抗人血管内皮生长因子单链抗体及其制备方法

1．一种抗人血管内皮生长因子单链抗体，其特征在于：1．1抗人血管内皮生长因子(VEGF)单链抗体(ScFv)的基因及氨基酸序列为：GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln ArgCDR1180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52a             CDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3           100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerLinker60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Mer His Trp Asn27a 27b 27c 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys1．2 抗人血管内皮生长因子单链抗体含249个氨基酸，分子量为26648.1道尔顿，等电点为5.90，1．3 上述抗人血管内皮生长因子单链抗体由三部分组成，即抗体可变区轻、重链和连结肽，该三部分共同完成识别和结合抗原(VEGF)，发挥阻断VEGF生物活性的作用，其三维结构图见图1，
2．一种获得权利要求1所述的抗人血管内皮生长因子单链抗体的制备方法：其特征在于：2．1 人VEGF189合成肽的设计和制备：将现有技术蛋白质二级结构预测方案、亲水方案及抗原指数方案相结合，设计了以人VEGF189N端26个氨基酸残基为模板的一段多肽，根据前三项综合判断，并采用固相化学合成法在ABI431固相自动合成仪(Applied-Biosystems PE公司，美国)上合成，纯度为97.4％，人VEGF189氨基酸序列为：APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR2．2 抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株的建立及抗人VEGF合成肽MAb的制备：采用2.1所制备的合成肽作为抗原，按常规方法建立了抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株(定名为E11)。将E11杂交瘤细胞株进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，12天后吸取腹水，而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗人VEGFMAb，并采用超滤膜透析方式进行浓缩，经测定，抗人VEGF MAb含量为2.4mg/ml，属IgG2b(γ,κ2b)，此MAb具备良好的抗原特异性和较高的抗原亲和力，并能有效地抑制人颊癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血管生成和肿瘤生长，2．3 抗人VEGF单链抗体(ScFv)的构建、表达及活性鉴定：在2．1和2．2的基础上，对前述的生长良好，能持续、稳定分泌抗人VEGF MAb的杂交瘤细胞株E11(体外培养半年)提取总RNA，分别针对VL和VH基因设计两条和五条引物，而后进行PCR扩增，克隆了MAb的可变区基因片段，用编码亲水性多肽接头的DNA片段((GGGGS)3)将E11单克隆抗体轻、重链可变区基因连接，转导入PET-15YV(Novagen公司)载体，而后导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，进而针对以包涵体(IBS)形式表达的抗人VEGF ScFv表达系统[PET-15YV /BL21(DE3)]、包涵体的分离、变性与复性等制备环节进行生产工艺改进，获得了占菌体总蛋白表达量52.9％的包涵体高效表达和48mg/ml的高产率，抗人VEGF单克隆抗体重链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列如下：60GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln ArgCDR1180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52a             CDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3           100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCAVal Ser Ser抗人VEGF单克隆抗体轻链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列如下：60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn27a 27b 27c 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
3．根据权利要求1所述一种抗人血管内皮生长因子单链抗体，其特征在于：该单链抗体可作为放射免疫治疗及放射自显影成像的载体。
4．根据权利要求1所述一种抗人血管内皮生长因子单链抗体，其特征在于：该单链抗体可做为模板，根据其核苷酸序列及氨基酸一级结构和三维空间构型进行改建(包括人源化方案)，成为肿瘤免疫治疗及放射免疫治疗的抗体物质。

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