负载生长因子的胶原基复合材料及其制造方法和应用

1.一种负载生长因子的胶原基复合材料，其特征在于它是以胶原、生长因子、壳聚糖、肝素纳米粒子为原料制备，由致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成双层结构，双层中间复合包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子；具体制备工艺：胶原溶胀液风干后的胶原膜在交联液中交联，风干，得结构致密胶原膜；胶原溶胀液在预冻后真空冷冻干燥，压平，冻干，于交联液中交联后再次真空冷冻干燥，得结构疏松多孔胶原膜；搅拌下壳聚糖的乙酸溶液与含有生长因子的肝素溶液混合得到生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子；在润湿的交联疏松层胶原膜表面滴加包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子，风干，再将润湿的交联致密层胶原膜铺平于交联疏松层胶原膜表面，风干。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于所述的壳聚糖与肝素的质量比为
4-8∶5-10；肝素的分子量3000-20000；壳聚糖的分子量8000-20000，脱乙酰度70-90％。
3.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于每平方厘米交联疏松层胶原膜生长因子用量为50-10000ng；双层膜平均厚度1-4mm。
4.一种权利要求1所述的负载生长因子的胶原基复合材料的制备方法，其特征在于包括的步骤：
1)取胶原溶胀液稀释至0.3-0.8％质量百分比浓度，在4-8℃风干，即得结构致密胶原膜；致密胶原膜置交联液中交联并再次风干，即得交联的致密层胶原膜；
2)将0.3-0.8％的胶原溶胀液加入容器中，-20--40℃预冻后真空冷冻干燥，取出后压平，即得结构疏松多孔胶原膜，冻干的胶原膜置交联液中交联后再次真空冷冻干燥，即得交联的疏松层胶原膜；
交联液配方：0.05-0.4mol.L-1核糖+2.5％-20％丙酮+0.5-4％氨水；
-1
3)搅拌条件下将pH 6.的1-4mg.ml 壳聚糖-乙酸溶液滴入含生长因子的
-1
0.5-2mg·ml 的肝素溶液中，滴速10-60滴/min，得到包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子；搅拌转速为500-700rpm；纳米粒的粒径为100-1000nm；
4)将交联疏松层胶原膜双蒸水润湿后平铺，在其表面缓慢滴加包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子，4-8℃下风干至表面无流动液体，再将交联致密层胶原膜润湿后铺平于交联疏松层胶原膜表面，4-8℃下彻底风干，即得负载生长因子的胶原基复合材料。
5.根据权利要求4所述的复合材料的制备方法，其特征在于所述的胶原为I型胶原或II型胶原；所述的胶原为牛腱来源或是其它种属动物来源的胶原蛋白。
6.根据权利要求4所述的复合材料的制备方法，其特征在于所述的胶原溶胀液是牛腱I型胶原溶胀液。
7.根据权利要求4所述的复合材料的制备方法，其特征在于步骤2)的胶原膜负用D-核糖通过美拉德反应交联，或是采用光化学法、射线照射物理方法或戊二醛、环氧化合物、碳化二亚胺1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)、京尼平化学试剂交联。
8.根据权利要求4所述的复合材料的制备方法，其特征在于步骤3)的纳米粒子的制备方法为离子交联法，或是超声法、溶剂挥发法、薄膜分散法制备纳米粒子。
9.根据权利要求4所述的复合材料的制备方法，其特征在于所述的负载生长因子为碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子，以及人工合成的上述这些生长因子的活性肽中的一种或一种以上混合使用。
10.权利要求1所述的负载生长因子的胶原基复合材料用于主动诱导缺损处组织修复材料。

负载生长因子的胶原基复合材料及其制造方法和应用\n技术领域：\n[0001] 本发明涉及一种负载生长因子的胶原基复合材料及其制造方法和应用，该材料对其负载的生长因子有定向差异控缓释作用，可用于病缺损组织的修复治疗。\n背景技术：\n[0002] 胶原是细胞外基质(ECM)的主要成份，属于结构蛋白质，约占哺乳动物蛋白质总质量的1/3，大量存在于皮肤、韧带、软骨、肌键等结缔组织或器官中。胶原具有良好的生物相容性，植入体内无毒副作用和刺激性，不易引起机体免疫反应，而且也有利于细胞的黏附、增殖和分化，加快创面愈合，并可降解而为新生组织提供足够的空间，广泛应用于生物材料的研究和开发利用中。但是单一材料存在着生物活性、强度等问题，复合材料尤其是负载生长因子赋予材料优良的生物活性是目前生物材料领域主要研究方向。\n[0003] 近年来，复合生长因子的组织修复材料研究非常广泛，具有生长因子纳米缓释作用的组织修复材料逐渐显示出明显的优势，主要表现为复合的生长因子或其它生物活性分子等可通过溶解、包裹作用位于粒子内部，或通过吸附、附着作用位于粒子表面，包封率高，体积小，可直接作用于靶组织/细胞，减少使用因子剂量，缓释时间长，保存方便。引入与组织细胞增生、分化有关的多种生长因子，是提高材料生物活性的有效途径。在引导组织再生过程中引入生长因子，其目的是通过拟生态或模仿从胚胎到分娩前这段时期组织的形成过程，来修复受损伤组织。一种生长因子的作用就可能引起多种分子生物学、生物化学和形态学上的级联反应，这一系列反应最终达到组织修复的效果。但是这些生长因子大多易降解，半衰期短，并且有研究通过比较不同浓度bFGF的效果，证明bFGF生物活性的发挥具有剂量依赖性。所以在引导组织再生材料中引入生长因子时必须考虑蛋白活性的保护与释放量的控制。药物传递系统的发展提高了生长因子在体内转运效率。可生物吸收的控缓释支架材料既可以包载生长因子，同时又可以根据生物需要量以适当的浓度缓慢地将生长因子释放到目标组织以达到修复目的。有研究表明，生长因子包载于微球后与PLGA支架材料复合，可以将生长因子的缓释时间维持15天。但多数研究过程中使用了较为剧烈的条件，如有机溶剂的使用，可能造成生长因子的活性损失；同时生长因子的释放多数存在突释现象，而且对于生长因子的释放方向没有进行控制，生长因子既可以释放于病损组织，又可能释放于病缺损组织周围，从而产生不可预见的后果，并造成了生长因子本身的浪费。因此，有必要设计新型生长因子释放体系，进而制备复合生长因子的引导组织再生材料，用于病损组织的再生修复。有人在胶原材料中加入组氨酸，并通过改变EDAC/NHS对胶原材料的交联时间，从而达到改变材料孔径的效果，进一步地考察了包载了药物的不同孔径的材料对药物的释放规律。结果表明胶原材料的结构与药物释放率有明显的相关性。根据这一研究结果，同时利用胶原材料可以作为生长因子的存储库作用，制备多层不同结构的胶原复合材料，可能获得对生长因子有定向差异释放作用的胶原基复合材料。\n发明内容\n[0004] 本发明目的在于克服现有组织修复材料的不足，提供一种负载生长因子的胶原基复合材料及其制造方法和应用。它是用于组织缺损修复的新型复合材料。该材料具有主动诱导缺损处组织再生修复的生物学活性，同时实现生长因子定向差异释放于组织缺损处，避免生长因子无序释放造成的不可预测后果和因子本身的浪费。\n[0005] 本发明提供的负载生长因子的胶原基复合材料是以胶原、生长因子、壳聚糖、肝素纳为原料制备，由致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成双层结构，双层中间复合包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子。每平方厘米交联疏松层胶原膜生长因子用量为50-10000ng；\n双层膜平均厚度1-4mm。\n[0006] 具体制备工艺：胶原溶胀液风干后的胶原膜在交联液中交联，风干，得结构致密胶原膜；胶原溶胀液在预冻后真空冷冻干燥，压平，冻干，于交联液中交联后再次真空冷冻干燥，得结构疏松多孔胶原膜；搅拌下壳聚糖的乙酸溶液与含有生长因子的肝素溶液混合得到生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子；在润湿的交联疏松层胶原膜表面滴加包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子，风干，再将润湿的交联致密层胶原膜铺平于交联疏松层胶原膜表面，风干。\n[0007] 壳聚糖与肝素的质量比为4-8∶5-10；肝素的分子量3000-20000；壳聚糖的分子量8000-20000，脱乙酰度70-90％。\n[0008] 本发明提供的负载生长因子的胶原基复合材料制备方法包括的步骤：\n[0009] 1)取胶原溶胀液稀释至0.3-0.8％质量百分比浓度，在4-8℃风干，即得结构致密胶原膜；致密胶原膜置交联液中交联并再次风干，即得交联的致密层胶原膜；\n[0010] 2)将0.3-0.8％的胶原溶胀液加入容器中，-20--40℃预冻后真空冷冻干燥，取出后压平，即得结构疏松多孔胶原膜。冻干的胶原膜置交联液中交联后再次真空冷冻干燥，即得交联的疏松层胶原膜。\n[0011] 交联液配方：0.05-0.4mol.L-1核糖+2.5％-20％丙酮+0.5-4％氨水。\n[0012] 3)搅拌条件下将pH 6.的1-4mg·ml-1壳聚糖-乙酸溶液滴入含生长因子的-1\n0.5-2mg·ml 的肝素溶液中，滴速10-60滴/min，得到包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子。壳聚糖与肝素的质量比为4-8∶5-10；搅拌转速为500-700rpm。纳米粒的粒径为\n100-1000nm。\n[0013] 4)将交联疏松层胶原膜双蒸水润湿后平铺，在其表面缓慢滴加包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子，4-8℃下风干至表面无流动液体，再将交联致密层胶原膜润湿后铺平于交联疏松层胶原膜表面，4-8℃下彻底风干，即得负载生长因子的胶原基复合材料。\n[0014] 所述的胶原可以为Ⅰ型胶原或Ⅱ型胶原。所述的胶原为牛腱来源，也可以是其它种属动物如猪来源的胶原蛋白。\n[0015] 步骤2)的胶原膜负可用D-核糖通过美拉德反应交联，也可以是采用光化学法、射线照射等物理方法或戊二醛、环氧化合物、碳化二亚胺1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)、京尼平等化学试剂交联。\n[0016] 步骤3)的纳米粒子的制备方法为离子交联法，也可以是其它方法制备的纳米粒，如超声法、溶剂挥发法、薄膜分散法等。\n[0017] 所述的负载生长因子为碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子，以及人工合成的上述这些生长因子的活性肽中的一种或一种以上混合使用。\n[0018] 本发明提供的负载生长因子的胶原基复合材料用于主动诱导缺损处组织修复，复合材料对所负载的生长因子有定向差异控缓释作用，体外的控缓释周期为7-20天或更长。\n所述的定向差异控缓释作用表现为，生长因子经由疏松层向释放液释放的速度与经由致密层向释放液释放的速度不同。所述的释放液包括PBS、生理盐水、血清及其它模拟体液。\n[0019] 本发明所述定向生长因子控缓释胶原基组织修复材料为双层结构，分别为致密胶原膜和疏松胶原膜，中间置有包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒，具有结构稳定，无毒副作用的特点，对其中复合的生长因子有定向差异控缓释作用，从而实现生长因子主动诱导缺损处组织修复。该材料还具有良好的生物相容性、生物降解性和极低的免疫原性，而且各种原料易得，制备工艺条件较温和，是一种较好的病缺损组织修复材料。\n附图说明\n[0020] 图1为包载bFGF的壳聚糖-肝素纳米粒子透射电镜图。\n[0021] 图2为包载bFGF的壳聚糖-肝素纳米粒子平均粒径图。\n[0022] 图3为复合bFGF胶原基组织修复材料场发射扫描电镜图(CAF：致密层，CFF：疏松层)。\n[0023] 图4为复合HSA胶原基组织修复材料中HSA在PBS中20d累积释放百分率曲线。\n[0024] 图5为复合HSA胶原基组织修复材料中HSA在胶原酶溶液中10d累积释放百分率曲线。\n具体实施方式\n[0025] 实施例1：疏松和致密两种胶原膜的制备\n[0026] 1.牛腱Ⅰ型胶原溶胀液的制备\n[0027] 将市购新鲜牛腱充分清洗，去除腱周组织及腱鞘和筋膜，洗涤后置冷柜中冷冻。取出冷冻牛腱横向切成厚约1mm切片，加入无花果蛋白酶溶液(浓度0.05-0.25％)处理，搅拌后置恒温箱内酶解24h，再加过量H2O2终止反应，蒸馏水冲洗3-4次，滗干后加0.3％丙二酸溶液溶胀24h。溶胀后的腱片充分搅拌6h，用0.3％的丙二酸溶液调节粘度，80-120目不锈钢网正压过滤，除去杂质和未溶胀物，封装即得。\n[0028] 2.风干胶原膜的制备。\n[0029] 取上述制备的胶原溶胀液，加0.3％丙二酸溶液稀释至0.6％质量百分比浓度，按\n250g胶原溶胀液加入面积14cm×12cm容器中，风干72h，即得风干胶原膜。\n[0030] 3.冻干胶原膜的制备\n[0031] 将上述的0.6％的胶原溶胀液按250g加入14cm×12cm×1.5cm容器中，-35℃预冻\n2h后真空冷冻干燥72h。冻干工艺条件：第一段温度-30℃，降温速率1℃/min，恒温时间\n30h；第二段温度-15℃，升温速率1℃/min，恒温时间20h；第三段温度0℃，升温速率1℃/min，恒温时间12h；第四段温度10℃，升温速率1℃/min，恒温时间6h；第五段温度15℃，升温速率1℃/min，恒温时间4h。取出冻干胶原膜置于两块聚四氟乙烯平板之间压平整，即得冻干胶原膜。\n[0032] 4.风干胶原膜和冻干胶原膜的交联\n[0033] 4.1交联液配方：0.2mol.L-1核糖+10％丙酮+2％氨水。\n[0034] 4.2风干胶原膜的交联\n[0035] 风干胶原膜置于交联液中交联反应48h，取出，去离子水冲洗5遍后浸泡24h，再次风干，即得交联的风干胶原膜(致密胶原膜)。\n[0036] 4.3冻干胶原膜的交联\n[0037] 冻干胶原膜置于交联液中交联反应48h，取出，去离子水冲洗5遍后浸泡\n24h，-35℃预冻2h后真空冷冻干燥24h。冻干工艺条件：第一段温度-30℃，降温速率1℃/min，恒温时间10h；第二段温度-15℃，升温速率1℃/min，恒温时间6h；第三段温度0℃，升温速率1℃/min，恒温时间4h；第四段温度10℃，升温速率1℃/min，恒温时间2h；第五段温度15℃，升温速率1℃/min，恒温时间2h。取出后置于两块聚四氟乙烯平板之间压平整，即得交联的冻干胶原膜(疏松胶原膜)。\n[0038] 实施例2：离子交联法制备壳聚糖-肝素-bFGF纳米粒子\n[0039] 1.将壳聚糖(分子量10000，脱乙酰度85％)溶解于1％乙酸溶液，过滤后透析\n4d，冷冻干燥，得到纯化壳聚糖。\n[0040] 2.称取0.2g壳聚糖溶解于5ml 1％乙酸，0.1mol·L-1 NaOH调pH至6.0，定容至-1\n100ml，得到浓度为2mg·ml 壳聚糖溶液，过滤，除去其中杂质。\n[0041] 3.在1mg·ml-1肝素(分子量12000)溶液中加入预计用量的bFGF，混合过夜(8-12-1 -1\n小时)。在4℃，转速700rpm搅拌下，将2ml 2mg·ml 壳聚糖溶液逐滴滴入5ml 1mg·ml复合bFGF肝素中，滴速20滴/min，即得到包载bFGF的壳聚糖-肝素纳米粒子。\n[0042] 制得的纳米粒在透射电镱下观察大小较均一，见图1；纳米粒粒径分布较窄，平均粒径为149.5nm，见图2。\n[0043] 实施例3：负载bFGF胶原基复合材料制备\n[0044] 将上述的实施例制得的交联疏松层胶原膜双蒸水润湿后平铺，在其表面缓慢的滴加包载bFGF的Ch-He纳米粒子，铺满整个表面。4℃下风干至CFF表面无流动相液体，再将交联致密层胶原膜润湿后铺平于存留少量液体的交联疏松层胶原膜表面，4℃下彻底风干，-2\n即得负载bFGF的胶原基复合材料，其中bFGF的量为100ng/cm 。\n[0045] 将双层材料横断面喷金，场发射扫描电镜观察可见(图3)：复合材料由两层结构复合形成，致密层结构致密平整，疏松层疏松多孔，这种结构可以满足差异定向释放对双层材料两侧疏密程度不同的要求。致密与疏松如何限定\n[0046] 实施例4：胶原基复合材料体外释放动力学实验\n[0047] 上述复合材料可以负载bFGF、骨形成蛋白(BMP)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等多种生物活性因子，以适用于多领域或不同修复阶段的组织修复，以人血清白蛋白(HSA)为模型因子，进行负载HSA胶原复合材料体外释放动力学研究。\n[0048] 1.6mg HSA溶于50mmol.L-1磷酸缓冲液800μl中，0.5mg氯胺T和0.5mg偏亚硫酸钠分别溶于磷酸缓冲液100μl中。\n[0049] 取HSA 100μl加入微量标记管中，再加入Na125I 1.6μl(0.5mCi)，加入50μl氯-1\n胺T，室温掁荡5min后加50μl偏亚硫酸钠终止反应。反应液转移至用50mmol.L 磷酸缓冲液平衡并被空白HSA吸附的Sephadex-G50柱中。反应液中加入10μl 1％NaI液作为分\n125\n离 I载体。\n[0050] Sephadex-G50柱用50mmol.L-1磷酸缓冲液冲洗，每10滴收集1管，每分钟10滴，共收集45管。每个管中取1μl测量放射性强度，确定单位质量HSA的放射性强度。\n[0051] 以上磷酸缓冲液pH均为7.4。\n[0052] 按每块直径13mm的材料，其放射性强度为1μCi(1μCi＝1.55×106cpm)的比例，\n125 125\n将一定量 I-HSA与2ml 1mg.ml-1肝素混合，4℃过夜并制备包载 I-HSA的壳聚糖-肝素\n125\n纳米粒，并制得包载 I-HSA的胶原基组织修复材料。\n[0053] 应用流池法进行检测：将直径13mm包载125I-HSA的胶原基复合材料置于内径为\n13mm的滤器内，在恒流泵作用下使释放液从双层材料流出，流出的方向分别为致密胶原膜至疏松胶原膜、疏松胶原膜至致密胶原膜，释放液分别为PBS(pH7.4)溶液或0.5μgⅠ型胶原酶溶液，流速均为10ml/12h。取各组收集的释放液200μl，放射性免疫γ计数器检测放射性强度，并计算每d总收集液放射性强度。\n[0054] 在PBS水溶液溶胀作用下，HSA由致密层向疏松层20d累积释放百分率(69.4％)大于相反方向释放的累积释放百分率(56.4％)，体现出了包载蛋白的定向释放性(图4)；\n在胶原酶溶液中，HSA由致密层向疏松层10d累积释放百分率(52.1％)小于相反方向释放的累积释放百分率(64.5％，图5)，表现出复合材料对负载的HSA的定向差异释放作用。而胶原酶溶液中正好相反，与疏松层胶原结构相对疏松多孔，易被胶原酶降解有关，也表现出复合材料对负载的HSA的定向差异释放作用。