一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用

1.一种免疫球蛋白IgG，其特征在于，它能够特异性地结合人VEGF，是单克隆抗体，它具有的重链可变区具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，该分子含有SEQ ID NO：1所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：2所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的免疫球蛋白。
4.一种检测VEGF的免疫学检测试剂，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白。

一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及抗体工程和医学领域。更具体地，本发明涉及获得识别人血管内皮生长因子(hVEGF)表位的鼠单克隆抗体。\n背景技术\n[0002] 癌症是影响人类健康的重大疾病，死亡率高。1971年Folkman首先观察到当肿瘤\n3\n体积超过1～2mm，需要形成新血管才能继续生长，从而提出通过调控血管生成控制肿瘤生长的假说。目前研究表明通过阻断肿瘤血管生成生长因子信号传导通路能够抑制实体肿瘤发展过程的新血管生成，可以特异地干预肿瘤发展进程。新血管生成的过程需要多种刺激因子参与，其中包括血管内皮生长因子VEGF(vascular endothelia growth factor)。\nGenentech公司生产针对VEGF的人源化单抗阿瓦斯汀(Bevacizumab，Avastin)是重组的人源化单克隆抗体，于2004年2月26日获得FDA的批准，是第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物。\n[0003] Bevacizumab已被批准用于一线治疗转移性结直肠癌，与某些化疗方案联合治疗晚期非小细胞肺癌以及乳腺癌。\n[0004] 血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成重要调节因子，在胚胎发育及出生后的血管发程中均起着极为重要的调节作用，主要参与新生血管的形成VEGF有至少五种不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206个氨基酸等，其中VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受体包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与内皮细胞膜上内皮生长因子受体(VGFR)结合后，使VEGFR二聚体化，受体酪氨酸激酶活性被激活，由受体自身磷酸化后启动下游信号通路如PKC信号通路。VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。高表达的VEGF除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长，还能够提高血管的通透性、增加血浆蛋白溶酶激活物(PA)及血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达，促进肿瘤的侵袭、转移。\n[0005] 由于VEGF和其受体的多样性，不同抗原表位或者亲和力不同的VEGF抗体对肿瘤生长抑制的效果可能是不同的。VEGF抗体药物的升级需要获得和研究针对VEGF不同表位的CDR。不同的CDR序列免疫原性是不同的，通过CDR移植制备的人源化抗体被机体的耐受速度及产生的毒性是有差异的，直接影响药物的疗效。抗体的疗效还受抗体血浆半衰期和血管穿透能力等因素的影响。因此研究不同VEGF抗体将有助于获得疗效更好的治疗性人源化抗体。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的提供一种特异性抗人血管内皮生长因子(hVEGF)的单克隆抗体，能够特异识别人VEGF。\n[0007] 本发明提供了一种针对hVEGF的免疫球蛋白，其特征在于，它特异性地结合于人血管内皮生长因子(hVEGF)。\n[0008] 所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白是鼠单克隆抗体IgG。\n[0009] 所述的鼠单克隆抗体，其特征在于，所述的鼠单克隆抗体产生的杂交瘤细胞株，它是小鼠杂交瘤细胞系18-5。\n[0010] 本发明提供了一种抗人VEGF单克隆抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。\n[0011] 本发明还提供了一种分离的核苷酸，编码抗人VEGF单克隆抗体重链可变区(SEQ ID NO：1)核苷酸序列具有表1所示的碱基序列，氨基酸序列具有SEQ ID NO：3所示序列。\n编码抗人VEGF单克隆抗体轻链可变区(SEQ ID NO：2)核苷酸序列具有表2所示的碱基序列，氨基酸序列具有SEQ ID NO：4所示序列。\n[0012] 本发明还提供了抗人VEGF单克隆抗体在免疫学检测中的用途。\n附图说明\n[0013] 图1：鼠单克隆抗体18-5用于Western-blot检测VEGF。L1：阴性对照，L2：\npLenti7.3/V5-VEGF165转染细胞裂解物，L3：pLenti7.3/V5-VEGF165转染细胞培养上清[0014] 图2：鼠单克隆抗体18-5用于VEGF的免疫荧光检测。A：转染pLenti7.3/V5-TOPO空载体EGFP荧光，B：转染pLenti7.3/V5-TOPO空载体对照，C：转染\n[0015] pLenti7.3/V5-VEGF165EGFP荧光，D：转染pLenti7.3/V5-VEGF165(CY3标记二抗)[0016] 实施方式\n[0017] 具体实施例1 小鼠单克隆抗体的制备和筛选\n[0018] (1)抗原的制备\n[0019] 将人血管内皮生长因子VEGF165(Human Vascular endothelial growth factor，hVEGF165)基因通过PCR从人基因转录组中扩增获得，上游引物为：5’-CGCGGATCCGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3’；下游引物为：5’-CTCCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。利用BamH I和Xho I双酶切，将基因片段连入原核表达载体pET32a(+)，PCR和双酶切鉴定阳性克隆后测序，序列测定正确后，提取质粒。原核表达载体pET32a-VEGF165转化Rosetta菌株，在\n100mlLB培养基中，OD600达到约0.5时，1mM IPTG诱导表达4h，VEGF165蛋白形成包涵体。超声破菌后，用1×SDS上样缓冲液溶解包涵体，测定靶蛋白的表达量。将制备好的VEGF165蛋白进行SDS-PAGE电泳，割胶纯化蛋白。\n[0020] (2)小鼠的免疫\n[0021] 将纯化后的VEGF165蛋白溶解在1×PBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋白溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。\n[0022] (3)细胞融合和阳性克隆的筛选\n[0023] 引颈处死小鼠，用70％酒精消毒其体表。无菌条件下取出脾脏，在灭菌不锈钢网中，用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次获得细胞悬液，将细胞悬液注入50ml离心管中，加入20ml无血清培养液，轻轻吹打数次，1000rpm/min离心。用无血清培养液将细胞重悬，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以适当比例轻轻混匀，在37℃水浴锅中加入PEG1400，水浴1.5min。加入无血清培养液35ml，离心。沉淀用含有20％FCS的RPM1-1640重悬，每孔200μl均分到96孔细胞培养板，放入37℃5％CO2培养箱中培养。24h后，加入选择培养液HAT，每3天换一次新鲜培养液。\n[0024] 14天后，取细胞培养上清，ELISA鉴定出阳性克隆。多次进行亚克隆鉴定阳性克隆细胞成系，继续体外培养6个月。选出5株高效表达细胞株，分别命名为18-1，18-2，18-3，\n18-4，18-5。\n[0025] (4)单克隆抗体的鉴定\n[0026] 血清1∶1000-1∶50000稀释，100ngVEGF165蛋白上样，进行Western Blot分析抗体的特异性。将VEGF165基因通过TOPO克隆方法连入表达载体pLenti7.3/V5-TOPO，真核表达载体pLenti7.3/V5-VEGF165利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)介导瞬时转染\n293T细胞，血清1∶100稀释，进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知，18-5细胞株的抗体特异性最好，且能识别细胞内源表达的抗原。\n[0027] (4)单克隆抗体可变区序列的获得\n[0028] 利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株18-5的总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA。根据小鼠抗体重链和轻链的FR1区氨基酸序列，合成兼并的寡核苷酸引物，用作正向引物。反向引物根据小鼠抗体的恒定区设计，可将全部的可变区扩增得到。PCR反应完成后，分别将抗体重链和轻链的DNA片段连于TA克隆载体，挑取克隆进行测序。\n[0029] 具体实施例2 小鼠单克隆抗体的Western-blot和免疫荧光检测\n[0030] 将VEGF165基因通过TOPO克隆方法连入表达载体pLenti7.3/V5-TOPO，真核表达载体pLenti7.3/V5-VEGF165利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)介导瞬时转染293T细胞，血清1∶100稀释，进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知，18-5细胞株的抗体特异性最好，且能识别细胞内源表达的抗原。取培养细胞或细胞上清，加入3×Loading buffer煮沸5分钟上样，western-blot检测。结果显示阳性蛋白条带的分子量与VEGF165一致。\n[0031] 序列表\n[0032] <110>中国科学院北京基因组研究所\n[0033] <120>一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用\n[0034] <140>201110007354.5\n[0035] <141>2011-05-11\n[0036] <160>4\n[0037] <170>PatentIn version 3.5\n[0038] <210>1\n[0039] <211>336\n[0040] <212>DNA\n[0041] <213>Mus musculus\n[0042] <220>\n[0043] <221>v region\n[0044] <222>(1)..(336)\n[0045] <400>1\n[0046] gaggttaagc tggaggagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60[0047] ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaacg tggcctgggt gaaacagagc 120[0048] catggaaaga gccttgagtt gattggagat attgatccta acaatggtaa tactatctac 180[0049] aaccagaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaaa agtcctccag cacagcctac 240[0050] atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagaggtgcc 300[0051] cactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca 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