一种枯草芽孢杆菌、及其种衣剂和用途

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BSY2，其保藏号为：CCTCC No.M207086。
2.由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制成的母粉，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌
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BSY2母粉的活芽孢数为500×10 ～1000×10cfu/g。
3.含权利要求2所述枯草芽孢杆菌母粉的种衣剂，其特征在于，由如下重量的组分制成：
BSY2母粉20.22千克，甲基托布津0.93千克，α-萘乙酸4克，赤霉素9.1克，硅藻土
60.65千克，羧甲基纤维素钠16.17千克，木质素磺酸钠2.02千克；其中所述BSY2母粉中含活芽孢数900亿cfu/克，细度160目；所述甲基托布津是以90％原药折百计。
4.含权利要求2所述枯草芽孢杆菌母粉的种衣剂，其特征在于，由如下重量的组分制成：
BSY2母粉18.0千克，异菌脲0.85千克，α-萘乙酸0.003千克，膨润土71.20千克，聚乙烯吡咯烷酮4.5千克，木质素磺酸钠5.45千克；其中所述BSY2母粉中含活芽孢数500亿cfu/克，细度200目。
5.含权利要求2所述枯草芽孢杆菌母粉的种衣剂，其特征在于，由如下重量的组分制成：
BSY2母粉18.5千克，多菌灵2.5千克，α-萘乙酸0.005千克，硅藻土61.00千克，羧甲基纤维素钠14.50千克，木质素磺酸钠3.5千克；其中所述BSY2母粉中含活芽孢数1000亿cfu/克，细度120目。
6.含权利要求2所述枯草芽孢杆菌母粉的种衣剂，其特征在于，由如下重量的组分制成：
BSY2母粉24千克，甲基托布津4.0千克，α-萘乙酸6克，赤霉素8克，绢云母粉54.0千克，羧甲基纤维素钠14.5千克，木质素磺酸钠4.0千克；其中所述BSY2母粉中含活芽孢数800亿cfu/克，细度150目；所述甲基托布津是以90％原药折百计。
7.权利要求3～6任意一项所述的种衣剂在各种棉籽的包衣中的应用。
8.权利要求3～6任意一项所述的种衣剂在防治棉花的苗期病害中的应用。

一种枯草芽孢杆菌、及其种衣剂和用途\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种枯草芽孢杆菌、及其种衣剂和用途，属于生物农药产品。\n背景技术\n[0002] 种衣剂是一种用于种子包衣处理的农药新剂型。种衣剂是将农药活性成份粘附于种子外围，随种子播到土壤中，起到抗病、杀虫的作用，达到苗齐苗壮的目的。\n[0003] 种衣剂技术包括薄膜种衣技术和丸粒化技术两类。薄膜种衣技术不改变种子的形状与大小，农药用量少。而丸粒化技术则会改变种子的形状、增加种子体积、加大种子的重量。由于丸粒化种衣剂技术在种子外要包上比较多的物质，所以可以用较多的农药活性物质，甚至还可以用上少量植物营养物质和生长调节物质，使抗病、杀虫、壮苗的效果更好。\n[0004] 种衣剂中活性物质多以化学农药为主，曾经一度使用了一些高毒高残留的化学农药，如呋喃丹、克菌灵等。这样既给生产和使用者带来人身安全问题，也对环境造成污染。生物型的高效低毒种衣剂已成为很多人关注的焦点，但是发展较慢。目前已经得到一定程度认可，并投入生产和应用的生物型种衣剂主要有根瘤菌种衣剂，用于对豆科作物种子包衣；\n用木霉孢子生产的种衣剂，用于对多种蔬菜种子包衣，达到防病壮苗的效果；浙江省种子公司用枯草芽孢杆菌zSB系菌株生产的水稻种子包衣剂，用于防治水稻育秧中的病害。以上\n3种生物型种衣剂均为膜式种衣剂。\n[0005] 枯草芽孢杆菌在自然界中数量非常多，而且不同的菌株有不同的生物活性，可以用在不同的领域或不同的对象。如已经报道有防治水稻纹枯病的枯草芽孢杆菌B-916菌株；防治瓜果、草莓、蔬菜灰霉、白粉病的BS-208菌株；还有用于厨房卫生间除臭的枯草芽孢杆菌BN菌株(日本明治制药)等等。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌，该菌株可作为防治棉花苗期病害的微生物农药。\n[0007] 本发明的另一目的是提供一种含有枯草芽孢杆菌的丸化种衣剂，该丸化种衣剂具有良好的抗病、杀虫、壮苗性能。\n[0008] 本发明的再一目的是提供一种丸化种衣剂在防治棉花苗期病害产品中的应用。\n[0009] 枯草芽孢杆菌BSY2菌株是本发明的发明人从自然界中筛选得到的一株对棉花苗期病害有突出防治效果的枯草芽孢杆菌新发现菌株，该菌株对棉花立枯、棉花炭疽和棉花红腐的抑制能力优于BS-208、B-916等菌株，根据该菌株的特点，本发明研究人员认为它可以作为防治棉花苗期病害的微生物农药加以利用。\n[0010] 本发明首先是在发明人筛选得到枯草芽孢杆菌BSY2菌株基础之上，深入进行的BSY2菌株应用和生产技术研究的成果。\n[0011] 为了实现本发明目的，本发明的一种枯草芽孢杆菌，该菌株为枯草芽孢杆菌BSY2(Bacillus subtilis BSY2)，于2007年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC No.M207086。\n[0012] 本发明所述的枯草芽孢杆菌BSY2的生物学特征：\n[0013] BSY2菌 株 为 杆 状，营 养 体 大 小 为 3.0μm×0.79μm，芽 孢 大 小 为\n1.72μm×0.7μm，周生鞭毛，芽孢位于菌体中间，椭圆形，孢子囊不膨大。革兰氏反应阳性。\n菌落圆形，湿润隆起，边缘缺刻形，淡黄色不透明。液体静止培养产生菌膜和菌环。\n[0014] 本发明所述的枯草芽孢杆菌BSY2对植物病原真菌、细菌具有很强的抗菌活性。\n[0015] 为了便于更广泛的应用枯草芽孢杆菌BSY2，可将枯草芽孢杆菌BSY2制成干粉。制备过程为：先将BSY2菌株进行液体深层发酵，然后进行干燥处理成干粉。\n[0016] 本发明的深层发酵培养采用本领域常规的发酵工艺，如一级发酵工艺、二级发酵工艺等。\n[0017] 干燥处理可采用普通离心式或压力式喷雾干燥塔喷雾干燥。\n[0018] 经检测，本发明所述BSY2菌株母粉中活芽孢数为500×108～1000×108cfu/g。\n[0019] 本发明研究人员以枯草芽孢杆菌BSY2为主要活性成份制成棉花种衣剂，在本发明的包衣剂中BSY2母粉用量以15～30％为好，小于15％抗菌活性有一定的影响，大于\n30％时棉籽发芽常会受到一定的抑制。\n[0020] 本发明所述种衣剂助剂为填料、粘结剂和分散剂。\n[0021] 所述填料为膨润土、硅藻土、高岭土或绢云母粉，使用量为45～75％(填料：种衣剂(W/W))，为重量百分数，下同。\n[0022] 所述粘结剂为羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮或海藻酸钠，使用量3.0～\n20.0％。\n[0023] 所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、NNO等，使用量1.0～7.0％。\n[0024] 本发明所述种衣剂中还可复配化学杀菌剂，如甲基托布津(加入量为0.8～\n4.0％)、多菌灵(加入量为0.3～3.0％)或异菌脲(加入量为0.1～1.0％)，化学杀菌剂的加入可有利于提高本发明种衣剂的防病保苗效果。\n[0025] 为了提高棉籽发芽率，提高棉苗质量，本发明所述种衣剂中还复配植物生长调节剂，比如α-萘乙酸(加入量为0.001～0.006％)或/和赤霉素(加入量为0.001～\n0.01％)。\n[0026] 当BSY2菌株与甲基托布津复配时，本发明的种衣剂的配方：\n[0027] BSY2母粉15～25％，甲基托布津0.8～4.0％，α-萘乙酸0.002～0.006％，赤霉素0.005～0.01％，填料50～65％，粘结剂12～18％，分散剂1.5～5.0％。\n[0028] 优选为，BSY2母粉20～25％，甲基托布津0.8～2.0％，α-萘乙酸0.002～\n0.006％，赤霉素0.005～0.01％，填料50～65％，粘结剂12～18％，分散剂2.0～4.0％。\n[0029] 当BSY2菌株与多菌灵复配时，本发明的种衣剂的配方：\n[0030] BSY2母粉15～30％，多菌灵0.3～3.0％，α-萘乙酸0.002～0.006％，赤霉素\n0～0.008％，填料50～65％，粘结剂10～20％，分散剂1.0～5.0％。\n[0031] 优选为，BSY2母粉18～25％，多菌灵0.5～2.5％，α-萘乙酸0.004～0.006％，赤霉素0.005～0.008％，填料54～65％，粘结剂14～20％，分散剂2.5～5.0％。\n[0032] 当BSY2菌株与异菌脲复配时，本发明的种衣剂的配方：\n[0033] BSY2母粉15～30％，异菌脲0.1～1.0％，α-萘乙酸0.001～0.005％，填料\n45～75％，粘结剂3.0～15.0％，分散剂1.5～7.0％。\n[0034] 优选为，BSY2母粉20～30％，异菌脲0.5～1.0％，α-萘乙酸0.003～0.005％，填料60～75％，粘结剂4.0～10.0％，分散剂2.5～5.5％。\n[0035] 本发明所述的种衣剂可以用于各种棉籽的包衣，防治棉花的苗期病害。\n[0036] 在使用过程中包衣剂的加入量为包衣种子总重量的20～30％(W/W)。\n[0037] 本发明的枯草芽孢杆菌为从自然界中筛选得到的一株对棉花苗期病害有突出防治效果的菌株，该菌株对棉花立枯、棉花炭疽和棉花红腐的抑制能力优于BS-208、B-916等菌株。由该菌株制成的种衣剂可以用于各种棉籽的包衣，防治棉花的苗期病害。\n具体实施方式\n[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。\n[0039] 实施例1\n[0040] 本实施例的种衣剂的配方为：BSY2母粉20.22％，甲基托布津0.93％、α-萘乙酸0.004％，赤霉素0.0091％，硅藻土60.65％，羧甲基纤维素钠16.17％，木质素磺酸钠\n2.02％。\n[0041] 准确称取BSY2母粉20.22公斤(母粉按实验例2制备，活芽孢数900亿cfu/克，细度160目)，甲基托布津(日本曹达株式会社，90％原药，折百计)0.93公斤、木质素磺酸钠2.02公斤、羧甲基纤维素钠16.17公斤、硅藻土60.65公斤、赤霉素9.1克、α-萘乙酸\n4克。先将赤霉素和α-萘乙酸用丙酮200ml充分溶解(丙酮会在后面的生产过程中挥发掉)，然后与4公斤左右BSY2母粉充分混匀，再与甲基托布津充分混匀。然后与剩下的BSY2母粉混匀。通过上述三次预混之后，再将剩下的组成成份木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠和硅藻土充分混匀，过气流粉碎机，粉碎至325目，收集并密封包装备种子包衣用。所得包衣剂产量为95.5公斤。\n[0042] 按包衣质量百分比为24.3％进行包衣。称取包衣剂10公斤，种子31.15公斤，在包衣机内先将棉种用少量水喷湿(总用水量约为种子质量的9％，W/W)，在喷水的过程中一边转动包衣机一边将包衣剂撒下，让其包覆在种子表面。然后用温度控制在40℃以下的热风将包衣之后的丸粒化种子风干，得包衣之后干种子41公斤。\n[0043] 实施例2\n[0044] 本实施例种衣剂生产配方采用：BSY2母粉(活芽孢数500亿cfu/克，细度200目)18.0％，异菌脲0.85％、α-萘乙酸0.003％，膨润土71.20％，聚乙烯吡咯烷酮4.50％，木质素磺酸钠5.45％。\n[0045] 准确称取BSY2母粉18.0公斤，异菌脲0.85公斤、α-萘乙酸0.003公斤，膨润土\n71.20公斤，聚乙烯吡咯烷酮4.5公斤，木质素磺酸钠5.45公斤。\n[0046] 先用无水乙醇4升(乙醇会在后面的生产过程中挥发掉，包衣种子中不含有或只含有微量的乙醇)，充分溶解α-萘乙酸3克和异菌脲850克。再将BSY2母粉与膨润土充分混均匀后再加入上述乙醇溶液，再次充分混匀。最后加入聚乙烯吡咯烷酮和木质素磺酸钠，再次充分混匀，过气流粉碎机，粉碎至325目，本次实施得到包衣剂为95.8公斤。\n[0047] 按包衣质量百分比为23.5％进行包衣。称取种衣剂20公斤，种子65.11公斤，在包衣机上先将用少量水喷湿棉种，但棉籽间不相互粘结，在喷水的过程中将种衣剂逐步撒到种子表面(总喷水量同前)，边撒边转动包衣机，至种衣剂全部包在棉籽表面为止。然后用温度控制在40℃以下的热风将包衣之后的丸粒化种子风干，此次得包衣棉种81.75公斤。\n[0048] 实施例3\n[0049] 本实施例种衣剂生产配方采用：BSY2母粉(活芽孢数1000亿cfu/克，细度120目)18.5％，多菌灵原药(日本曹达株式会社)2.5％、α-萘乙酸0.005％，硅藻土61.00％，羧甲基纤维素钠14.50％，木质素磺酸钠3.5％。\n[0050] 准确称取BSY2母粉18.5公斤，多菌灵2.5公斤、α-萘乙酸0.005公斤，硅藻土\n61.00公斤，羧甲基纤维素钠14.50公斤，木质素磺酸钠3.5公斤。\n[0051] 将α-萘乙酸先用无水乙醇0.5升溶解，充分混匀，然后加到18.5公斤BSY2母粉中充分混匀，再加多菌灵，再混匀。再加入木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠和硅藻土按顺序加入并边加边混，最后过气流粉碎机，粉碎至325目，本次实施得到包衣剂为96.0公斤。\n[0052] 按包衣质量百分比为20.0％进行包衣。称取本实施例的种衣剂22.0公斤，棉花种子88.0公斤，在包衣机上先将用少量水喷湿棉种，但棉籽间不相互粘结，在喷水过程中将种衣剂缓缓加入，边撒边转动包衣机，至种衣剂全部包在棉籽表面为止。然后用温度控制在\n40℃以下的热风将包衣之后的丸粒化种子风干，此次得包衣棉种95.88公斤。\n[0053] 实施例4\n[0054] 本实施例种衣剂生产配方采用：BSY2母粉(活芽孢数800亿cfu/克，细度150目)24.0％，甲基托布津4.0％、α-萘乙酸0.006％，赤霉素0.008％，绢云母粉54.0％，羧甲基纤维素钠14.5％，木质素磺酸钠4.0％。\n[0055] 准确称取BSY2母粉24公斤、甲基托布津4.0公斤、木质素磺酸钠4.0公斤、羧甲基纤维素钠14.5公斤、绢云母粉54.0公斤、赤霉素8克、α-萘乙酸6克。溶解α-萘乙酸和赤霉素的方式同实施例1，预混，混合和粉碎过程也同实施例1，最后得到细度大小等于325目的BSY2包衣剂95.40公斤。\n[0056] 按包衣质量百分比为20.0％进行包衣。称取棉种160公斤装在包衣机上，将上述α-萘乙酸和赤霉素混合的乙醇溶液(约5000ml)用12公斤水稀释，再将上述水溶液均匀地喷洒在棉种表面上，边喷边旋转，使种子表面均匀接受两种生长调节剂溶液。喷湿过程中将40公斤包衣剂分批均匀地撒向包衣机内的种子。边撒边旋转，到将包衣剂全部裹在棉种表面为止，最后用温度控制在40℃以下的热风风干包好的种子。\n[0057] 实施例5\n[0058] 基本制备过程同实施例1，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉15％，甲基托布津2.99％、α-萘乙酸0.005％，赤霉素0.005％，膨润土65％，海藻酸钠12％，木质素磺酸钙5％。\n[0059] 实施例6\n[0060] 基本制备过程同实施例1，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉25％，甲基托布津0.8％、α-萘乙酸0.002％，赤霉素0.01％，高岭土54.688％，聚乙烯吡咯烷酮18％，NNO1.5％。\n[0061] 实施例7\n[0062] 基本制备过程同实施例1，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉18％，甲基托布津2.0％、α-萘乙酸0.004％，赤霉素0.006％，硅藻土65％，海藻酸钠12％，木质素磺酸钠\n2.99％。\n[0063] 实施例8\n[0064] 基本制备过程同实施例2，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉15％，异菌脲\n0.5％、α-萘乙酸0.001％，高岭土74.5％，羧甲基纤维素钠3％，木质素磺酸钙6.999％。\n[0065] 实施例9\n[0066] 基本制备过程同实施例2，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉30％，异菌脲\n1.0％、α-萘乙酸0.005％，膨润土51.495％，聚乙烯吡咯烷酮15％，木质素磺酸钠2.5％。\n[0067] 实施例10\n[0068] 基本制备过程同实施例2，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉20％，异菌脲\n0.1％、α-萘乙酸0.003％，绢云母粉68.497％，海藻酸钠10％，NNO1.5％。\n[0069] 实施例11\n[0070] 基本制备过程同实施例3，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉25％，多菌灵原药0.5％、α-萘乙酸0.006％，硅藻土50％，羧甲基纤维素钠20％，木质素磺酸钠4.494％。\n[0071] 实施例12\n[0072] 基本制备过程同实施例3，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉15％，多菌灵原药3.0％、α-萘乙酸0.004％，硅藻土65％，羧甲基纤维素钠14％，NNO2.996％。\n[0073] 实施例13\n[0074] 基本制备过程同实施例3，不同的是，种衣剂的配方为：BSY2母粉30％，多菌灵原药0.3％、α-萘乙酸0.002％，硅藻土57.198％，羧甲基纤维素钠10％，木质素磺酸钠\n2.5％。\n[0075] 实验例1\n[0076] 本实验例在于研究本发明所述枯草芽孢杆菌BSY2菌株的特性。\n[0077] 1.BSY2菌株的生物学特征\n[0078] BSY2菌 株 为 杆 状，营 养 体 大 小 为 3.0μm×0.79μm，芽 孢 大 小 为\n1.72μm×0.7μm，周生鞭毛，芽孢位于菌体中间，椭圆形，孢子囊不膨大。革兰氏反应阳性。\n菌落圆形，湿润隆起，边缘缺刻形，淡黄色不透明。液体静止培养产生菌膜和菌环。\n[0079] 2.BSY2菌株分类鉴定结果\n[0080] 根据上述生物学特征和表1所列的生物生化特性，认为BSY2菌株与已被中科院微生物所鉴定的枯草芽孢杆菌BS208菌株几乎完全相似，查阅《伯克氏系统细菌学手册》和《芽孢杆菌属》等文献中有关描述，认为所有BSY2的分类鉴定试验结果均与枯草芽孢杆菌相同，故认为BSY2菌株是属于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。\n[0081] 表1BSY2、BS-208菌株的生理生化特征比较\n[0082] \n[0083] 注：“-”表示阴性，“+”表示阳性\n[0084] 3.BSY2菌株的抑菌活性\n[0085] 检测了BSY2菌株对几种植物病原真菌、细菌的抗菌活性，结果见表2，表2中的BS-208菌株为武汉天惠生物工程有限公司登记生产的抗灰霉、白粉病的枯草芽孢杆菌杀菌剂产品“依天得”的生产菌株。B-916菌株是本发明人从市售的B-916菌株产品中分离纯化而得。本试验比较了BSY2菌株与BS-208菌株和B-916菌株的抑菌活性，认为三者之间有较大的区别。\n[0086] 表2BSY2与BS-208和B-916抗菌活性初步比较结果\n[0087] \n[0088] 实验例2\n[0089] 本实验例在于研究本发明所述枯草芽孢杆菌BSY2菌株母粉的制备方法和抑菌活性。\n[0090] 1.BSY2菌株母粉的制备\n[0091] (1)BSY2菌株的液体深层发酵\n[0092] 摇瓶种子培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000mL，消前pH7.2～\n7.4，种子培养基121℃，30分钟湿热杀菌后接种，在29±1℃下摇床培养8～12小时，摇床转速260转/分。\n[0093] 液体发酵培养基：大米粉30g，麸皮15g，MgSO4·7H2O0.03g，FeSO4·7H2O0.002g，ZnSO4·7H2O0.002g，CaCO31.0g，水1000ml，消前pH7.0～7.5。发酵培养基121℃，30分钟湿热杀菌后接种，接种量0.5％～5％。发酵温度29±1℃，通气量1:0.8～1.5(V/v/M)。搅拌转速150～250rpm，至芽孢囊成熟并有20％左右芽孢脱落时放罐收获芽孢。在上述发酵条件下，BSY2菌株发酵周期26～27小时。通过稀释平板计数法测定活芽孢数为(70.0～\n8\n85.0)×10cfu/mL。\n[0094] (2)母粉的制备\n[0095] 取上述过程中收获的BSY2菌株芽孢，按比例加入少量热保护剂(如2％(W/V)轻质碳酸钙)以保护干燥过程中芽孢的活性和提高收率。用普通离心式或压力式喷雾干燥塔喷雾干燥。工作时进口风温为170～190℃，出口风温为70～80℃。喷雾干燥得到的干粉\n8\n即为BSY2菌株的母粉，用平板计数法测得母粉中有活芽孢数为(500～1000)×10cfu/g。\n[0096] 2.BSY2母粉抑菌活性\n[0097] 采用对峙培养法在PDA培养基平板上测定BSY2母粉对棉花立枯、炭疽、红腐三种病原菌的抑菌活性。测定时温度为28℃，培养时间为48～72小时(因病原菌而异)。用\n2 3 4 5 6 7 8\n无菌蒸馏水将BSY2母粉梯度稀释为50、10、10、10、10、10、10、10 倍，共8个浓度。于无菌的双层干滤纸片上滴上述母粉稀释液5μl，然后将接了菌的滤纸片贴在PDA平板上，在距滤纸片30mm处接种指示菌。每个浓度处理做4次重复。当对照处理刚长满整个平皿时检查结果，测量BSY2菌落的大小和抑菌圈的大小。表3列出了BSY2母粉8种浓度对不同病原真菌的抑菌圈大小。可以看出，本发明中BSY2母粉保持了良好的抑菌活性。\n[0098] 表3BSY2母粉对棉花立枯病菌，炭疽病菌和红腐病菌的抑菌活性试验结果[0099] \n[0100] \n[0101] 实验例3\n[0102] 本实验例在于研究本发明所述种衣剂的性能指标。\n[0103] 按农业部农药检定所制定的《有关种衣剂的产品指标的规定》中所述主要指标及