\nNRT转基因的植物具有更高的种子产率：表达为饱满种子数(这可能至少部分地是饱满率\n增加的结果)、种子总重量(增加25％)和收获指数。\n[0457] T1代植物中得到的结果总结在表N中。\n[0458] 表N：\n[0459] \n 差异百分比 p值\n 饱满种子数 +48 0.0000\n 种子总重量 +54 0.0000\n 收获指数 +38 0.0000\n 花/圆锥花序 +14 0.0003\n 种子总数 +13 0.0287\n[0460] 这些阳性结果在T2代中再次得到。表O的数据显示了由T2代独立品系的数据计\n算的饱满种子数、种子总重量和收获指数的总体增长百分比以及相应的p值。对这些T2数\n据在与T1代结果的组合分析中进行再次评估，并且得到的p值表明观察到的效应是非常显\n著的。\n[0461] 表O：\n[0462] \n[0463] 另外，转基因植物还表现出生物量的增加(面积最大(areamax)：T1代为+7％，而\nT2代为+4％)，这种增加是显著的(组合分析的p值：0.0001)。\n[0464] 实施例 YEP16多肽及编码核酸\n[0465] 实施例25：拟南芥YEP16编码核酸的基因克隆\n[0466] 使用稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增拟南\n芥YEP16编码基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMV Sport 6.0中。\n7 10\n该库平均插入物大小为1.6kb，并且原始克隆数的数量级为1.67×10cfu。在6×10 cfu/\n6\nml的第一次扩增之后，确定原始滴度为3.34×10cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板\n用于50μl PCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm00735(SEQ ID NO：144；有义，起始密\n码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’- a\ngatactctctcagcatcc-3’)和prm00736(SEQ ID NO：145；反向互补，AttB2位点为斜体：\n5’- tgtatcatcaagaaacccaga-3’)，它们包括进行\nGateway重组的AttB位点。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。同样用标\n准方法扩增和纯化12173bp的PCR片段(包括attB位点；从开始到终止为1050bp)。接着\n进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组\n以产生(根据Gateway术语)“进入克隆”。作为 技术一部分的质粒pDONR201\n购自英骏公司。\n[0467] 实施例26：载体构建\n[0468] 随后使用进入克隆和用于稻转化的指定载体p00640一起进行LR反应。此载体在\nT-DNA边界内包含这样的功能元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克\n隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于种子特异性表达的\n稻油质蛋白启动子(SEQID NO：143)位于此Gateway盒的上游。\n[0469] LR重组步骤之后，将所产生的表达载体(图9)转化进入农杆菌菌株LBA4044，随\n后转化进稻植物。使转化的稻植物生长，然后对实施例27中所述的参数进行研究。\n[0470] 实施例27：在正常生长条件下处于稻油质蛋白启动子控制之下的稻YEP16编码核\n酸的评估和结果\n[0471] 产生了大约15到20个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温\n室生长并收获T1种子。7个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3：1分离。\n通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的\nT1幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。按照T1代相同的评估方法对\n4个T1事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事件使用更多的个体。\n[0472] 27.1统计分析：F检验\n[0473] 利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对\n用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查\n基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基\n因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，\n这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。\n[0474] 种子相关参数的测量\n[0475] 收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干\n燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳\n分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离\n步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳\n来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每株植物的种子总数。从计数\n的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总\n2 6\n产率和地上面积(mm)之间的比值，再乘以因子10。每个圆锥花序的花总数在本发明中定\n义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。\n[0476] 用YEP16编码核酸转化的转基因植物的饱满种子数、种子总产率(种子总重量)、\n种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数再乘以100)以及收获指数示于表P。与相应的\n对照植物相比，这些参数在T1代中显著增加。在T2代中也观察到相同参数的平均增加。\n[0477] 表P：用YEP16编码核酸转化的转基因植物的\n[0478] T1代饱满种子数、种子总重量、饱满率以及收获指数结果\n[0479] \n表型 T1评估：显示增加的事件个数 F检验的P值\n种子总重量 所有3个品系显示出22％的平均增加 显著\n饱满种子数 所有3个品系显示出22％的平均增加 显著\n种子饱满率 所有3个品系显示出15％的平均增加 显著\n收获指数 所有3个品系显示出18％的平均增加 显著\n[0480] 实施例 I型shaggy样激酶及编码核酸\n[0481] 实施例28：基因克隆\n[0482] 使用拟南芥幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩\n增稻I型shaggy样激酶编码基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMV \nSport 6.0中。该库平均插入物大小为1.5kb，并且原始克隆数的数量级为1.59×107cfu。\n在6×1011cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为9.6×105cfu/ml。提取质粒之后，将\n200ng模板用于50μlPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm5797(SEQ ID NO：179；有义，\n起始密码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’-\nggttcagtaggggttg-3’) 和prm5798(SEQ ID NO：180；反 向 互 补，终 止 密 码\n子 为 粗 体，AttB2 位 点 为 斜 体：5’-\nagctgtctcatactcctgc-3’)，它们包括进行Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用\nHifi Taq DNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化1328bp的PCR片段。接着进\n行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以\n产生(根据Gateway术语)“进入克隆”。作为 技术一部分的质粒pDONR201购\n自英骏公司。\n[0483] 实施例29：载体构建\n[0484] 随后使用进入克隆和用于稻转化的指定载体一起进行LR反应。此载体在T-DNA\n边界内包含这样的功能元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到\n进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启\n动子位于此Gateway盒的上游(De Pater等，Plant J.1992Nov；2(6)：837-44)。\n[0485] LR重组步骤之后，将所产生的表达载体(图15)转化进入农杆菌菌株LBA4044，随\n后如实施例30所述转化进稻植物。\n[0486] 实施例30：稻转化\n[0487] 将梗稻栽培种的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％\nHgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6×15分钟进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D(愈\n伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生\n的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周\n增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组\n织块(为了促进细胞分裂活性)。利用含双元T-DNA载体的农杆菌菌株LBA4404进行共培\n养。农杆菌接种于含有合适的抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并\n悬浮在液体共培养培养基中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈\n伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑\n暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于\n28℃暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培\n养基之后在光照下孵育，显示出胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈\n伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的\n芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单\n基因座转化体的比率超过50％(Aldemita和Hodges，Planta，199612-617，1996；Chan等，\nPlant Mol.Biol.22(3)491-506，1993，Hiei等；Plant J.，6(2)271-282，1994)。\n[0488] 实施例31：盐胁迫筛选\n[0489] 播种种子，并通过监测可视标记的表达来选择幼苗。播种后10天，将幼苗移植到\n直径12cm的塑料盆中，盆里装满1∶1的湿沙和蛭石混合物。移植前用清水浸透花盆。然\n后将幼苗由组织培养室移植到温室生长并收获T1种子。移植后1天将花盆置于盐条件下。\n每天四次于8am、12pm、4pm和9pm用含25mM NaCl和下文所列组分的盐胁迫营养液对花盆\n进行浇灌：\n[0490] ●NPK营养混合物20-20-20Peters professional(美国俄亥俄州玛丽斯维尔市\n3\n斯科特(Scotts)公司)，浓度1kg/m\n[0491] ●螯合镁Chelal Mg(比利时柏南的BMS公司)，333.33ml/m3\n[0492] ●螯合离子Libfer(英国布拉德福CIBA公司)，21.67g/m3\n[0493] ●NaCl 1.425kg/m3\n[0494] 以周为基础监测盐浓度，并在必要的时候进行盐添加。在这些条件下培养植物，直\n到谷粒开始充实。然后将其转移到温室中不同的区室，每日用清水浇灌，直到收获种子。如\n实施例32所详述的那样记录生长和产率参数。\n[0495] 实施例32：评估和结果\n[0496] 产生了大约15到20个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温\n室生长并收获T1种子。至少5个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3∶1\n分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合\n子)的T1幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。按照T1代相同的评\n估方法对4个表现最佳的T1事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事件使用更多的个\n体。\n[0497] 统计分析：F检验\n[0498] 利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对\n用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查\n基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基\n因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，\n这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。\n[0499] 32.1种子相关参数的测量\n[0500] 收获成熟的初级圆锥花序、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三\n天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。\n弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过称量所有从植物中\n收获的饱满谷壳来测量种子总产率。收获指数在本发明中定义为种子总产率和地上面积\n2 6\n(mm)之间的比值，再乘以因子10。\n[0501] 下文的结果表显示了T1和T2评估的F检验的p值。还显示了转基因与相应无效\n合子(或不含转基因的植物)之间差异百分比。例如，对于T1代中的种子总重量，2个事件\n为种子总重量阳性(即在盐胁迫条件下，与相应无效合子植物的种子重量相比，显示为种\n子总重量增加(＞54％，其中F检验的p值＜0.1938))。在T2代中，1个事件为种子总重\n量阳性(即在盐胁迫条件下，与相应无效合子植物的种子重量相比，显示为种子总重量增\n加(65％，其中F检验的p值为0.0252))。\n[0502] 表Q：盐胁迫条件下的T1和T2代\n[0503] shaggy样激酶转基因植物和相应非转基因植物\n[0504] \n 表型 T1 差异 p值 T2 差异 p值\n 面积最大 1个事件 47％ 0.0254 1个事件 19％ 0.0951\n 饱满种子数 1个事件 58％ 0.0376 1个事件 61％ 0.0313\n 种子总数 2个事件 41％ ＜0.191 1个事件 28％ 0.0999\n 每个圆锥花序的花数 1个事件 55％ 0.0177 1个事件 26％ 0.0072\n 种子总重量 2个事件 ＞54％ ＜0.1938 1个事件 65％ 0.0252\n TKW 1个事件 6％ 0.1008\n 收获指数 2个事件 ＞57％ ＜0.0627 1个事件 54％ 0.0086\n[0505] 用于本发明方法的序列对玉米、小麦、大豆、芸苔、苜蓿的转化\n[0506] 玉米转化\n[0507] 用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方案进行玉\n米(玉蜀黍)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型才能转化和\n再生。近交系A188(明尼苏达大学(University ofMinnesota))或以A188为亲本的杂种是\n转化供体材料的优秀来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉后(DAP)约11天，当未\n成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物中收获穗。对未成熟胚与含表达载体的根癌\n农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行共培养，并通过器官发生回收转基因植物。切\n下的胚先后在愈伤组织诱导培养基和含有选择剂(如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)\n的玉米再生培养基上培养。培养板于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个\n胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移\n植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1\n种子。\n[0508] 小麦转化\n[0509] 通过Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50所述的方法进行小麦的转\n化。转化常用栽培种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT公司获得)。对未成熟胚和含表达载体\n的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植株。胚与农杆菌孵育后，先后在体\n外在愈伤组织诱导培养基和含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的再\n生培养基上培养。培养板于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿\n芽转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土\n壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。\n[0510] 大豆转化\n[0511] 根据在德克萨斯农工大学(Texas A&M)的专利US 5,164,310中所述方法的改良\n方案转化大豆。一些商业的大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(得自伊利诺斯种\n子公司(the Illinois Seed foundation))通常用于转化。对大豆种子进行消毒以用于体\n外播种。从七天龄幼苗切离下胚轴，胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以\n发育腋结。切下这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗涤外\n植体并转移到选择培养基中。切下再生的芽并置于芽伸长培养基中。将长度不超过1cm的\n芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出\n耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。\n[0512] 油菜籽/芸苔转化\n[0513] 利用5-6天龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养，并根据Babic等\n(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业的栽培种(加拿大农业(Agriculture \nCanada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子进行表面消毒用\n于体外播种。从体外幼苗中切离附着了子叶的子叶柄外植体，并通过将叶柄外植体的切割\n端浸入细菌悬液中来接种农杆菌(含有表达载体)。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％\n蔗糖、0.7％植物凝胶（Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农\n杆菌共培养2天后，将叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀\n(300mg/l)的MSBAP-3培养基中培养7天，然后在具有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选\n择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培\n养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)进行根\n诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA\n插入物的植物产生T1种子。\n[0514] 苜蓿转化\n[0515] 利用(McKersie等1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫花苜\n蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植株\n的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业)或任何其它的如\nBrown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的\n商业苜蓿品种。可选地，选择RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))进行组\n织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆\n菌C58C1pMP90的过夜培养物(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)或LBA4404\n进行共培养。将外植体在含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm\n乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。将外植体在半强度Murashige-Skoog\n培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，该培养基不含\n有乙酰丁香酮但含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，将体细胞\n胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后使体\n细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到盆中并在温室中生\n长。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。