一种复合菌无抗发酵饲料及其制备方法

1.一种复合菌无抗发酵饲料，其特征在于：它由复合菌的菌液与配合饲料的干基质混合、发酵，发酵完成后添加3.24%的预混料而制成；所述的复合菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.4628、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC No.5093和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2388组成，上述三种菌的菌液在复合菌的菌液中的体积配比为1∶1∶1；所述的配合饲料的干基质由以下重量百分比的成分组成：豆粕51.81％，玉米蛋白粉22.02％，菜籽粕3.89％，花生粕3.89％，磷酸氢钙
5.18％，石粉5.18％，食盐2.98％，赖氨酸1.68％，氯化胆碱0.13％，
发酵的条件如下：复合菌的菌液在干基质中的接种量为3-6％(v/w)；蛋白酶添加量为
100-120U/g；料水比按重量体积比为1∶1-1∶0.4；温度，35-40℃；发酵时间，96-168h。
2.如权利要求1所述的复合菌无抗发酵饲料，其特征在于：所述的复合菌的菌液中枯草芽孢杆菌的浓度为4.20-5.45log CFU/mL；嗜酸乳杆菌的浓度为4.12-5.03log CFU/mL；酿酒酵母的浓度为4.23-5.74log CFU/mL；所述的3.24%预混料的组成及配比如下，每千克含：铜，30000mg；铁，19000mg；锌，18000mg；锰，9600mg；碘，80mg；硒，70mg；维生素A，
800000IU；维生素D3，240000IU；维生素E，2400IU；维生素K3，480mg；维生素B1，150mg；维生素B2，480mg；维生素B6，240mg；维生素B12，1.6mg；烟酸，3100mg；泛酸，1900mg；叶酸，
100mg；生物素，6mg；氯化胆碱，40000mg。
3. 如权利要求1所述的复合菌无抗发酵饲料，其特征在于：发酵的条件如下：复合菌的菌液在干基质中的接种量为4％(v/w)；蛋白酶添加量为110U/g；料水比为1∶0.6(w/v)；发酵温度为35℃；发酵时间为168h。
4. 权利要求1-3任一项所述的复合菌无抗发酵饲料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)枯草芽孢杆菌菌液的制备：枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保藏菌种接种至装有
100ml MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；将制备好的枯草芽孢杆菌种子液按照1-3％的接种量接种至装有100mL MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；
所述的MNB培养基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH 7.0±0.2；
2)嗜酸乳杆菌菌液的制备：嗜酸乳杆菌种子液的制备：将保藏菌种接种至装有20ml MRS的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h；将制备好的嗜酸乳杆菌种子液按照1-3％的接种量接种至装有20mL MRS培养基的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h；所述的MRS培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2；
3)酿酒酵母菌液的制备：
酿酒酵母种子液的制备：将保藏菌种接种至装有100ml YPD培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为250rpm；
酿酒酵母菌液的制备：将制备好的酿酒酵母菌种子液按照1-3％的接种量接种至装有
100ml YPD培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为250rpm；所述YPD液体培养基配方如下：酵母粉，5.0g/L；蛋白胨，10.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；丙酸钠，2.5g/L；pH
4.0±0.1；
4)发酵饲料的干基质的配制：按配比称取各成分、均匀搅拌；
5)复合菌的菌液的配制：按配比量取枯草芽孢杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，混匀；
6)发酵：将复合菌的菌液接种于干基质中，混匀，按所述发酵条件发酵；
7)向步骤6)发酵产物中加入3.24%预混料混匀，即得复合菌无抗发酵饲料。

一种复合菌无抗发酵饲料及其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种复合菌无抗发酵饲料及其制备方法，属于微生物发酵饲料和固体饲料领域。\n背景技术\n[0002] 目前，随着人民生活水平的提高，食品的质量安全问题日益受到国家及百姓的重视，猪肉及其脏器作为中国人民传统的副食品首当其冲。但是，抗生素在猪肉及其脏器中的残留也对人体的健康产生了直接或间接的危害。所以减少或停止抗生素在饲料中的添加使用，已经成为科研工作者解决猪肉质量安全问题的任务。近年来，微生态制剂、酶制剂、中草药制剂和有机酸类抗生素替代品的出现，对于解决这一问题起了很大的作用，但是这些产品仍然没有使全价配合饲料彻底摆脱对抗生素类生长促进剂的依赖。\n[0003] 固态发酵技术在中国有着悠久的历史，但传统的固态发酵技术因其发酵过程难以控制，容易感染杂菌，且产品质量很难保证。19世纪微生物的发现、微生物发酵的酶作用及微生物学的问世，将发酵技术带入了高速发展的快车道，现已在生物能转化、固态废弃物处理和代谢产物生产等方面均得到了广泛的应用。众多文献报道，猪用全价饲料经过微生物发酵作用后，饲料中产生大量乳酸菌，乙酸和乳酸浓度得到大幅度的提高，显著降低了饲料pH值，饲喂发酵饲料能够提高猪的生长性能并且改善猪的肠道健康。但还有一些技术问题尚需解决：发酵饲料的菌种开发，菌种的好坏将直接影响发酵饲料的饲喂效果，发酵饲料的发酵工艺等。\n发明内容\n[0004] 本发明的目的在于提供一种复合菌无抗发酵饲料。该饲料中未添加任何的抗生素，由三种益生菌发酵而成，不仅可以促进动物生长，而且还能改善并维持肠道菌群平衡，可直接在生长育肥猪饲养中应用。\n[0005] 本发明的另一目的是提供该复合菌无抗发酵饲料的制备方法。\n[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：本发明提供一种复合菌无抗发酵饲料，该饲料由复合菌的菌液与配合饲料的干基质混合、发酵，发酵完成后添加4％的预混料而制成；所述的复合菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.4628、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC No.5093和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2388组成，上述三种菌在复合菌的菌液中的配比为1∶1∶1；所述的配合饲料的干基质由以下重量百分比的成分组成：豆粕51.81％，玉米蛋白粉22.02％，菜籽粕\n3.89％，花生粕3.89％，磷酸氢钙5.18％，食盐2.98％，赖氨酸1.68％，氯化胆碱0.13％。\n[0007] 进一步，所述的复合菌的菌液中枯草芽孢杆菌的浓度为4.20-5.45log CFU/mL；\n嗜酸乳杆菌的浓度为4.12-5.03log CFU/mL；酿酒酵母的浓度为4.23-5.74log CFU/mL；所述的4％预混料的组成及配比如下，每千克含：铜，30000mg；铁，19000mg；锌，18000mg；锰，\n9600mg；碘，80mg；硒，70mg；维生素A，800000IU；维生素D3，240000IU；维生素E，2400IU；维生素K3，480mg；维生素B1，150mg；维生素B2，480mg；维生素B6，240mg；维生素B12，1.6mg；\n烟酸，3100mg；泛酸，1900mg；叶酸，100mg；生物素，6mg；氯化胆碱，40000mg。\n[0008] 复合菌的菌液与配合饲料的干基质混合、发酵，发酵的条件如下：复合菌的菌液在干基质中的接种量为3-6％(v/w)；蛋白酶添加量为100-120U/g；料水比按重量体积比为\n1∶1-1∶0.4；温度，35-40℃；发酵时间，96-168h。\n[0009] 进一步，发酵的条件如下：复合菌的菌液在干基质中的接种量为4％(v/w)；蛋白酶添加量为110U/g；料水比为1∶0.6(w/v)；发酵温度为35℃；发酵时间为168h。\n[0010] 本发明还提供了该复合菌无抗发酵饲料的制备方法，它包括如下步骤：\n[0011] 1)枯草芽孢杆菌菌液的制备：\n[0012] 枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保藏菌种接种至装有100ml MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；将制备好的枯草芽孢杆菌种子液按照\n1-3％的接种量接种至装有100mL MNB培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm；\n[0013] 所述的MNB培养基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；\n酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH 7.0±0.2；\n[0014] 2)嗜酸乳杆菌菌液的制备：\n[0015] 嗜酸乳杆菌种子液的制备：将保藏菌种接种至装有20ml MRS的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h；将制备好的嗜酸乳杆菌种子液按照1-3％的接种量接种至装有20mL MRS培养基的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h；\n[0016] 所述的MRS培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；\n葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，\n2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2；\n[0017] 3)酿酒酵母菌液的制备：\n[0018] 酿酒酵母种子液的制备：将保藏菌种接种至装有100ml YPD培养基的锥形瓶中，\n30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为250rpm；\n[0019] 酿酒酵母菌液的制备：将制备好的酿酒酵母菌种子液按照1-3％的接种量接种至装有100ml YPD培养基的锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为250rpm；\n[0020] 所述YPD液体培养基配方如下：酵母粉，5.0g/L；蛋白胨，10.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；丙酸钠，2.5g/L；pH 4.0±0.1；\n[0021] 4)发酵饲料的干基质的配制：按配比称取各成分、均匀搅拌；\n[0022] 5)复合菌液的配制：按配比量取枯草芽孢杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液，混匀；\n[0023] 6)发酵：将复合菌的菌液接种于干基质中，混匀，按所述发酵条件发酵；\n[0024] 7)向步骤6)发酵产物中加入4％预混料混匀，即得复合菌无抗发酵饲料。\n[0025] 本发明所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面粗糙，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆盐，可以耐受80℃的制粒温度，可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2011年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4628。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为申请人从动物肠道中分离得到，能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素)，对肠道致病菌产生拮抗作用，抑制肠道不良微生物的增殖，调整肠道菌群平衡，它的生物学特征如下：杆菌，两端圆，0.6-0.9×1.5-6μm，以单个、成双或短链出现；不运动，无边帽，菌落粗糙。在显微镜下观察，显示缠绕或微绒毛丝状物，从似暗影的菌堆的中心放射伸出。无特有的色素。可同化苦杏仁苷、纤维二糖、七叶苷、果糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜二糖、棉籽糖、海藻糖，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、甘露糖。同型发酵，产生DL-乳酸。15℃下不生长，最适生长温度为35℃-38℃，生长初始pH值为5.0-7.0，最适生长pH值为5.5-6.0。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)申请人已于\n2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址及简称同上，保藏编号为CGMCC No.5093。本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有良好的耐胃酸、耐胆盐、耐高温、耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶、抑制病原菌等益生功能，为申请人从健康动物肠道或粪便中分离、选育得到，经中国农业微生物菌种保藏管理中心鉴定，并于2008年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.2388(保藏证明参见申请人的申请号为：200810106520.5的中国发明专利)。\n[0026] 本发明的复合菌无抗发酵饲料的优点和有益效果是：本发明复合菌中的嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌是适宜固态发酵饲料的优良菌种，能够有效抑制饲喂系统、饲料原料中含有的大量杂菌、有害菌的生长繁殖，保证发酵固态饲料的良好发酵；酿酒酵母的生长能够分解利用碳水化合物合成微生物蛋白，发酵时添加少量尿素等无机氮源可以提高菌体蛋白的产量，亦可帮助创造一个无氧环境。并且发酵饲料制备工艺简单，发酵过程以及发酵工艺参数都经过申请人实验、优化，简单方便，易于各类养殖户、生产饲料企业操作；且制备的固态发酵饲料效果显著，不仅能够提高饲料利用率，促进动物生长，而且还能改善并维持肠道菌群平衡，提高动物免疫力和抗病力，并有效改善猪的体型，增加经济效益。本发明的复合菌无抗发酵饲料制备过程及最终产品无抗生素的添加，绿色安全，可直接在生长育肥猪饲养中应用。\n具体实施方式\n[0027] 通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。\n[0028] 实施例1、复合菌菌液的制备\n[0029] (1)复合菌中各菌种菌液的制备：\n[0030] 1)枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628菌液的制备：\n[0031] 枯草芽孢杆菌种子液的制备：将试管斜面保藏菌种接种至装有100ml MNB培养基的250ml锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm。\n[0032] 枯草芽孢杆菌菌液的制备：将制备好的枯草芽孢杆菌种子液按照1％的接种量接种至装有100mL培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为225rpm。\n[0033] 本发明所述的MNB培养基为：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；\n酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH 7.0±0.2。\n[0034] 2)嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌液的制备：\n[0035] 嗜酸乳杆菌种子液的制备：将试管斜面保藏菌种接种至装有20ml MRS的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h。\n[0036] 嗜酸乳杆菌菌液的制备：将制备好的嗜酸乳杆菌种子液按照1％的接种量接种至装有20mL MRS培养基的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h。每次培养至少5管。\n[0037] 本发明所述的MRS培养基为：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；\n葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，\n2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2。\n[0038] 3)酿酒酵母CGMCC No.2388菌液的制备：\n[0039] 酿酒酵母菌种子液的制备：将试管斜面保藏菌种接种至装有100ml YPD培养基的250ml锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为250rpm。\n[0040] 酿酒酵母菌液的制备：将制备好的酿酒酵母菌种子液按照1％的接种量接种至装有100mlYPD培养基的250ml锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养16h，摇床转速为250rpm。\n[0041] 所述培养酿酒酵母菌所用的YPD液体培养基：酵母粉，5.0g/L；蛋白胨，10.0g/L；\n葡萄糖，20.0g/L；丙酸钠，2.5g/L；pH 4.0±0.1。\n[0042] 实施例2、应用复合菌制备无抗发酵饲料的步骤以及发酵工艺参数\n[0043] (1)复合菌无抗发酵饲料的干基质的配制：本发明所述的用于制备复合菌无抗发酵饲料的干基质是配合饲料不包括4％的预混料的部分，即：先将配合饲料中4％的预混料之外的部分按照配比混匀制成用于发酵的干饲料。配合饲料配方如下(见表1)：\n[0044] 表1、发酵饲料配合饲料配方表\n[0045] \n[0046] (2)复合菌菌液的制备：三种菌取自实施例1，枯草芽孢杆菌的浓度为4.20log CFU/mL；嗜酸乳杆菌的浓度为4.12log CFU/mL；酿酒酵母菌的浓度为4.23log CFU/mL，按照体积比为枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌∶酿酒酵母菌＝1∶1∶1混匀而成。\n[0047] 所述菌液的含水量为91.6％-95.8％或91.6％-95.7％或91.6％-93.0％或\n91.8％-95.8％或91.8％-95.7％或93.0％-95.8％，所述百分含量为重量百分比。\n[0048] (3)通过正交试验对外加酶复合菌固态发酵工艺的优化：首先进行蛋白酶添加量的选择试验，确定进行正交试验时加酶的剂量范围，其余4个单一因素的设定水平由预试\n4\n验完成。确定好各个试验因素的水平后，设计了5因素4水平L165 的正交试验(见表2)进行豆粕的多菌种固态发酵工艺条件的优化。\n[0049] 表2、试验设计及实施方案\n[0050] \n[0051] 注：A1：蛋白酶添加量，U/g。B2：接种量，％。C3：料水比。D4：温度，℃。E5：时间，h。1，2，3，4：表示试验因素的不同水平。\n[0052] 在发酵完成后，采集样品进行微生物计数和营养成分分析。当蛋白酶添加量为\n110U/g；接种量为4％(v/w)；料水比为1∶0.6(w/v)；温度为35℃；发酵时间为168h时，嗜酸乳杆菌活菌含量6.7log CFU/g，枯草芽孢杆菌含量为6.4log CFU/g以及酿酒酵母活菌含量为7.8log CFU/g，可溶性蛋白的含量达到了9.1％，可溶性蛋白占粗蛋白的百分比也提高了2％，即得到最大的水解度值，pH值为5.85。综合以上结论得到最优发酵方案为：蛋白酶添加量，110U/g；接种量，4％(v/w)；料水比，1∶0.6(w/v)；温度，35℃；发酵时间，168h。\n[0053] (4)复合菌无抗发酵饲料的工艺参数：将步骤1)中的干基质于步骤2)中的复合菌菌液混合均匀，按照步骤(3)中最优发酵方案进行发酵。\n[0054] (5)将步骤(4)制备好的固体发酵饲料中添加4％预混料(即表1中维生素和微量元素预混料)配制成全价料，混匀，即得复合菌无抗发酵饲料。\n[0055] 本发明中的4％生长猪预混料每千克含：铜，30000mg；铁，19000mg；锌，18000mg；\n锰，9600mg；碘，80mg；硒，70mg；维生素A，800000IU；维生素D3，240000IU；维生素E，\n2400IU；维生素K3，480mg；维生素B1，150mg；维生素B2，480mg；维生素B6，240mg；维生素B12，1.6mg；烟酸，3100mg；泛酸，1900mg；叶酸，100mg；生物素，6mg；氯化胆碱，40000mg。\n[0056] 实施例3、本发明的复合菌固态发酵对饲料微生物组成的影响\n[0057] (1)实施例2制备的发酵饲料样品采集：分别于发酵开始后第0(发酵前)、1、2、3、\n5、7d取样，进行微生物组成分析。检测指标包括：嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和大肠杆菌的数目。\n[0058] (2)发酵饲料样品的微生物测定：微生物测定采用10倍稀释法，取1g样品溶于\n9mL无菌水中，然后制作10倍稀释的系列，选择适合的稀释梯度进行测定。\n[0059] 枯草芽孢杆菌应用复合营养琼脂培养基进行平板计数，30℃培养16h。\n[0060] 嗜酸乳杆菌测定应用MRS琼脂培养基，用厌氧管充N2制成Hungates滚管计数，\n37℃培养20h。\n[0061] 酿酒酵母菌测定应用YPD琼脂培养基，采用平板培养计数法，30℃培养16h。\n[0062] 大肠杆菌测定应用麦康凯培养基进行平板计数，37℃培养24h。\n[0063] MNB琼脂培养基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.005g/L；pH 7.0。\n[0064] MRS琼脂培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，\n2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2。\n[0065] YPD琼脂培养基为：酵母提取物，10g/L；细菌蛋白胨，20g/L；葡萄糖，20g/L；琼脂，\n15g/L。\n[0066] 麦康凯培养基配方如下：蛋白胨，20.0g/L；乳糖，10.0g/L；胆盐，5.0g/L；氯化钠，\n5.0g/L；中性红，0.075g/L；琼脂，12.0g/L；pH 7.4±0.2。\n[0067] (3)发酵过程中发酵饲料微生物组成的变化情况：\n[0068] 在35℃的环境中发酵三天后，饲料中嗜酸乳杆菌的数目迅速由4.12log CFU/g提高到7.9log CFU/g，但是随后出现了小范围的下降，7d后稳定在了6.7log CFU/g。同嗜酸乳杆菌数目的情况类似，酿酒酵母菌的数目在发酵最初几天快速增加，在第3d达到8.8log CFU/g，但随着发酵时间延长不断下降，在第7d稳定在7.8log CFU/g。枯草芽孢杆菌数目在第1d从4.2log CFU/g提高到了6.8log CFU/g，但是随后也开始下降，发酵结束后为6.4log CFU/g。大肠杆菌数目在第2d从3.0log CFU/g提高到4.2log CFU/g，但随后就开始下降，发酵7d后，大肠杆菌数目下降到了检测限(3.0log CFU/g)以下。\n[0069] 本发明中采用了枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母三种菌种进行组合发酵。\n乳酸菌发酵需要厌氧环境，酵母菌的任务是通过它的呼吸作用消耗掉反应器中的氧气，从而为乳酸菌和芽孢杆菌的生长提供无氧环境。\n[0070] 实施例4、本发明的复合菌固态发酵对饲料营养成分的影响\n[0071] (1)实施例2制备的发酵饲料样品采集：\n[0072] 分别于发酵开始后第0(发酵前)、1、2、3、5、7d取样，进行营养成分分析。检测指标包括：干物质、粗蛋白、可溶性蛋白含量；乳酸以及短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸)的含量。\n[0073] (2)发酵饲料样品的化学分析：\n[0074] 干物质、粗蛋白的检测方法参照AOAC(1990)。\n[0075] 短链脂肪酸测定采用气相色谱法。先将样品溶于水(1∶3，w/v)，6000rpm离心\n10min后取上清；上清中加入乙腈以除去溶液中的蛋白质，10000rpm离心5min后取上清；\n上清液中加入内标(2-乙基丁酸)后即可上机测定。\n[0076] 将样品稀释匀浆后测定可溶性蛋白和乳酸的含量。可溶性蛋白的测定使用南京建成生物科技研究中心的总蛋白测定试剂盒，以牛血清白蛋白为标准样品。乳酸测定使用南京建成生物科技研究中心的酶学测定试剂盒。\n[0077] (3)发酵饲料样品营养成分的变化(见表3)：\n[0078] 表3、发酵饲料的营养成分的变化\n[0079] \n[0080] 由上表看出，发酵饲料样品干物质含量在发酵第5d从66.0％下降到了64.5％，pH值由6.16下降到5.85。\n[0081] (4)发酵过程中乳酸和短链脂肪酸的变化(见表4)：\n[0082] 表4、发酵过程中短链脂肪酸和乳酸含量的变化\n[0083] \n[0084] 由上表看出，乳酸含量随着发酵时间的延长先出现下降，随后又增加到了初始浓度15mmol/kg左右。乙酸含量呈现出了不稳定的增长，从16.7mmol/kg提高到42.2mmol/kg。丙酸和异丁酸含量稳定增加。\n[0085] 实施例5、本发明的复合菌种固体无抗发酵饲料对生长猪生长性能的影响[0086] (1)实验设计：本实验共设两个处理，分别为：1)对照组：常规日粮，预混料中添加抗生素；2)发酵料组：以发酵饲料为基础的日粮，不含抗生素。\n[0087] (2)实验动物：选用35～40日龄的阉公猪20头(杜×长×大)，平均初始体重为13.11±0.75kg。按体重相近原则随机分为两个处理，每个处理10头猪，实验分三个阶段进行，实验期总共108天。\n[0088] (3)实验日粮：实验采用玉米-豆粕型日粮，参照NRC(1998)猪饲养标准配制，发酵料处理组三个阶段发酵饲料添加比例分别为25％、20％和15％(见表5)。对照组预混料由市场上销售的含有抗生素的预混料提供。\n[0089] 表5、实验日粮的组成及其营养水平\n[0090] \n[0091] 本发明中14～25kg每千克预混料提供：铜，5000mg；铁，2800mg；锌，2500mg；锰，\n1300mg；碘，15mg；硒，10mg；钙，200g；磷，20g；食盐，80g；维生素A，125000IU；维生素D3，\n38000IU；维生素E，380IU；维生素K3，75mg；维生素B1，25mg；维生素B2，75mg；维生素B6，\n40mg；维生素B12，0.25mg；烟酸，500mg；泛酸，300mg；叶酸，16mg；生物素，1mg；氯化胆碱，\n6000mg；硫酸粘杆菌素，375mg。\n[0092] 本发明中25～65kg每千克预混料提供：铜，3500mg；铁，2200mg；锌，2200mg；锰，\n1100mg；碘，10mg；硒，8mg；钙，180g；磷，20g；食盐，80g；维生素A，100000IU；维生素D3，\n30000IU；维生素E，300IU；维生素K3，60mg；维生素B1，20mg；维生素B2，60mg；维生素B6，\n30mg；维生素B12，0.2mg；烟酸，400mg；泛酸，250mg；叶酸，13mg；生物素，0.8mg；氯化胆碱，\n5000mg；赖氨酸，32g；黄霉素，125mg。\n[0093] 本发明中65～95kg每千克预混料提供：铜，2500mg；铁，1600mg；锌，1600mg；\n锰，800mg；碘，8mg；硒，6mg；钙，150g；磷，10g；食盐，80g；维生素A，100000IU；维生素D3，\n25000IU；维生素E，250IU；维生素K3，45mg；维生素B1，15mg；维生素B2，50mg；维生素B6，\n25mg；维生素B12，0.15mg；烟酸，300mg；泛酸，200mg；叶酸，10mg；生物素，0.6mg；氯化胆碱，4000mg；赖氨酸，32g；黄霉素，125mg。\n[0094] 本发明中除代谢能，其他数据均为实测值。\n[0095] (4)饲养管理：实验饲养管理分两段进行，其中第一阶段在仔猪代谢实验室(控温控湿)进行，后两个阶段在生长猪代谢实验室进行，所有动物单笼饲养。每天早晚各饲喂一次，直到停止采食，全天自由饮水。按常规程序和方法进行免疫。在每个阶段结束时对猪进行称重，并且记录采食量。在实验的第一阶段，处理组和对照组各淘汰一头体况不好的实验猪。\n[0096] (5)测定指标：平均日增重、平均日采食量、料重比\n[0097] (6)实验结果(见表6)：\n[0098] 表6、复合菌固态发酵饲料对生长育肥猪生长性能的影响\n[0099] \n[0100] \n[0101] 注：SEM：表示平均标准误；\n[0102] P＜0.01，表明差异极显著；P＜0.05，表明差异显著；P＞0.05，表明差异不显著。\n[0103] 由上表看出，两个处理在14～25kg，25～65kg两个阶段和全期(14～95kg阶段)的平均日增重和料重比方面有显著差异，且与对照组相比，发酵料处理组生长育肥猪的平均日采食量有所提高。在25～65kg阶段，发酵料处理组平均日增重明显提高、料重比降低。说明发酵料具有显著提高生长育肥猪生长性能的作用。\n[0104] 实施例6：复合菌无抗固态发酵饲料在规模化猪场中的应用效果\n[0105] (1)实验设计：本实验共设两个处理，分别为：1)对照组：常规日粮，预混料中添加抗生素；2)发酵料组：以发酵饲料为基础的日粮，不含抗生素。\n[0106] (2)实验动物：选用杂交猪96头(杜×长×大)，平均初始体重为\n32.08±0.64kg。按体重、性别随机分为两个处理，每个处理8个重复(圈)，其中包括3个公猪圈和5个母猪圈，每个重复6头猪。实验分两个阶段进行，分别是25～60kg和60～\n100kg。\n[0107] (3)实验日粮：实验采用玉米-豆粕型日粮，参照NRC(1998)猪饲养标准配制，发酵料处理组两个阶段发酵饲料添加比例分别为20％和15％(见表7)。对照组预混料由市场上销售的含有抗生素的预混料提供。\n[0108] 表7、实验日粮的组成及其营养水平\n[0109] \n[0110] \n[0111] 本发明中25～60kg每千克预混料提供：铜，3500mg；铁，2200mg；锌，2200mg；锰，\n1100mg；碘，10mg；硒，8mg；钙，180g；磷，20g；食盐，80g；维生素A，100000IU；维生素D3，\n30000IU；维生素E，300IU；维生素K3，60mg；维生素B1，20mg；维生素B2，60mg；维生素B6，\n30mg；维生素B12，0.2mg；烟酸，400mg；泛酸，250mg；叶酸，13mg；生物素，0.8mg；氯化胆碱，\n5000mg；赖氨酸，3.2％；15％金霉素，12.5g。\n[0112] 本发明中60～100kg每千克预混料提供：铜，2500mg；铁，1600mg；锌，1600mg；\n锰，800mg；碘，8mg；硒，6mg；钙，150g；磷，10g；食盐，80g；维生素A，100000IU；维生素D3，\n25000IU；维生素E，250IU；维生素K3，45mg；维生素B1，15mg；维生素B2，50mg；维生素B6，\n25mg；维生素B12，0.15mg；烟酸，300mg；泛酸，200mg；叶酸，10mg；生物素，0.6mg；氯化胆碱，4000mg；赖氨酸，3.2％；15％金霉素，12.5g。\n[0113] 本发明中除消化能外，其余均为实测值。\n[0114] (4)饲养管理：实验在种猪场进行，自由采食和饮水，按常规程序和方法进行免疫。在每个阶段结束时对猪进行称重，并且记录采食量。\n[0115] (5)检测指标：平均日增重、平均日采食量、料重和腹泻统计