一种防治老年性痴呆的药物组合物

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一种防治老年性痴呆的药物组合物\n发明领域\n[0001] 本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种防治老年性痴呆的经物组合物及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着世界人口老龄化的加剧，其发病率越来越高，对人类生活质量的影响乃至生存的威胁也日趋明显。\n[0003] 对于AD这类多因素疾病，单一靶点治疗难以取得满意效果，在对AD的病因及发病机理知之甚少、近期无法取得突破性进展的情况下，虽然对AD病因等问题存在争议，但就其治疗已达成共识：应及早干预病情发展，如果在疾病后期才进行干预，虽可能延缓认知能力衰退的进程，但是已经发生的损害则不可逆转。当前治疗老年认知障碍的方法主要是通过暂时改善和减慢认知功能的衰退速度而减轻病人的症状，因此，在认知障碍阶段及对病人进行积极干预是预防痴呆发生的最好策略。但由于人们认为老年人好忘事属于正常，导致90％以上的老年认知障碍患者在早期未能被发现，而错过了最佳治疗和干预时机，因此现有的药物及治疗方法不能满足人们的需求，临床对能够有效改善脑认知功能障碍、防治老年性痴呆的药物的需求也愈发迫切。\n发明内容\n[0004] 本发明目的在于提供一种药物组合物；本发明另一目的在于提供一种防治老年性痴呆的药物组合物；本发明的第三个目的在于提供该药物组合物的制备方法。\n[0005] 本发明目的是通过如下技术方案实现的：\n[0006] 一种防治老年性痴呆的药物组合物，其原料药组成为：银杏叶∶姜黄∶远志＝\n1-10∶1-10∶1-10。\n[0007] 优选银杏叶∶姜黄∶远志＝1∶2∶3。\n[0008] 优选银杏叶∶姜黄∶远志＝1∶1∶9。\n[0009] 优选银杏叶∶姜黄∶远志＝10∶1∶1。\n[0010] 优选银杏叶∶姜黄∶远志＝9∶8∶1。\n[0011] 优选银杏叶∶姜黄∶远志＝1∶8∶9\n[0012] 本发明药物组合物的原料药组成也可以为：姜黄∶远志＝1-10∶1-10，优选姜黄∶远志＝2∶3、8∶1或1∶1。\n[0013] 本发明药物组合物的原料药组成也可以为：姜黄∶银杏叶＝1-10∶1-10，优选姜黄∶远志＝1∶9、8∶1或1∶1。\n[0014] 本发明药物组合物的原料药组成也可以为：银杏叶∶远志＝1-10∶1-10，优选姜黄∶远志＝1∶9、8∶1或1∶1。\n[0015] 本发明所述的原料药中，银杏叶可由银杏叶提取物替代、姜黄可由姜黄提取物姜黄素替代、或远志可由远志提取物远志皂苷替代；其中银杏叶提取物、姜黄素、远志皂苷的投药量分别以相当生药量计，以使本发明药物组合物的原料药组成的配比保持不变。例如当原料药中姜黄取10g，银杏叶取2g，远志取20g，即银杏叶∶姜黄∶远志为1∶5∶10时，由姜黄素来替代姜黄时，如果所选姜黄素2g即相当姜黄生药量10g，则姜黄素的投药量应当为2g，以保持银杏叶∶姜黄∶远志的配比为1∶5∶10，如果所选姜黄素5g才相当姜黄生药量10g，则姜黄素的投药量应当为5g，以保持银杏叶∶姜黄∶远志的配比为\n1∶5∶10。\n[0016] 本发明药物组合物原料药或原料药的提取物，加入一定辅料，按照一定工艺，制备成临床接受的剂型，包括但不限于胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射剂。\n[0017] 本发明药物组合物的固体剂型制备方法可以为：按比例取原料药，加60-80％乙醇制成软材，制粒，干燥，再分别制成胶囊剂、片剂或颗粒剂等。\n[0018] 本发明药物组合物的口服剂型制备方法可以为：按比例取原料药的提取物，混合，加入处方量的水，搅拌均匀后用5-15％NaOH调pH值为7.0-7.5，加0.2-0.8％活性炭，煮沸\n10-30分钟，滤过，滤液微孔滤膜精滤，滤液分装到口服液瓶中，100-130℃、20-40分钟热压灭菌，即得。\n[0019] 本发明药物组合物的注射液制备方法可以为：取银杏、姜黄、远志提取物，混合，加入处方量体积份的注射用水，搅拌均匀后用5-15％NaOH调pH值为7.0-7.5，加0.2-0.8％活性炭，煮沸20-40分钟，滤过，2-6℃静置2-4天以上，微孔滤膜精滤，超滤，滤液分装入输液瓶中，100-130℃、20-40分钟热压灭菌，即得。\n[0020] 本发明所述的姜黄素由常规方法制成，或由如下方法制备：取姜黄饮片，粉碎成粗颗粒；加8-12倍体积的70％乙醇，以2-4mL/min速度渗漉；收集渗漉液，回收乙醇，残留物加6-10倍水溶解，滤过，滤液调pH为6-8，通过大孔吸附树脂吸附，水洗至澄清，用70-90％乙醇以1-2BV/h速度依次洗脱，减压回收乙醇，浓缩干燥，即得。\n[0021] 本发明所述的银杏叶提取物由常规方法制成，或由如下方法制备：用60-80％乙醇回流提取1-3次，合并提取液加入一定量的1-3％的甲壳素絮凝剂，静置12小时以上，离心除去沉淀，上清液通过DM130大孔吸附树脂柱吸附，水洗至澄清，40-60％乙醇洗脱，收集\n40-60％乙醇洗脱液，浓缩干燥。\n[0022] 本发明所述的远志总皂苷由常规方法制成，或由如下方法制备：加8-12倍量\n75-95％乙醇回流提取2-4次，每次1-3小时，得远志总皂苷乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，加10-20倍水溶解，通过大孔吸附树脂吸附，3BV以0.5-1.5BV/h速度依次洗脱，水洗至澄清，先用20-40％乙醇洗脱，再用60-80％乙醇洗脱，收集60-80％乙醇洗脱物，回收乙醇，浓缩干燥，即得。\n[0023] 本发明所述重量份/体积份的关系为0.3g/ml。\n[0024] 本发明所述的药物组合物用于制备防治老年性痴呆的药物。\n[0025] 本发明药物组合物具有通神开窍、益心清脑、活血化瘀、调理阴阳、防老抗衰之功效，能改善提高学习记忆能力，改善脑认知功能障碍，从而有效防治老年性痴呆症。经临床实验证明，本发明药物组合物可具有明显的神经和突触保护作用，表现在增加神经元数量、改善受到损伤的神经元和突触形态、增强神经元活性、改善突触可塑性；本发明药物组合物可明显改善Aβ所致的神经元结构和活性改变，表现在增加细胞数目和胞体面积，减少了LDH的漏出、提高了MTT代谢率，同时本发明药物组合物不仅增强线粒体功能，还能对抗Aβ的神经细胞膜毒性效应，恢复神经细胞脂质双层膜的正常流动性。\n[0026] 附图说明：\n[0027] 附图1不同治疗组对于快速老化鼠脑内p-CREB、AKT、CREB蛋白的影响[0028] 下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。\n[0029] 实验例1提高认知功能障碍快速脑老化鼠学习记忆能力的实验研究[0030] 1.材料与方法\n[0031] 1.1研究对象\n[0032] 健康的SAMR18月龄老化鼠10只，雌雄各半，SAMP 8老化鼠80只，随即分为模型组(SHAMP 8)；姜黄(A)；银杏叶(B)；远志(C)；姜黄+银杏叶(D)；姜黄+远志(E)；银杏叶+远志(F)；姜黄+银杏叶+远志(G)治疗组。动物由天津中医学院第一附属医院动物-1 -1\n中心提供。给药方式及途径：给药剂量分别为体重姜黄N.mg·kg ，银杏叶2N.mg·kg ，远-1\n志3N.mg·kg ；姜黄+银杏叶(D)、姜黄+远志(E)、银杏叶+远志(F)治疗组分别为取单一组分治疗组药物的二分之一调配成与单一组分治疗组等体积的口服液给药，姜黄+银杏叶+远志(G)为取各药单独给药剂量的1/3调配成与单一组分治疗组等体积的口服液给药，模型组与假手术组除口服等量的生理盐水外，其他处理与各组相同。\n[0033] 1.2行为学测试\n[0034] 1.2.1Morris水迷宫(Morris water maze)的组成\n[0035] 水迷宫由圆形水池、平台和记录系统三部分组成。水池直径90cm，高50cm，随意将水池分为四个象限(东北、东南、西南和西北象限)。每天实验开始，水池注水30cm深，并加入1斤奶粉，使水成不透明乳白色，水温保持在24℃±1℃左右。水池四周存在丰富的空间参照物(门、灯、桌椅、摄像头及实验者等)，且位置保持不变，以供小鼠定位平台。圆柱形平台直径9cm，高28cm，置于任一象限中央，平面没于水面下2cm。一摄像头置于水池中央的上方约2m处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统(中国医学科学院药物研究所提供)自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、不同象限的停留时间、初始角度及游泳路线的长度、搜索策略及中、外环游泳距离百分比等参数。\n[0036] 1.2.2实验内容\n[0037] (1)动物入选：用跳台实验筛选学习记忆功能障碍小鼠入选实验，以保证实验的可靠性。\n[0038] (2).隐蔽平台试验(Hidden Platform Trial)\n[0039] 试验前1d，让动物在不含平台的水池中自由游泳90s，上午、下午各一次，使其熟悉迷宫环境。试验时平台位置固定不变，置于东北象限中央，平台中点离池壁22.5cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)，然后让小鼠在平台上停留10s。如果90s内找不到平台，潜伏期记为90s，并将小鼠置于平台上休息10s。每天在2个入水点各训练1次，以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。\n[0040] (3).反向试验(Reversal Trial)\n[0041] 操作基本同隐蔽平台试验，只是将平台位置移至对面象限(西南象限的中央，平台中点离池壁22.5cm)。\n[0042] (4).可视平台试验(Visible Platform Trial)\n[0043] 为排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响，最后1d进行可视平台试验。让平台位置露出水面2cm，并帖上黄色胶带，其余操作同隐蔽平台试验。\n[0044] \n[0045] (5).试验设计\n[0046] 所有实验小鼠均进行隐蔽平台试验5d，反向试验3d及可视平台试验1d，以评价不同治疗组学习记忆能力的变化。\n[0047] (6).数据处理\n[0048] 所有数据用均数±标准差 表示，并用SPSS10.0统计软件处理。隐蔽平台试验及反向试验中所获得的数据采用重复测量数据的双因素方差分析(two-way ANOVA withrepeated measures)，以组别作为组间因素，不同的训练天数作为组内因素。在探索试验及可视平台试验中样本间比较用单因素方差分析(one-way ANOVE)。检验水准定为P＜0.05为差异有显著性。\n[0049] 2.结果\n[0050] 表1实验结果\n[0051] 与SAMp8比较*P＜0.05**P＜0.01\n[0052] 由上表1可以看出：隐蔽平台实验和反向实验证实模型组与正常组老化鼠在学习记忆能力上有显著差别，并且有统计学意义，说明模型极为成功。隐蔽平台实验表明，经过治疗后，全方治疗组(G)、F治疗组、E治疗组、C治疗组、D治疗组在训练第三天学习成绩稳步提高，与模型组比较有显著性差异。反向实验数据表明，经过治疗后，全方治疗组(G)、E治疗组、D治疗组在记忆能力明显提高，与模型组比较有显著性差异。可视平台试验表明，同月龄SAMP8和SAMR1以及各治疗组逃避潜伏期的比较均无显著性差异。提示动物在感觉、视觉或运动功能方面的差异未对其空间学习记忆产生明显的影响。从而说明，全方治疗组(G)、F治疗组、E治疗组、C治疗组、D治疗组药物有提高老化鼠学习记忆的能力，从而改善其认知功能障碍，有效预防痴呆。\n[0053] 实验例2观察药物对Aβ25-35损伤细胞模型中细胞计数的影响实验[0054] 1、研究对象\n[0055] 健康的SAMR18月龄老化鼠10只，雌雄各半，SAMP 8老化鼠80只，随即分为模型组(SHAMP 8)；姜黄(A)；银杏叶(B)；远志(C)；姜黄+银杏叶(D)；姜黄+远志(E)；银杏叶+远志(F)；姜黄+银杏叶+远志(G)治疗组。动物由天津中医学院第一附属医院动物-1 -1\n中心提供。给药方式及途径：给药剂量分别为体重姜黄N.mg·kg ，银杏叶2N.mg·kg ，远-1\n志3N.mg·kg ；姜黄+银杏叶(D)、姜黄+远志(E)、银杏叶+远志(F)治疗组分别为取单一组分治疗组药物的二分之一调配成与单一组分治疗组等体积的口服液给药，姜黄+银杏叶+远志(G)为取各药单独给药剂量的1/3调配成与单一组分治疗组等体积的口服液给药，模型组与假手术组除口服等量的生理盐水外，其他处理与各组相同。\n[0056] 2、细胞模型的制备\n[0057] 将SY5Y细胞按照1×104的浓度接种，增殖至40～50％时置换为无血清培养基，-1\n加入25umol·L 浓度的Aβ。37℃、5％CO2温箱孵育24小时。\n[0058] 3、细胞模型的评价\n[0059] 3.1形态学观察\n[0060] 将SY5Y细胞按照1×104的浓度接种于35mm培养皿，增殖至40～50％时置换为无-1\n血清培养基，分为对照组和模型组。模型组加入Aβ25umol·L ，对照组加入等体积的MEM。\n37℃、5％CO2温箱孵育24小时。而后吸净培养液，PBS洗3遍，进行瑞氏染色，每组随机取\n60个细胞，用HPIAS-1000高清晰度彩色图文报告分析系统及医学影象计算机处理系统测量细胞突起长度和胞体面积(以像素总点数表示)。\n[0061] 3.2细胞计数\n[0062] SH-SY5Y细胞按1×104密度接种到96孔板。培养至孔板的70-80％时，置换为无-1 -1\n血清培养基，分为空白对照组、Aβ25umol·L 组，每组12孔。模型组加入Aβ25umol·L ，对照组加入等体积的MEM。37℃、5％CO2温箱孵育24小时后，弃去培养液，0.4％台盼兰染色，细胞混悬液滴入计数板，计数周边4个大格内细胞数，压边者计左不计右，计上不计下。\n4\n细胞数/m1＝(计数/4)×10\n[0063] 4、药物组合物对Aβ25-35损伤细胞模型细胞计数的影响\n[0064] SH-SY5Y细胞按1×104密度接种到96孔板。培养至孔板的70-80％时，置换为无-1\n血清培养基，分为对照组、Aβ25umol·L 组、Aβ加A治疗组、Aβ加B治疗组、Aβ加C治疗组、Aβ加D治疗组、Aβ加E治疗组、Aβ加F治疗组、Aβ加G治疗组。，每组10孔。\n[0065] 5、各组的细胞数目变化结果\n[0066] 表2对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞数目的影响\n[0067] \n组 N CellCounting(×104/ml)\n对照组 10 4.567±1.14**\n模型组 10 2.937±1.23\nA 10 3.067±0.84\nB 10 3.425±0.72\nC 10 4.121±1.26*\nD 10 4.107±1.24*\nE 10 4.208±1.35*\nF 10 4.104±1.213*\nG 10 4.508±1.598**\n[0068] 注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。\n[0069] 经统计学处理，Aβ25-35损伤的模型组与正常对照组比较，其细胞数目具有显著差异(P＜0.05＝，A、B治疗组均有提高细胞数目的趋势，但没有统计学意义。治疗组C、D、E、F治疗组较模型组的细胞数目明显增多(P＜0.05＝，治疗组G较模型组的细胞数目增多显著，二者之间显著性差异(P＜0.01＝(见表2)。\n[0070] 实验例3观察药物对Aβ25-35损伤细胞模型中细胞形态的影响实验[0071] 研究对象、细胞模型的制备同实验例2\n[0072] 将SY5Y细胞按照1×104的浓度接种于35mm培养皿，增殖至40～50％时置换为无-1\n血清培养基，分为对照组和模型组。模型组加入Aβ25umol·L ，对照组加入等体积的MEM。\n37℃、5％CO2温箱孵育24小时。而后吸净培养液，PBS洗3遍，进行瑞氏染色，每组随机取\n60个细胞，用HPIAS-1000高清晰度彩色图文报告分析系统及医学影象计算机处理系统测量细胞突起长度和胞体面积(以像素总点数表示)。\n[0073] 将SY5Y细胞按照1×104接种于70mm培养皿，增殖至40～50％时置换为无血清-1\n培养基，分为对照组、Aβ25umol·L 组、Aβ加A治疗组、Aβ加B治疗组、Aβ加C治疗组、Aβ加D治疗组、Aβ加E治疗组、Aβ加F治疗组、Aβ加G治疗组。给药浓度分别为姜黄N.mg·ml，银杏叶2N.mg·ml远志3N.mg·ml；姜黄+银杏叶(D)、姜黄+远志(E)、银杏叶+远志(F)治疗组分别为取单一组分治疗组药物的二分之一调配成与单一组分治疗组等体积的浓度，姜黄+银杏叶+远志(G)为取各药单独给药剂量的1/3调配成与单一组分治疗组等体积的浓度。\n[0074] 结果：\n[0075] 表3对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞突起长度和胞体面积的影响\n[0076] \n[0077] \n[0078] 注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；计量单位以像素总点数表示。\n[0079] 经统计学处理，Aβ25-35损伤的模型组与正常对照组比较，其细胞突起长度和胞体面积具有显著差异(P＜0.05＝，B治疗组有提高细胞突起长度和胞体面积的趋势，但没有统计学意义。治疗组A、C、D、较模型组的细胞突起长度和胞体面积明显增多(P＜0.05＝，治疗组E、F、G较模型组的细胞突起长度和胞体面积增多显著，二者之间显著性差异(P＜0.01＝(见表3)。\n[0080] 实验例4药物组合物对Aβ25-35损伤细胞模型MTT代谢率测定的影响[0081] 研究对象、细胞模型的制备同实验例2。\n4\n[0082] SH-SY5Y细胞按1×10 密度接种到96孔板。培养至孔板的70-80％时，置换为无-1 -1\n血清培养基，分为对照组和Aβ25umol·L 组。模型组加入Aβ25umol·L ，对照组加入等体积的MEM。37℃、5％CO2温箱孵育24小时后，按MTT还原法步骤进行操作。\n[0083] 结果：\n[0084] 表4对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞MTT值的影响\n[0085] \n[0086] 注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。\n[0087] 经统计学处理，Aβ25-35损伤的模型组与正常对照组比较，其MTT的OD值具有显著差异(P＜0.01＝，A、B、D治疗组有提高MTT的OD值的趋势，但没有统计学意义。治疗组C较模型组的MTT的OD值明显增多(P＜0.05＝，治疗组E、F、G较模型组的MTT的OD值增多显著，二者之间显著性差异(P＜0.01＝(见表4)。\n[0088] 实验例5观察药物对Aβ25-35损伤细胞模型中LDH漏出率测定的影响实验[0089] 研究对象、细胞模型的制备同实验例2\n[0090] SH-SY5Y细胞按1×104密度接种到96孔板。培养至孔板的70-80％时，置换为无-1\n血清培养基，分为对照组、Aβ25umol·L 组、Aβ加A治疗组、Aβ加B治疗组、Aβ加C治疗组、Aβ加D治疗组、Aβ加E治疗组、Aβ加F治疗组、Aβ加G治疗组。每组10孔。\n[0091] SH-SY5Y细胞按1×104密度接种到96孔板。培养至孔板的70-80％时，置换为无-1 -1\n血清培养基，分为对照组和Aβ25umol·L 组。模型组加入Aβ25umol·L ，对照组加入等体积的MEM。37℃、5％CO2温箱孵育24小时后，留取各组细胞培养液。取编号0-6试管\n7只，分别加入丙酮酸钠标准液0ml、0.05ml、0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml，乳酸盐1.0ml、0.95ml、0.90ml、0.80ml、0.70ml、0.60ml、0.50ml，再分别加入蒸馏水0.3ml及2，-1\n4二硝基苯肼溶液1.0ml。混匀37℃水浴15分钟。每管加0.4mol·L NaOH10ml以及0ml、-1\n250ml、500ml、1000ml、1500ml、2000ml、2500ml相当LDH单位(U)·100ml 。混匀后放置5分钟，440nm蓝色滤光板处比色，以空白调零点读取各管吸光度值与相应单位绘制标准曲线。\n培养液按试剂盒操作说明所示方法(比色法)进行测定LDH漏出率，在全自动酶标仪450nm处测定光密度值。\n[0092] 结果：各组SH-SY5Y细胞LDH值的变化\n[0093] 表5对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞LDH值的影响\n[0094] \n[0095] \n[0096] 注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。\n[0097] 经统计学处理，Aβ25-35损伤的模型组与正常对照组比较，LDH活性具有显著差异(P＜0.01＝，A、C治疗组有提高LDH活性的趋势，但没有统计学意义。治疗组B，G较模型组LDH活性增强(P＜0.05＝，治疗组E、F、D较模型组的LDH活性增强显著，二者之间显著性差异(P＜0.01＝(见表5)。\n[0098] 实验例6观察药物对Aβ25-35损伤细胞模型中AKT-CREB-pCREB表达的影响实验[0099] 研究对象、细胞模型的制备同实验例2\n4\n[0100] SH-SY5Y细胞按1×10 密度接种到75ml培养瓶。生长达70-80％时，置换为无血-1\n清培养基，分为对照组、Aβ25umol·L 组、Aβ加A治疗组、Aβ加B治疗组、Aβ加C治疗组、Aβ加D治疗组、Aβ加E治疗组、Aβ加F治疗组、Aβ加G治疗组。37℃、5％CO2温箱孵育24小时后，弃去原培养液，用预冷的PBS洗3遍，0.25％胰酶消化。800-1000rpm离心3min。收集沉淀，加入细胞裂解液0.5ml，冰浴中裂解40min。将细胞裂解物收集到Ependorff管中，12500rpm，4℃离心30分钟，取上清。以福林(Folin)酚比色法(Lowr法)测定蛋白质含量以控制样品加样量。按以下步骤进行Western-blot蛋白印迹分析：\n[0101] (1)胶的制备\n[0102] ①按照《分子克隆实验指南》上的方法配制12％的聚丙烯酞胺凝胶，最后加入TEMED，迅速混匀、灌入灌胶模具玻璃板中，留出积层胶所需空间，小心覆盖一层去离子水，室温、垂直放置。\n[0103] ②分离胶聚合30min，完全聚合后，去离子水洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的丙烯酞胺。用滤纸边缘吸净残留液体。\n[0104] ③配制5％积层胶，直接灌入已聚合的分离胶上，立即在积层胶溶液中插入干净的Teflon梳子，避免混入气泡，室温、重直放置。\n[0105] ④积层胶聚合后小心移出Teflon梳子，将凝胶固定于电泳装置上，在电泳槽内注入Tris一甘氨酸电泳缓冲液。\n[0106] (2)加样\n[0107] 将蛋白质样品加入等量的2×SDS凝胶加样缓冲液进行变性(100℃，3分钟)[0108] 后，按照各样品的蛋白质含量计算加样量。取甘氨酸预染标准分子量蛋白质(Marker，8.4KD-176.5KD)5ul加入一孔。而后按照对照组、模型组、APP17肽组、清开灵提取物组的顺序加样。\n[0109] (3)电泳\n[0110] 电泳初始电压为50V，溴酚蓝到达分离胶后，将电压升至80V。溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源；卸下玻璃板，小心取出凝胶。\n[0111] (4)转膜\n[0112] 选取、切下所需泳道的聚丙烯酰胺凝胶，剪取与胶相同大小的NC膜和6张Whatman滤纸，用转移液将滤纸完全浸湿后安装转移装置(转移槽的阴极铺3层滤纸，小心将胶平铺在滤纸上，并在胶上铺以纤维素膜，将剩余3层滤纸铺与膜的上方，注意各层对齐，谨防出现气泡)；注满转移缓冲液。置于4℃层析冷柜，稳压，电流500mA，2小时。\n[0113] (5)杂交\n[0114] ①硝酸纤维素膜置于封闭液中1小时。PBS洗膜三次，每次5分钟。\n[0115] ②一抗AKT、CREB、pCREB按1∶1000稀释，孵育1小时，PBS洗膜3次，每次5分钟。\n[0116] ③碱性磷酸酶偶联小鼠IgG(1∶2000稀释)孵育1小时，PBS洗膜3次，每次5分钟。\n[0117] ④碱性磷酸酶系统显色，结果经计算机扫描系统存贮。\n[0118] 5AKT-CREB-p-CREB的表达(见附图1)\n[0119] Aβ25-35损伤的模型组与正常对照组比较，其AKT-CREB-p-CREB表达水平下降，而G治疗组的AKT-CREB-p-CREB表达水平较模型组增高，并且有统计学意义。\n[0120] 综合实验例2-6的实验结果可知，本发明药物组合物可具有明显的神经和突触保护作用，表现在增加神经元数量、改善受到损伤的神经元和突触形态、增强神经元活性、改善突触可塑性；本发明药物组合物可明显改善Aβ所致的神经元结构和活性改变，表现在增加细胞数目和胞体面积，减少了LDH的漏出、提高了MTT代谢率，同时本发明药物组合物不仅增强线粒体功能，还能对抗Aβ的神经细胞膜毒性效应，恢复神经细胞脂质双层膜的正常流动。\n[0121] 下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果\n[0122] 实施例1\n[0123] 银杏叶1kg、姜黄9kg、远志1kg\n[0124] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的片剂。\n[0125] 实施例2\n[0126] 银杏叶1kg、姜黄1kg、远志8kg\n[0127] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的胶囊剂。\n[0128] 实施例3\n[0129] 银杏叶9kg、姜黄1kg、远志1kg\n[0130] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的颗粒剂。\n[0131] 实施例4\n[0132] 银杏叶8kg、姜黄9kg、远志1kg\n[0133] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的口服液。\n[0134] 实施例5\n[0135] 银杏叶1kg、姜黄8kg、远志9kg\n[0136] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的注射剂。\n[0137] 实施例6\n[0138] 银杏叶1kg、姜黄9kg\n[0139] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的片剂。\n[0140] 实施例7\n[0141] 银杏叶8kg、姜黄1kg\n[0142] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的胶囊剂。\n[0143] 实施例8\n[0144] 银杏叶1kg、姜黄1kg\n[0145] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的颗粒剂。\n[0146] 实施例9\n[0147] 姜黄8kg、远志1kg\n[0148] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的口服液。\n[0149] 实施例10\n[0150] 姜黄1kg、远志9kg\n[0151] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的注射剂。\n[0152] 实施例11\n[0153] 姜黄10kg、远志10kg\n[0154] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的片剂。\n[0155] 实施例12\n[0156] 银杏叶1kg、远志1kg \n[0157] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的片剂。\n[0158] 实施例13\n[0159] 银杏叶1kg、远志7kg\n[0160] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的胶囊剂。\n[0161] 实施例14\n[0162] 银杏叶9kg、远志1kg\n[0163] 上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的丸剂。\n[0164] 实施例15注射液的制备\n[0165] A、取姜黄，粉碎成粗颗粒；加10倍体积的70％乙醇，以3mL/min速度渗漉；收集渗漉液，回收乙醇，残留物加8倍水溶解，滤过，滤液调pH为7左右，通过大孔吸附树脂吸附，水洗至澄清，用80％乙醇以1-1.5BV/h速度依次洗脱，减压回收乙醇至干，浓缩，加适量水使药液体积相当于含生药材约4g/ml；按5％加入活性炭，65℃保温35分钟，滤过，滤液减压浓缩至干，即得姜黄素；\n[0166] B、取远志，加10倍量85％乙醇回流提取3次，每次2小时，得远志总皂苷乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，加15倍水溶解，通过大孔吸附树脂吸附，3BV以1BV/h速度依次洗脱，水洗至澄清，先用30％乙醇洗脱，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱物，回收乙醇，浓缩，即得远志皂苷；\n[0167] C、将银杏叶，用70％乙醇回流提取2次，以第一次10倍量，第二次8倍量；合并提取液加入一定量的2％的甲壳素絮凝剂，静置12小时以上，离心除去沉淀，上清液通过DM130大孔吸附树脂柱吸附，水洗至澄清，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，浓缩干燥，得银杏叶提取物；\n[0168] D、取银杏叶提取物1kg、姜黄素9kg、远志皂苷1kg，混合，加入4000ml的水，搅拌均匀后用10％NaOH调pH值为8，加注射用水至5000ml，加0.5％活性炭，煮沸30分钟，滤过，滤液加注射用水调整至5000ml，4℃静置3天，微孔滤膜精滤，115℃、30分钟热压灭菌，无菌条件下微孔滤膜精滤，分装，制备得注射液。\n[0169] 实施例16胶囊剂的制备\n[0170] A、与实施例15同法制得姜黄素；\n[0171] B、取远志，切碎，用2倍重量份的水浸泡1小时后，沸水煮1小时，滤出水煮液，其药渣再加2倍重量份的水，沸水煮1小时，再次滤出水煮液，将两次提取液合并；减压，在\n60℃条件下浓缩至原体积的1/5，冷却后，加浓缩液2倍体积份的95％乙醇，沉淀蛋白质和胶状物，滤除沉淀物的溶液，蒸去乙醇，加1/5体积的蒸馏水，趁热过滤，放冷，析出粗银杏叶甙，即得；\n[0172] C、将银杏叶切碎，用75％乙醇回流提取3次，以第一次8倍量，第二次10倍量，第三次6倍量，合并提取液加入一定量的2％的甲壳素絮凝剂，静置24小时，离心除去沉淀，上清液通过DM130大孔吸附树脂柱吸附，水洗至澄清，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，浓缩干燥；\n[0173] D、取银杏叶7kg、姜黄素5kg、远志皂苷8kg，混合，加入75％乙醇制成软材，制粒(或喷雾制粒)，干燥，整粒，装入胶囊，制得胶囊剂。\n[0174] 实施例17口服液的制备\n[0175] A、与实施例15同法制得姜黄素；\n[0176] B、常规方法制得远志皂苷；\n[0177] C、与实施例16同法制得银杏叶提取物；\n[0178] D、取银杏叶提取物8kg、姜黄素1kg、远志皂苷5kg，混合，加入4000ml的水，搅拌均匀后用10％NaOH调pH值为7.2，加水至5000ml，加0.1-0.2％活性炭，煮沸20分钟，滤过，滤液加水调整至5000ml，微孔滤膜精滤，滤液分装入输液瓶中，115℃、30分钟热压灭菌，制备得口服液。\n[0179] 实施例18片剂的制备\n[0180] A、与实施例15同法制得姜黄素；\n[0181] B、与实施例16同法制得远志皂苷；\n[0182] C、与实施例15同法制得银杏叶提取物；\n[0183] 取银杏叶提取物8kg、姜黄素9kg、远志皂苷1kg，混合，加入75％乙醇制成软材，制粒(或喷雾制粒)，干燥，整粒，加入常规辅料，经常规方法，制备得片剂。\n[0184] 实施例19颗粒剂的制备\n[0185] A、常规方法制得姜黄素；\n[0186] B、与实施例15同法制得远志皂苷；\n[0187] C、与实施例16同法制得银杏叶提取物；\n[0188] 取银杏叶提取物5kg、姜黄素7kg、远志皂苷10kg，加入适量得蔗糖粉和糊精，混合，加入75％乙醇制成软材，制(或喷雾制粒)，干燥，整粒，分装，制得颗粒剂。\n[0189] 实施例20注射剂\n[0190] A、与实施例15同法制得远志皂苷；\n[0191] B、银杏叶提取物由常规方法制备；\n[0192] C、取银杏叶提取物8kg、远志皂苷10kg，混合，加入4000ml的水，搅拌均匀后用\n10％NaOH调pH值为7.2，加注射用水至5000ml，加0.5％活性炭，煮沸30分钟，滤过，滤液加注射用水调整至5000ml，微孔滤膜精滤，滤液分装入输液瓶中，115℃、30分钟热压灭菌，制备得注射剂。\n[0193] 实施例21\n[0194] 银杏叶1kg、姜黄素9kg、远志皂苷1kg\n[0195] 其中远志皂苷制法同实施例27；姜黄素制法同实施例24；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的片剂。\n[0196] 实施例22\n[0197] 银杏叶提取物1kg、姜黄1kg、远志8kg\n[0198] 其中姜黄素由常规方法制得；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的胶囊剂。\n[0199] 实施例23\n[0200] 银杏叶提取物8kg、姜黄素9kg、远志1kg\n[0201] 其中银杏叶提取物、姜黄素由常规方法制备；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的口服液。\n[0202] 实施例24\n[0203] 银杏叶1kg、姜黄素8kg、远志9kg\n[0204] 其中姜黄素制法同实施例18；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的注射剂。\n[0205] 实施例25\n[0206] 银杏叶提取物1kg、姜黄9kg\n[0207] 其中银杏叶提取物由常规方法制备；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的片剂。\n[0208] 实施例26\n[0209] 银杏叶8kg、姜黄素1kg\n[0210] 其中姜黄素由常规方法制备；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的胶囊剂。\n[0211] 实施例27\n[0212] 姜黄素8kg、远志1kg\n[0213] 其中姜黄素制法同实施例17；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的口服液。\n[0214] 实施例28\n[0215] 姜黄1kg、远志皂苷9kg\n[0216] 其中远志皂苷制法同实施例16；上述原料药或原料药提取物，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床接受的注射剂。\n[0217] 实施例29\n[0218] 银杏叶1kg、姜黄9kg、远志1kg\n[0219] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的胶囊剂。\n[0220] 实施例30\n[0221] 银杏叶1kg、姜黄2kg、远志3kg\n[0222] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的丸剂。\n[0223] 实施例31\n[0224] 银杏叶9kg、姜黄9kg、远志5kg\n[0225] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加水至处方剂量，加入0.5％的活性炭，煮沸30分钟，除去活性炭，静置12小时以上按照常规工艺，制备成临床接受的口服液。\n[0226] 实施例32\n[0227] 银杏叶1kg、姜黄1kg、远志1kg\n[0228] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加水至处方剂量，加入0.5％的活性炭，煮沸30分钟，除去活性炭，静置3天以上精滤，制备成临床接受的注射剂。\n[0229] 实施例33\n[0230] 银杏叶1kg、姜黄1kg\n[0231] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加水至处方剂量，加入0.5％的活性炭，煮沸30分钟，除去活性炭，静置3天以上精滤，制备成临床接受的注射剂。\n[0232] 实施例34\n[0233] 银杏叶1kg、远志5kg\n[0234] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的胶囊剂。\n[0235] 实施例35\n[0236] 姜黄7kg、远志1kg\n[0237] 按比例取原料药；加水煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，加乙醇，冷藏过夜，滤过，取上清液，回收乙醇，浓缩得浸膏，加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的片剂。