大肠杆菌可溶性表达载体的设计及其应用

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大肠杆菌可溶性表达载体的设计及其应用\n本发明属基因工程技术领域。\n大肠杆菌表达体系是基因工程的首选表达体系，具有生长周期短，方法简便，价格低廉，表达水平高等诸多优点。但外源基因在大肠杆菌中表达时，往往以不溶性，无生物活性的包涵体形式存在。尽管包涵体产物形式为分离纯化提供了不少便利，但产物必须经体外变复性才能获得生物活性。蛋白质体外复性过程复杂，而且得率低。对多硫键的蛋白质(尤其是药用蛋白质)，存在二硫键错配的异构体，从而为下游的分离纯化加大了难度，带来了困难。为防止基因工程包涵体产物的形成，科学家采用了融合表达的方法：即将外源基因和能在大肠杆菌中高水平表达，且产物溶解性很好的蛋白质(如金黄色葡萄球菌蛋白A，谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白malE，大肠杆菌硫氧还蛋白等)构建成融合蛋白的形式，借助于溶解性能好，高水平表达的融合伙伴蛋白使所需要的目标蛋白质(即外源基因产物)亦获得可溶性的大量表达，从而避免包涵体产物的生成。同时借助于融合蛋白的性质，方便了目标产物的分离纯化。John M.McCoy等人研制的、由Novagen公司继而开发并商业化推广的的大肠杆菌硫氧还蛋白融合表达系统即为目前性能最好的融合表达系统(LaVallie，E.R.等Bio/Technology 11，187-193，1993)。但由于重组蛋白质作为基因工程药品及其它一些用途时，目标产物必须是像天然蛋白质一样的完整产物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表达产物必须进行产物后加工：即融合蛋白的特异性裂解，才能获得完整的目标产物。目前最为常用的裂解方法为：1.化学法：用溴化氢断裂；2.蛋白酶法：用凝血酶和肠激酶特异性裂解。以上裂解方法都要求：1.目标蛋白质内不含裂解试剂特异性断裂的氨基酸序列；2.为避免杂质蛋白酶引发的不必要的裂解反应发生，需要高纯度的凝血酶和肠激酶，价格昂贵；3.由于溴化氰为剧毒化合物，而裂解用蛋白酶为可能引起毒副作用的杂质蛋白质，因此溴化氰及蛋白酶必须从最终产物中除净，这又带来了进一步纯化的麻烦，并人为增加了产品质量控制和检测的难度。\n为了克服上述缺陷，本发明研制了一种新的大肠杆菌可溶性表达载体，该类表达载体既能显著改善目标蛋白质表达产物的可溶性，有效避免或尽量减少包涵体产物的形成，又避免走融合蛋白表达系统的老路，表达产物以完整的非融合形式存在，有效避免融合表达产物后加工处理的麻烦和问题。这种表达载体目前在国内外都未见报道。该类表达载体对有效避免或减少基因工程产物包涵体的难题，获得有生物活性的基因工程产品，尤其是重组多肽药物具有重要的实用价值。\n本发明的目的可以通过以下措施来达到：大肠杆菌可溶性表达载体由通用的大肠杆菌表达质粒改造得到，其中将外源基因和大肠杆菌硫氧还蛋白基因以多顺反子形式共同置于同一个大肠杆菌启动子的控制下，然后在大肠杆菌中共同表达，大部分表达产物以可溶性的生物活性形式存在。该表达载体可以和例如LysS，LysE或含分子伴侣，二硫键异构酶等基因的相容性质粒共同转化大肠杆菌，并共同表达，从而达到抑制目标产物诱导前的泄漏表达，或借助于分子伴侣或二硫键异构酶的作用，进一步改善目标产物的可溶性，减少包涵体产物的形成等目的。本发明所述大肠杆菌可溶性表达载体可用于解决目前大肠杆菌基因工程表达产物易形成包涵体的难题，对可溶的、具有生物活性的基因工程产品，尤其是基因工程多肽、蛋白质药物的生产具有实用价值。\n实施例：为了和目前最为流行的，改善表达产物可溶性性能最佳的pET32表达质粒(美国Novagen公司)作一对比，本实例中使用了与pET32结构相似的表达质粒pNJUTRX-1。\n1.表达质粒pNJUTRX-1如图所示，含有T7启动子(图中1)及T7启动子控制的大肠杆菌硫氧还蛋白基因(图中2)，和硫氧还蛋白基因终止密码子重叠2个连续的SD序列(图中3)，包含在NcoI识别位点中的ATG起始密码子及一段多克隆位点序列(图中4)，以及T7终止序列(图中5)；2.心脏特异性同源异型蛋白Csx(含3对二硫键)cDNA经NcoI，EcoRI酶解克隆进经NcoI，EcoRI消解的pNJUTRX-1载体中，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达；3.表达产物经超声破碎，分别收集裂解上清液和沉淀两部分，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。\n结果表明：几乎所有Csx表达产物(完整Csx表达条带分子量为35.6KDa)都以完整的非融合蛋白形式可溶性地存在于细胞裂解上清液中，沉淀中Csx包涵体产物的含量少于占沉淀中总蛋白质的1％。而与此形成明显对照的是：克隆在融合表达载体pET32中的Csx，经IPTG诱导后，表达产物分子量为54.6KDa，即为硫氧还蛋白-Csx融合表达产物，大部分融合表达产物以不溶性包涵体形式存在，硫氧还蛋白-Csx融合蛋白包涵体占裂解沉淀中总蛋白质的49.1％。从本实例中可以看到：本发明与现有技术相比较有明显的如下优点：1.本发明设计的表达载体可显著改善重组目标表达产物的可溶性，极大减少包涵体产物的形成，结果明显好于目前性能最好的pET32硫氧还蛋白融合表达载体。在pET32硫氧还蛋白融合表达体系中，51.2％的重组硫氧还蛋白-Csx融合蛋白产物存在于包涵体沉淀中，40.6％的重组硫氧还蛋白-Csx融合蛋白产物存在于裂解上清液中；而在pNJUTRX-1中，96％的重组Csx表达产物都以完整的非融合蛋白形式可溶性地存在于细胞裂解上清液中，仅仅有不到1％的重组Csx表达产物存在于沉淀中；2.本发明设计的表达载体所表达的目标蛋白质产物为非融合的完整蛋白质，因此省去了融合表达体系中融合表达产物须经特异性断裂试剂裂解，才能获得完整目标产物的复杂步骤；3.本发明中的表达载体可以和pET32一样，和LysS，LysE以及含分子伴侣或二硫键异构酶等基因的相容性质粒共同转化大肠杆菌。\n实施例附图说明\n：表达载体pNJUTRX-1示意图。图中：1：T7启动子；2：硫氧还蛋白基因trxA；3：含有硫氧还蛋白基因终止密码子和与其重叠的2个连续的SD序列的连接序列；4：多克隆位点(Nco I，EcoR V，BamH I，EcoR I，Sac I，Sal I，Hind III，Not I，Eag I，Xho I，Ava I)；5：T7终止子序列；6：f1起始序列(fl origin)；7：氨苄抗性基因(Ap)；8：复制起始序列(ori)；9：乳糖操纵元阻遏蛋白基因(lac I)。