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专利名称 | 用于免疫诊断1型糖尿病的组合物 |
申请号 | CN200910119996.7 | 申请日期 | 2009-03-03 |
法律状态 | 权利终止 | 申报国家 | 中国 |
公开/公告日 | 2010-09-08 | 公开/公告号 | CN101825637A |
优先权 | 暂无 | 优先权号 | 暂无 |
主分类号 | G01N33/66 | IPC分类号 | G;0;1;N;3;3;/;6;6查看分类表>
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申请人 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所;上海海泰金芯生物分子检测技术有限公司 | 申请人地址 | 北京市海淀区太平路27号
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权利人 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所,上海海泰金芯生物分子检测技术有限公司 | 当前权利人 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所,上海海泰金芯生物分子检测技术有限公司 |
发明人 | 冯晓燕;张贺秋;宋晓国;王国华;陈坤;朱翠侠;方平;葛海鹏 |
代理机构 | 暂无 | 代理人 | 暂无 |
摘要
本发明涉及用于血清学免疫诊断1型糖尿病的组合物,其包含胰岛β细胞特异的IGRP和ZnT8抗原,或其与选自常用抗原GAD65和IA-2的一种或两种的组合。
1.用于血清学免疫诊断1型糖尿病的组合物,其由IGRP抗原和ZnT8抗原组成。
2.权利要求1所述的的组合物,其中IGRP抗原为SEQ ID NO:1所示多肽。
3.权利要求1所述的的组合物,其中ZnT8抗原为SEQ ID NO:2所示多肽。
4.权利要求1所述的组合物,其中IGRP和ZnT8抗原以融合抗原的形式存在。
5.权利要求4所述的组合物,其中IGRP和ZnT8抗原的融合抗原为SEQ ID NO:5所示多肽。
用于免疫诊断1型糖尿病的组合物\n技术领域\n[0001] 本发明涉及自身免疫性1型糖尿病的诊断领域。更具体而言涉及使用源于多种自身抗原的组合物诊断自身免疫性1型糖尿病的领域。\n[0002] 发明背景\n[0003] 糖尿病是一种因胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的以高血糖症为主要特征的代谢性疾病,受多种遗传和环境因素影响,这些因素可导致机体不能对碳水化合物、脂肪和蛋白有效利用。糖尿病危害巨大,主要是其严重的并发症和高死亡率。随着糖尿病得病时间的延长,体内代谢紊乱如得不到很好的控制,可导致眼、肾、神经、血管、心脏等组织、器官的慢性并发症,以致最终发生失明、下肢坏疽、尿毒症、脑中风或心肌梗死,甚至危及生命。糖尿病人死亡率较非糖尿病人高11倍。全球每年死于此病的人数约为400万,占全球总死亡人数的9%。目前,我国是糖尿病患者最多的三个国家(印度、中国、美国)之一,糖尿病患者数量已经超过4000万人。此外,尚有数千万的糖调节功能受损者,此类人群成为糖尿病的庞大“后备军团”。\n[0004] 按照1997年美国糖尿病协会及1999年WHO关于糖尿病(diabetesmellitus,DM)分类及诊断建议标准,DM分为1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病。T1DM包括自身免疫性(1a)和特发性(1b)两大类。自身免疫性糖尿病主要由于胰岛β细胞自身免疫性破坏,导致胰岛素分泌的绝对不足引起,其特性表现为外周血中出现针对胰岛β细胞相关分子的自身抗体。1型糖尿病的发病率每年以2.5%的速率增长,预测2010年的发病率将比1998年高出40%(Atkinson MA等,The Lancet,358:\n221-229(2001))。\n[0005] 1型糖尿病的早期预防可分为三期:一期是有1型糖尿病发病倾向高危人群,此时免疫学指标尚未出现。二期是免疫破坏期,此时血清内已有抗胰岛细胞自身抗体出现,是1型糖尿病预防的关键时期。三期是1型糖尿病发病早期,此时已出现糖尿病症状。因此如何在免疫破坏期筛检免疫学指标,对于在非糖尿病人群中发现1型糖尿病高危人群具有重大的意义。\n[0006] 在1型糖尿病的免疫破坏期,患者体内会产生多种针对胰岛细胞自身抗原的自身抗体。自20世纪70年代以来,研究者们已经发现了多种胰岛自身抗体。例如在70年代,首次发现了胰岛细胞抗体(ICA)和胰岛细胞表面抗体(ICSA)。80-90年代,又相继发现了胰岛素抗体(IAA)、羧肽酶H抗体、热休克蛋白抗体(HSP)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A、IA-2βA、ICA69)等。进入21世纪,又陆续发现了热休克蛋白90自身抗体(hsp90)、胰岛特异的葡萄糖-6-磷酸酶抗体(IGRP)、锌转运子ZnT8抗体(ZnT8)等。目前,1型糖尿病诊断中最为常用的诊断指标包括ICA、IAA、GADA和IA-2A。\n[0007] 胰岛细胞抗体(ICA)是胰岛β细胞的胞浆抗体,属免疫球蛋白,对胰岛细胞的胞浆成分产生细胞毒效应,为特异性抗体。ICA是一种混合抗体,为抗胰岛β细胞所有抗体的总称。有文献报道ICA是与全部胰岛细胞(如α、β、γ、δ和PP细胞)反应的多克隆自身抗体总称。ICA识别的脂类和蛋白质自身抗原可能包括唾液酸糖缀合物、GAD、IA-2等。\n大量研究表明,有70%1型糖尿病患者血清中存在ICA,且存在的时间很短,仅出现在胰岛炎发生前无高血糖阶段及1型糖尿病的初期,具有随着发病年龄的延长而降低的特性。新发糖尿病,ICA阳性率为70-90%,ICA随着诊断后逐渐降低,诊断出糖尿病10年后,ICA阳性率为5-10%。Jensen R等(Diabet Med,24:1221-1228(2007))的研究发现ICA阳性的\n1型糖尿病患者初诊后的6年中,ICA阳性率以每年24%的比率下降,而且平均ICA水平也逐年下降。ICA常常通过运用人、猴或啮齿类胰腺切片进行间接免疫荧光检测。该方法发明于1974年,目前仍然在使用。但由于该方法是检测混合抗体且方法繁琐,受到一定限制,将来应该有可能被更特异的检测指标和更简单的检测方法所取代。\n[0008] 胰岛素是第一个报道的胰岛自身抗原和β细胞特异自身抗原。但检测胰岛素自身抗体(IAA)应在施用外源胰岛素(动物胰岛素或人胰岛素)之前,因为使用外源胰岛素治疗5-7天后就会产生胰岛素抗体(Barker JM等,Diabetologia,50:1603-1606(2007))。\n免疫沉淀试验证明胰岛素自身抗体不能区别自发自身抗体和免疫应答抗体(外源胰岛素治疗产生的抗体)。此外,在一些其它自身免疫性疾病(包括自身免疫性甲状腺疾病)中也存在IAA。1型糖尿病初期,IAA在儿童中最早出现存在,而在成人中则降低。在小于5岁的儿童中,90%的孩子存在IAA;5-10岁的的儿童中,70%存在IAA;而10-15岁的的儿童中,则只有50%存在IAA;在成人中,研究结果一般都以低于40%(Achenbach P等,J Clin Invest,114(4):589-597(2004)),在池莲祥等(中国实验诊断学,9:406-408(2005))研究结果中仅为6.67%,而且IAA检测易受到胰岛素治疗诱导产生的胰岛素抗体的影响,因此单独诊断价值不高。人体内有多种形式的胰岛素可能会与免疫系统相互作用,免疫原性最强的分子可能是胰岛素原和前胰岛素原。IAA表位定位于胰岛素的B链。目前,免疫诊断用胰岛素诊断IAA多用放射性免疫荧光测定法(RIA),个别实验室采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法进行测定。\n[0009] 谷氨酸脱羧酶(GAD)是催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的酶,由分泌γ-氨基丁酸的神经细胞和非神经组织如胰腺的胰岛β细胞合成的酶。哺乳类动物中GAD有两种异形体,即GAD65和GAD67,分子量分别为65kD和67kD。两种蛋白质由不同的基因编码,具有64%的氨基酸同一性。GAD除了在脑内表达外,在胰岛细胞的表达量也可观。人类成熟胰岛中GAD65表达量大于GAD67,二者在β细胞内含量丰富,且在α细胞内也可检测到。\nGAD67和GAD65尽管有高度同源性,但是大多数T1DM病人中的自身抗体反应局限于GAD65特异性表位,只有11%~18%的病人具有与GAD67共同的表位,没有仅对GAD67反应的抗体。因此,GAD67不是T1DM中的独立抗原。\n[0010] GAD65抗体可能是具有共同特性的一组抗体,而不是单一抗体。绝大多数抗体识别GAD65构象表位,不与变性蛋白质反应,所以构象上的完整性对于GADA检测试剂盒非常关键。已确定的GAD65表位包括氨基端结构域、中间结构域和羧基端结构域,并证明后二者占主导地位。GADA是继IAA抗体之后出现的自身抗体,12岁以后发病的儿童主要存在GADA,而且,GADA可能是成人隐匿性1型糖尿病的主要免疫标记物(Palmer JP等,Diabetes,\n54 Suppl2:S62-67(2005))。GADA在1型糖尿病发病前期和发病时的阳性率一般很高为\n60%-80%,而在2型糖尿病中仅为3.2%。初诊1型糖尿病患者体内GADA阳性比率会以每年9%的比率下降,但抗体水平维持不变,因此GADA是检测非常有用的自身抗体。GADA检测多采用使用重组人GAD65的放射性配体结合试验(RBA)或RIA方法,少数采用ELISA方法。但最近Villalba A等(Autoimmunity,41:143-153(2008))发现共聚焦间接免疫荧光(confocal IIF)比RBA等方法具有更高的敏感性。\n[0011] 胰岛细胞瘤相关蛋白-2(IA-2)是受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)超家族中的一员,全长979个氨基酸,分子量为106kD。IA-2结构上分4部分:信号肽(1-25aa)、胞外结构域(26-576aa)、单一跨膜结构域(577-600aa)及胞内结构域(601-979aa),其中胞内结构域的羧基末端含有PTP样区(683-979aa)。IA-2表达于正常人脑、垂体、胰腺和脑瘤组织,主要在脑和胰岛组织中表达。IA-2和IA-2β(phogrin)在PTP样区域具有88%的氨基酸序列同源性,近膜区(601-682aa)为<50%的同源性,而在胞外区仅有大约10%的同源性。糖尿病患者自身抗体结合至IA-2和IA-2β的细胞内部分,并且两者之间具有相当的交叉反应性。研究表明,缺乏IA-2抗体时,也检测不到抗IA-2β的抗体,IA-2近膜区可以覆盖IA-2β中未发现的全部表位,因此表明IA-2可能是糖尿病相关自身抗原体液免疫反应的主要靶标。在IA-2抗体中,反应性平均分布于在近膜区(601-682aa)和PTP样区域(683-979aa)内所发现的表位。近膜区和PTP样区域内的IA-2特异残基在早期抗原抗体识别中是重要的(Bonifaeio E等,JImmunol,161:2648-2654(1998))。IA-2A存在于55-75%新发1型糖尿病患者,而正常对照人群阳性率仅为1%。IA-2A阳性率一般维持不变,且抗体水平在初诊后的6年中仅轻微下降。\n[0012] 经典的IA-2A检测方法是用兔网织红细胞真核表达系统制备的35S标记的IA-2建立的放射免疫沉淀法。近年来,又获得了原核表达的具有免疫学活性的重组蛋白,大大提高了蛋白的产量,并建立了相对简单的RIA及ELISA等方法。最近还有研究者利用哺乳动物细胞表达的融合荧光素酶的IA-2建立了荧光素酶免疫沉淀法,其特异性和敏感性与RIA相似。\n[0013] 锌转运子ZnT8(zine transporter ZnT8)为膜蛋白,具有6个跨膜区,全长为369个氨基酸。与GAD65和IA-2不同,ZnT8是胰岛β细胞高度特异的,ZnT8自身抗体有可能是一个重要的1型糖尿病标记物(Chimienti F等,Diabetes,53:2330-2337(2004))。ZnT8A在年轻个体中较低,在诊断发病3年后的新发患者中急剧增加,在晚青春期新发患者中达到峰值(80%),随后在诊断发病23-30年后的群体中逐渐降低(58%)。在正常对照人群阳性率小于2%,2型糖尿病患者中阳性率小于3%。表位区域鉴定试验表明:全长ZnT8的\n1-369aa构建体敏感性和特异性分别为25%和98%;1-74aa的N-末端构建体敏感性和特异性分别为8%和98%;268-369aa的C-末端构建体敏感性和特异性分别为50%和98%;\nN-末端和C-末端融合后的N/C构建体与C-末端构建体和N/C构建体互补使用后,敏感性可以达到63%(Wenzlau JM等,Proc Natl Acad Sci USA,104:17040-17045(2007))。目前,ZnT8A检测主要局限于实验室,并未在临床上使用。ZnT8A的真正价值在于它有可能成为第四种检测指标,与GADA、IAA和IA-2A组合使用,进一步提高1型糖尿病的早期检出率。\n[0014] 胰岛特异的葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(islet-specificglucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein autoantibodies,IGRP)是表达于胰岛β细胞中的胰岛特异蛋白质,较少表达于α细胞,与肝脏葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基具有大约50%的同一性,该酶催化葡萄糖异生途径的最终步骤。Jarchum等研究者(Clin Immunol,127:359-365(2008))利用IFN-γELISPOT测定法测试了来自新发儿童1型糖尿病患者的外周血单核细胞对4条IGRP肽的反应,结果显示65%的患者对至少1条肽反应,而健康对照对任何肽均不反应。这些结果表明,IGRP是CD8(+)T细胞抗原,CD8(+)T细胞在1型糖尿病的形成中具有重要的作用。此外,Mukherjee R等学者(J Immunol,174:\n5306-5315(2005))还鉴定出2个CD4(+)T细胞表位,能够在NOD小鼠中调节和预防糖尿病的形成。由于胰岛特异表达,IGRP有可能成为研制1型糖尿病诊断试剂的非常优秀的候选自身抗原,其诊断意义还有待进一步研究。\n[0015] 在1型糖尿病发病前、发病早期或发病后会产生许多自身抗体,直到目前为止,与\n1型糖尿病相关的自身抗体仍然不断被大家所发现。通过大量的研究,人们已经清楚地认识到,要确切地诊断1型糖尿病,仅单一一种自身抗体指标的预测能力是非常有限的,几乎所有对1型糖尿病诊断的研究都是在多个免疫指标的基础上进行的。\n[0016] 在以上所列举的自身抗体免疫指标中,临床目前最为常用的是ICA、IAA、GADA和IA-2A,但其中任何一种的检出率都无法达到100%,文献报道的不同方法的检出率均在大约40-90%之间。目前组合测量IAA、GADA和IA-2A可以使自身免疫性糖尿病的诊断率提高到94%。Wenzlau JM等(Proc Natl AcadSci USA,104:17040-17045(2007))将ZnT8A加入到检测指标中后,糖尿病自身抗体阳性个体的数量增加至98%,并且将两种或多种自身抗体阳性个体的数量从72%增加至82%。\n[0017] 另一方面,目前的糖尿病分型诊断方法存在很多不足。首先,运用人、猴或啮齿类胰腺切片进行间接免疫荧光检测ICA的方法是检测混合抗体且非常繁琐,受到很大限制,必将被更特异的检测指标和更简单的检测方法所取代。其次,胰岛素虽然是胰岛细胞特异的,但很多患者需要施用外源胰岛素辅助治疗,而施用外源胰岛素治疗5-7天后就会产生胰岛素抗体。因此,迟发型1型糖尿病患者不宜采用此指标进行检测。再次,GAD65和IA-2都是主要由神经组织和胰岛表达的蛋白,非胰岛细胞高度特异,在临床上部分其它自身免疫性疾病患者,如甲状腺相关疾病、风湿类疾病等,也可以检测到这些自身免疫反应标记物。因此,自身免疫性1型糖尿病诊断试剂在特异性和敏感性方面有待于进一步改进。\n[0018] 本课题组研究人员通过广泛调研,发现IGRP和ZnT8是胰岛β细胞高度特异的抗原,并且通过本发明的工作发现IGRP和ZnT8的某些肽段具有良好的抗原性,即特异性和敏感性都非常高,并且对常用抗原检测具有一定的互补作用。因此,本发明在联合应用IGRP和ZnT8抗原的基础上,再辅以常用抗原GAD65和IA-2,在显著提高特异性的基础上又进一步提高了敏感性,有望成为1型糖尿病初步筛查的有效诊断试剂,对于1型糖尿病患者的早期诊断和治疗具有重要意义。\n[0019] 发明简述\n[0020] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其包含IGRP和ZnT8抗原。\n[0021] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其包含IGRP和ZnT8抗原与选自GAD65和IA-2的一种或两种抗原的组合。\n[0022] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其包含IGRP和ZnT8抗原,其中IGRP抗原为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或其功能变体,ZnT8抗原为SEQ ID NO:\n2所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。\n[0023] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其包含IGRP和ZnT8抗原与选自GAD65和IA-2的一种或两种抗原的组合,其中IGRP抗原为SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的多肽或其功能变体,ZnT8抗原为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其功能变体,GAD65抗原为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽或其功能变体,IA-2抗原为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。\n[0024] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其中组合物中IGRP和ZnT8抗原单独存在。\n[0025] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其中组合物中IGRP和ZnT8抗原以融合蛋白质的形式存在。\n[0026] 本发明涉及用于免疫诊断1型糖尿病的组合物,其中组合物中IGRP和ZnT8抗原以融合蛋白质的形式存在,IGRP-ZnT8融合抗原为SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。\n[0027] 在本发明的一些优选的实施方案中,组合物中IGRP-ZnT8融合抗原与GAD65和IA-2抗原之一组合存在。\n[0028] 在本发明的最优选的实施方案中,组合物中IGRP-ZnT8融合抗原与GAD65和IA-2二种抗原组合存在。\n[0029] 附图简述\n[0030] 图1.人IGRP抗原肽段的氨基酸序列。\n[0031] 图2.人ZnT8抗原肽段的氨基酸序列。\n[0032] 图3.人GAD65抗原肽段的氨基酸序列。\n[0033] 图4.人IA-2抗原肽段的氨基酸序列。\n[0034] 图5.人IGRP和ZnT8抗原肽段的融合抗原IGRP-ZnT8的氨基酸序列。\n[0035] 发明详述\n[0036] 在1型糖尿病发病前、发病早期或发病后会产生许多自身抗体,直到目前为止,与\n1型糖尿病相关的自身抗体仍然不断被大家所发现。通过大量的研究,人们已经清楚地认识到,要确切地诊断1型糖尿病,仅单一一种自身抗体指标的预测能力是非常有限的,几乎所有对1型糖尿病诊断的研究都是在多个免疫指标的基础上进行的。\n[0037] 本课题组研究人员通过广泛调研,发现IGRP和ZnT8是胰岛β细胞高度特异的抗原,并且通过本发明的工作发现IGRP和ZnT8的某些肽段具有非常好的抗原性。本发明在联合应用胰岛β细胞高度特异抗原IGRP和ZnT8的基础上,再辅以常用抗原GAD65和/或IA-2,能够一次性检测出IGRPA、ZnT8A、GADA和IA-2A四种自身免疫抗体,显著提高了自身免疫性1型糖尿病检测的特异性和敏感性。\n[0038] 本发明通过常规的分子生物学方法钓取自身抗原肽段的编码基因,将其连接入表达载体并表达出该抗原肽段。\n[0039] 通过使用不同的特异抗原组合对于同一组血清样品进行反应性检测,可以找到在血清反应性方面具有更高特异性和敏感性,并且具有互补性的抗原组合。这种特异抗原的组合使得自身免疫性1型糖尿病的血清学检测的特异性和灵敏度进一步显著提高。\n[0040] 应当指出的是,对所选择抗原肽段进行适当的修饰仍然具有检测效果。例如对其中个别氨基酸进行保守替换、增加或缺失,个别氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸,通过此类修饰得到的多肽在本文中称作功能变体。保守氨基酸替换的实例例如Ala、Val、Leu和Ile间的替换;Ser和Thr间的替换;酸性残基Asp和Glu间的替换;Asn和Gln间的替换;和碱性残基Lys和Arg间的替换;或者芳香族残基Phe和Tyr间的替换。\n[0041] 对于不同抗原肽段融合的抗原,本领域众所周知其构建原则和方法。具体而言,为了不影响待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之间添加一个接头。关于接头的选择具体可参见(AraiR等,Protein Enginering,14(5):529-532(2001))。\n[0042] 抗原蛋白质的克隆、表达以及纯化可通过多种方法进行。具体方法参见《分子克隆实验指南》(第三版),科学出版社,2002,第1217-1270页。适宜的原核表达载体如本研究室构建的原核表达载体pBVIL1、pEGX系列原核表达载体(Amersham Pharmacia公司)、pET系列原核表达载体(Novagen公司)、pTrxFus系列原核表达载体(Invitrogen公司)等。\n特别优选本研究室构建的原核表达载体pBVIL1载体。\n[0043] 检测方法可以有多种,例如间接酶联免疫测定技术、双抗原夹心酶免疫测定技术、金标快速检测技术、免疫渗滤检测技术、蛋白芯片检测技术等。优选间接酶联免疫测定(间接ELISA)方法。\n[0044] 本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了用于自身免疫性1型糖尿病检测的组合物,在增加胰岛β细胞高度特异抗原IGRP和ZnT8的基础上,再辅以常用抗原GAD65和/或IA-2,能够一次性检测出IGRPA、ZnT8A、GADA和IA-2A四种自身免疫抗体,显著降低了检测成本,并且显著提高了自身免疫性1型糖尿病检测的特异性和敏感性。\n[0045] 以下结合具体实施例详细说明本发明,但不应构成对本发明实施范围的限定。\n[0046] 实施例\n[0047] 实施例1:IGRP、ZnT8、GAD65和IA-2四种抗原的制备\n[0048] 1.四种抗原肽段基因的克隆\n[0049] 根据抗原肽段的核苷酸序列设计并合成了上下游引物,所使用的限制性内切酶分别为Xho I和Xba I。\n[0050] 用于扩增IGRP抗原的引物序列如下:\n[0051] IGRP-F:5’-GCCTCGAGGATTTCCTTCACAGGAATGGAGTGCTCATAATTCAGCATTTGCA-3’[0052] IGRP-R:5’-GCTCTAGAAAAAGTGTAGTAAGCTCGGTAGTCCTTCTGCAAATGCTGAATTA-3’[0053] 用于扩增ZnT8抗原的引物序列如下:\n[0054] ZnT8-F:5’-GCCTCGAGAAGGACTTCTCCATCCT-3’\n[0055] ZnT8-R:5’-GCTCTAGATTACTAGTCACAGGGGTCTTCACA-3’\n[0056] 用于扩增GAD65抗原的引物序列如下:\n[0057] GAD65-F:5’-GCCTCGAGTGGATGCATGTGGATGCA-3’\n[0058] GAD65-R:5’-GCTCTAGATTAAACGTGGCGTCCGCACTGT-3’\n[0059] 用于扩增IA-2抗原的引物序列如下:\n[0060] IA-2-F:5’-GCCTCGAGGCCCAAGCCAACATGGACATCT-3’\n[0061] IA-2-R:5’-GCTCTAGATCACTGGGGCAGGGCCTTGAGGAT-3’\n[0062] 以人胰岛素瘤组织cDNA文库为模板,分别扩增了ZnT8、GAD65和IA-2抗原的基因片段。IGRP为两条引物互为模板进行扩增。PCR扩增条件如下:预变性95℃ 2分钟,变性\n94℃ 30秒;复性58℃ 30秒;延伸72℃ 30-90秒(随基因长度不同而不同),扩增32个循环,再72℃延伸7分钟。PCR扩增所得的片段通过电泳鉴定,表明均得到相应大小的基因片段。\n[0063] 2.表达载体的构建\n[0064] 将PCR产物用限制性内切酶酶切并连接入经相同限制性内切酶酶切的pBVIL1载体,测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。\n[0065] 3.四种抗原在大肠杆菌DH5α中的表达与纯化\n[0066] 用所得到的重组质粒转化大肠杆菌菌株DH5α,热诱导表达,收集菌体,将沉淀称湿重,用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起,加入溶菌酶(1mg/ml悬液),在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌,每次超30秒钟,间隔30秒钟,共超10次。8℃,1,2000rpm,离心20分钟,弃上清,沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次,再用TE洗2次,收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解,加1%β-巯基乙醇。再于\n20℃ 1,2000rpm离心10分钟,去沉淀取上清。将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱,用平衡液(pH8.0,20mmol/L TE含6mol/L脲,0.1%β-巯基乙醇)清洗后,用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱,收集各洗脱峰,经SDS-PAGE鉴定,收集0.05mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱,收集第一洗脱峰。纯化的抗原进行SDS-PAGE分析,结果表明获得了纯度较高的特异抗原。\n[0067] 实施例2:IGRP-ZnT8融合抗原的制备\n[0068] 1.引物设计\n[0069] 根据两个抗原肽段基因及接头的序列设计了上下游引物,使用的限制性内切酶分别为XbaI和Xho I,所有引物均由上海英俊生物技术公司合成,其序列如下:\n[0070] IGRP-FL:5’-GCCTCGAGGATTTCCTTCACAGGAATGGAGTGCTCATAATTCAGCATTTGCA-3’[0071] IGRP-RL:5’-TCCACCACCACTAGAACCTCCACCAAAAGTGTAGTA-3’\n[0072] ZnT8-FL:5’-GGTGGAGGTTCTAGTGGTGGTGGAAAGGACTTCTCC-3’\n[0073] ZnT8-RL:5’-GCTCTAGATTACTAGTCACAGGGGTCTTCACA-3’\n[0074] 2.载体构建\n[0075] 以实施例1中构建的抗原基因质粒为模板,分别扩增了具有接头基因序列的IGRP和ZnT8抗原的基因片段。然后以具有互补接头的基因片段互为模板进行扩增,将IGRP和ZnT8抗原基因片段连接到一起,构建融合抗原基因。PCR扩增条件如下:预变性95℃ 2分钟,变性94℃ 30秒;复性58℃ 30秒;延伸72℃ 30-90秒(随基因长度不同而不同),扩增32个循环,再72℃延伸7分钟。通过电泳鉴定,表明均得到相应大小的基因片段。将融合抗原基因片段用限制性内切酶酶切并连接入经相同限制性内切酶酶切的pBVIL1载体,测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。\n[0076] 3.抗原制备\n[0077] 见实施例1。\n[0078] 实施例3:间接ELISA方法评价4种单独抗原的抗原性\n[0079] 分别以所选择的IGRP、ZnT8、GAD65和IA-2抗原为抗原,应用间接ELISA方法初步检测了50例健康献血员血清样本,以其OD值的平均值+2SD为cutoff值,计算出IGRP、ZnT8、GAD65和IA-2的cutoff值分别为0.19、0.18、0.17和0.19。然后,再用这四种抗原分别检测了20例自身免疫性1型糖尿病人血清和20例健康献血员血清的1型糖尿病自身免疫抗体,表1中显示了所检测样品的OD值与cutoff值的比值(S/co=样品OD值/cutoff值),比值大于1判定为阳性,比值大于2判定为强阳性,比值小于1判定为阴性。在初步检测中IGRP、ZnT8、GAD65和IA-2四种抗原的敏感性和特异性分别如下:IGRP为80%和95%、ZnT8为65%和100%、GAD65为50%和85%、IA-2为80%和90%。\n[0080] 表1间接ELISA方法检测4种抗原对自身免疫性1型糖尿病人和健康献血员血液样本的反应性(S/co)\n[0081] \n[0082] \n[0083] 我们注意到在这四种抗原中没有任何一种能够检出全部自身免疫性1型糖尿病患者,但IGRP和ZnT8抗原在检测中具有更高的特异性,并且可以弥补GAD65和IA-2联合检测的不足,具有一定的互补性。抗原之间的这种互补性对于自身免疫性1型糖尿病患者的临床诊断是非常重要的。用不同抗原检测同一病人血清,其反应性有所不同,并且各抗原之间存在一定的互补性。这可能是由于不同自身免疫性1型糖尿病患者在不同时期体内的抗体谱不同。因此,联合应用多种抗原进行检测有可能在保证特异性的基础上有助于提高检出率。\n[0084] 实施例4:间接ELISA方法评价IGRP和ZnT8抗原混合组与IGRP-ZnT8融合抗原组在检出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果\n[0085] 如实施例3所述,由于胰岛β细胞特异表达的IGRP和ZnT8抗原具有比其它抗原具有更高的特异性和相当或更高的敏感性,为了以后方便地将两种抗原一起使用,或者与其它抗原组合使用,因此设计实验验证IGRP和ZnT8抗原混合组与IGRP-ZnT8融合抗原组在检出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果。实验结果如表2所示。\n[0086] 表2间接ELISA方法检测IGRP和ZnT8抗原混合组与IGRP-ZnT8融合抗原组对自身免疫性1型糖尿病人和献血员血液样本的反应性(S/co)\n[0087] \n[0088] \n[0089] 由表2可见,胰岛β细胞特异表达的IGRP和ZnT8抗原混合组与IGRP-ZnT8融合抗原组在检出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果没有差异,具有相同的检出率和特异性。因此,在研制用于自身免疫性1型糖尿病诊断的试剂盒时,IGRP和ZnT8抗原可以混合使用,也可以以融合抗原形式使用。但是为了简便操作步骤,优选以融合抗原形式使用。\n[0090] 实施例5:间接ELISA方法评价IGRP-ZnT8融合抗原与其它常用抗原组合使用在检出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果\n[0091] 如实施例3和4所述,由于IGRP-ZnT8融合抗原具有相比其它常用抗原更高的特异性和相当或更高的检出率,因此设计实验验证其与2种常用抗原,即GAD65和IA-2,一种或两种相组合在检出自身免疫性1型糖尿病患者中的效果。实验结果如表3所示。\n[0092] 表3间接ELISA方法检测IGRP-ZnT8融合抗原与其它常用抗原组合对自身免疫性\n1型糖尿病患者和献血员血液样本的反应性(S/co)\n[0093] \n[0094] \n[0095] 由表3可见,胰岛β细胞特异表达的IGRP-ZnT8融合抗原与常用抗原GAD65和IA-2一种或两种相组合在检出自身免疫性1型糖尿病患者方面效果更好,检出率和特异性均明显提高。另外,IGRP-ZnT8融合抗原与常用抗原GAD65和IA-2一种或两种相组合在检出自身免疫性1型糖尿病患者效果方面明显优于常用抗原GAD65和IA-2一种或两种的组合,且4种抗原组合检测效果最优,检出率达到100%,特异性达到95%。这表明胰岛β细胞特异表达的IGRP-ZnT8融合抗原确实与其它常用抗原在检出自身免疫性1型糖尿病患者方面存在互补性。联合应用可以显著提高检出率,并且具有更高的特异性。\n[0096] SEQUENCE LISTING\n[0097] <110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所\n[0098] 上海海泰金芯生物分子检测技术有限公司\n[0099] <120>用于免疫诊断1型糖尿病的组合物\n[0100] <160>5\n[0101] <170>PatentIn version 3.3\n[0102] <210>1\n[0103] <211>25\n[0104] <212>PRT\n[0105] <213>人(Homo sapiens)\n[0106] <400>1\n[0107] Met Asp Phe Leu His Arg Asn Gly Val Leu Ile Ile Gln His Leu Gln[0108] 1 5 10 15\n[0109] Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr Tyr Thr Phe\n[0110] 20 25\n[0111] <210>2\n[0112] <211>102\n[0113] <212>PRT\n[0114] <213>人\n[0115] <400>2\n[0116] Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn[0117] 1 5 10 15\n[0118] Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser[0119] 20 25 30\n[0120] Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu[0121] 35 40 45\n[0122] Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg[0123] 50 55 60\n[0124] Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu[0125] 65 70 75 80[0126] Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe[0127] 85 90 95\n[0128] Cys Glu Asp Pro Cys Asp\n[0129] 100\n[0130] <210>3\n[0131] <211>91\n[0132] <212>PRT\n[0133] <213>人\n[0134] <400>3\n[0135] Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg[0136] 1 5 10 15\n[0137] Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr[0138] 20 25 30\n[0139] Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu[0140] 35 40 45\n[0141] Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln Asn Cys Asn Gln Met His Ala[0142] 50 55 60\n[0143] Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr[0144] 65 70 75 80[0145] Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg His Val\n[0146] 85 90\n[0147] <210>4\n[0148] <211>297\n[0149] <212>PRT\n[0150] <213>人\n[0151] <400>4\n[0152] Ala Gln Ala Asn Met Asp Ile Ser Thr Gly His Met Ile Leu Ala Tyr[0153] 1 5 10 15\n[0154] Met Glu Asp His Leu Arg Asn Arg Asp Arg Leu Ala Lys Glu Trp Gln[0155] 20 25 30\n[0156] Ala Leu Cys Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn Thr Cys Ala Thr Ala Gln[0157] 35 40 45\n[0158] Gly Glu Gly Asn Ile Lys Lys Asn Arg His Pro Asp Phe Leu Pro Tyr[0159] 50 55 60\n[0160] Asp His Ala Arg Ile Lys Leu Lys Val Glu Ser Ser Pro Ser Arg Ser[0161] 65 70 75 80[0162] Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Pro Ile Ile Glu His Asp Pro Arg Met Pro[0163] 85 90 95\n[0164] Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ser His Thr Ile Ala Asp Phe[0165] 100 105 110\n[0166] Trp Gln Met Val Trp Glu Ser Gly Cys Thr Val Ile Val Met Leu Thr[0167] 115 120 125\n[0168] Pro Leu Val Glu Asp Gly Val Lys Gln Cys Asp Arg Tyr Trp Pro Asp[0169] 130 135 140\n[0170] Glu Gly Ala Ser Leu Tyr His Val Tyr Glu Val Asn Leu Val Ser Glu[0171] 145 150 155 160[0172] His Ile Trp Cys Glu Asp Phe Leu Val Arg Ser Phe Tyr Leu Lys Asn[0173] 165 170 175\n[0174] Val Gln Thr Gln Glu Thr Arg Thr Leu Thr Gln Phe His Phe Leu Ser[0175] 180 185 190\n[0176] Trp Pro Ala Glu Gly Thr Pro Ala Ser Thr Arg Pro Leu Leu Asp Phe[0177] 195 200 205\n[0178] Arg Arg Lys Val Asn Lys Cys Tyr Arg Gly Arg Ser Cys Pro Ile Ile[0179] 210 215 220\n[0180] Val His Cys Ser Asp Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Leu Ile[0181] 225 230 235 240[0182] Asp Met Val Leu Asn Arg Met Ala Lys Gly Val Lys Glu Ile Asp Ile[0183] 245 250 255\n[0184] Ala Ala Thr Leu Glu His Val Arg Asp Gln Arg Pro Gly Leu Val Arg[0185] 260 265 270\n[0186] Ser Lys Asp Gln Phe Glu Phe Ala Leu Thr Ala Val Ala Glu Glu Val[0187] 275 280 285\n[0188] Asn Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro Gln\n[0189] 290 295\n[0190] <210>5\n[0191] <211>135\n[0192] <212>PRT\n[0193] <213>人\n[0194] <400>5\n[0195] Met Asp Phe Leu His Arg Asn Gly Val Leu Ile Ile Gln His Leu Gln[0196] 1 5 10 15\n[0197] Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly[0198] 20 25 30\n[0199] Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu[0200] 35 40 45\n[0201] Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu[0202] 50 55 60\n[0203] Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile[0204] 65 70 75 80[0205] Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val[0206] 85 90 95\n[0207] Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser[0208] 100 105 110\n[0209] Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu[0210] 115 120 125\n[0211] Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp\n[0212] 130 135
法律信息
- 2021-02-23
未缴年费专利权终止
IPC(主分类): G01N 33/66
专利号: ZL 200910119996.7
申请日: 2009.03.03
授权公告日: 2013.01.23
- 2013-01-23
- 2010-10-27
实质审查的生效
IPC(主分类): G01N 33/66
专利申请号: 200910119996.7
申请日: 2009.03.03
- 2010-09-08
引用专利(该专利引用了哪些专利)
序号 | 公开(公告)号 | 公开(公告)日 | 申请日 | 专利名称 | 申请人 | 该专利没有引用任何外部专利数据! |
被引用专利(该专利被哪些专利引用)
序号 | 公开(公告)号 | 公开(公告)日 | 申请日 | 专利名称 | 申请人 | 该专利没有被任何外部专利所引用! |