光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在大菱鲆养成中的应用

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光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在大菱鲆养成中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及菌类及其应用，特别涉及光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液及其在大菱鲆养成过程中的应用。\n背景技术\n[0002] 大菱鲆，性格温顺，体形优美，肌肉丰厚白嫩，骨刺少，内脏团小，出肉率高，鳍边和皮下含有丰富的胶质蛋白，口感良好，风味独特，深受消费者喜爱。大菱鲆集群性强，相互间没有残食现象，故适合于高密度养殖。在一个有限的水体环境中放养大量的多宝鱼，大量投喂高蛋白饲料，残饵加上鱼自身的排泄物，池塘内淤积大量的有机物，超过了水体的自净能力，造成水质恶化，病原微生物大量孳生，致使大菱鲆发病，养殖水体的生态环境遭到破坏。\n为防治鱼病而施放的抗生素在杀灭病原微生物的同时，也将水体内的有益菌杀死。由于没有从根本上杜绝病原微生物的发生，致使鱼病频繁发生。加上反复使用抗生素，导致病原微生物的抗药性增加，又给病害防治工作带来了困难。养殖池大量换水直接对受纳环境造成污染；而按照相关标准的要求对养殖废水进行处理，又需要较高的投资，使养殖成本增加。\n为了解决多宝鱼的药残问题及水质问题，给养殖户找到好的防病治病及改善水质的办法与途径，给消费者提供放心无公害水产品，使用生物防治方法具有强大的优越性。\n[0003] 光合细菌，广泛分布于湖泊、池塘、水田、河川、海洋及湿润土壤中。能以养殖水体中的有机物为碳源进行光合作用，起到净化水质、抑制病原微生物生长繁殖和提高水产动物免疫力的作用。光合细菌菌体蛋白质含量高，并含有大量促进鱼虾生长的活性因子，如生物素、维生素、β-类胡萝卜素等，可明显促进养殖生物的生长发育，缩短养殖周期。\n[0004] 枯草芽孢杆菌属于对人畜无毒无害的细菌，在自然界分布广泛，国内外均允许将其用于饲料添加剂。枯草芽孢杆菌在水中增殖后产生的许多胞外酶能把养殖水体、底泥中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机质分解，从而达到降低养殖水体富营养化和减少底泥生成的作用。具有生长速度快、抗逆性好、稳定性强及能有效抑制有害菌生长等特点，其在水产中的应用具有极大的潜力和优势。\n[0005] 用光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液促进大菱鲆生长、提其高免疫力，兼具两者的优势，使得这一混合菌液适合作为促进大菱鲆生长、提高鱼类免疫、成活率的混合菌液及其环境中致病菌的生物净化因子，从而克服了抗生素滥用带来的副作用和对养殖废水进行处理的高成本，为人类提供了安全、绿色、无公害的水产养殖模式。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的在于克服现有微生物制剂不能同时促进大菱鲆的生长、提高免疫力及其改善水质的不足之处，提供一种光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在在大菱鲆养成中的应用。\n[0007] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：\n[0008] 光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在在大菱鲆养成中的应用。\n[0009] 所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液中光合细菌和枯草芽孢杆菌细菌数之比为1∶1。\n[0010] 所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC1.2193)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris，CGMCC1.2352)或荚膜红细胞(Rhodobacter capsulatus，GIM1.168)中的至少一种。\n[0011] 所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Cohn，GIM1.136)。\n[0012] 所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在大菱鲆养成中的应用是将光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液泼洒于水体中，使水体中光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液终浓度\n7\n为10-10cfu/mL。\n[0013] 所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在在大菱鲆养成中的应用是将饲料用浓\n7\n度为10-10cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡15～45min。\n[0014] 本发明利用光合细菌和枯草芽孢杆菌净化水质、抑制病原微生物生长繁殖、提高水产动物免疫力及促进水产动物的生长，从而实现促进大菱鲆生长、提高免疫力的目的。\n[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：\n[0016] 1、本发明所述混合菌液在改善水质及控制养殖环境中病害菌中效果显著，同时全池换水时间可延长至40天一次，大大降低了养殖成本。\n[0017] 2、本发明能提高养殖生物的成活率、体重增长率、体长增长率及提高鱼类免疫力。\n[0018] 3、本发明所述微生物制剂在水产动物养殖的应用中安全性好。\n[0019] 利用光合细菌和枯草芽孢杆菌对病原菌的拮抗作用、利用水产养殖环境中的有机物质、产生一些有利于水产动物生长的活性因子而达到改善水质及促进水产动物生长的方法属于生物方法，从而克服了药物滥用带来的副作用\n[0020] 4、本发明所述的混合菌液有效、环保、不产生病原菌抗性，应用前景良好。\n具体实施方式\n[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。\n[0022] 实施例1 光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液制备\n[0023] (1)光合细菌菌液的制备\n[0024] 浓度为109cfu/mL的红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1.2193，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)按培养基体积的0.1％接种到优化RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为3000lx下光照厌氧培养48h后得到的菌液按培养基体积的10％接种入优化的RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48h，然后6000rpm离心15min获得菌体，往菌\n12\n体中加入无菌的磷酸盐缓冲液可得到浓度为10 cfu/mL的光合细菌菌液。\n[0025] (2)枯草芽孢杆菌菌液的制备\n[0026] 浓度为109cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Cohn，GIM1.136，购于广东省微生物研究所)按培养基体积的0.1％接种到营养肉汤培养基中，于37℃、250rpm摇床活化培养18h，得到的菌液按培养基体积的10％接种入营养肉汤培养基中，置于37℃、\n250rpm摇床培养24h，然后6000rpm离心15min获得菌体，往菌体中加入无菌的磷酸盐缓冲\n12\n液可得到浓度为10 cfu/mL的光合细菌菌液。\n[0027] (3)将光合细菌浓缩液与枯草芽孢杆菌菌液按细菌数1∶1混合。\n[0028] 实施例2大菱鲆养殖实验\n[0029] 每个大菱鲆养殖水池大菱鲆5000尾(大菱鲆来源于山东省某鱼场)，大菱鲆均重\n25±0.5g，水温为25℃。\n[0030] 平均分为A-D共4个试验组，B、C、D每个试验组有8个小组，分别为B1、C1、D1；\nB2、C2、D2；B3、C3、D3；B4、C4、D4；B5、C5、D5；B6、C6、D6；B7、C7、D7；B8、C8、D8；B1-D8每小组再分为4组，即B11-B14…D81-D84，每组2个重复。对4组试验鱼初始体重进行方差整齐性检验，组间差异不显著(P＞0.05)。五组试验组的处理如下：\n[0031] A组：工厂生产的养殖方式(对照组)。\n[0032] B组：在水中泼洒光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合体菌液，使水体中光合细菌和\n3 5 7\n枯草芽孢杆菌混合菌液浓度分别达到10、10、10、10cfu/mL，喂食普通饲料。\n[0033] C组：在水中投放经浓度为10、103、105、107cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液浸泡后的饲料。\n[0034] D组：在水中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使菌体浓度达到分别达到\n3 5 7 3 5 7\n10、10、10、10cfu/mL，同时分别投放经浓度为10、10、10、10cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡后的饲料。\n[0035] B1、C1、D1组每5天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0036] B2、C2、D2组每10天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0037] B3、C3、D3组每15天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0038] B4、C4、D4组每20天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0039] B5、C5、D5组每25天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0040] B6、C6、D6组每30天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0041] B7、C7、D7组每35天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0042] B8、C8、D8组每40天全池换水一次，换水后重新加菌\n[0043] B11、C11、D11…D81投放的菌液浓度为10cfu/mL\n[0044] B12、C12、D12…D82投放的菌液浓度为103cfu/mL\n[0045] B13、C13、D13…D83投放的菌液浓度为105cfu/mL\n[0046] B14、C14、D14…D84投放的菌液浓度为107cfu/mL\n[0047] 即B11-B14…D81-D84，每组2个重复。\n[0048] 所用饲料符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限量》(NY5072-2002)的规定。\n[0049] 试验结束测定养殖池的水质情况、鱼的生长指标及免疫指标。\n[0050] I水质检测\n[0051] 水质检测包括：氨态氮，亚硝酸盐氮，COD的检测。\n[0052] 氨态氮用次溴酸纳氧化法法测定(GB12763.4-91)；亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763.4-91)；COD用碱性高锰酸钾法测定(HY003.4-91)。\n[0053] 表一 水质的检测\n[0054] \n[0055] \n[0056] 表二 水质的检测\n[0057] \n[0058] \n[0059] 表三 水质的检测\n[0060] \n[0061] 表四 生长水质的检测\n[0062] \n[0063] 表一至表四中的水质数据符合中华人民共和国海水水质标准(GB3097-1997)第二类：适用于水产养殖，与A组相比，B、C、D组的氨态氮、亚硝酸盐氮、COD都有不同程度的降低。其中B、C、D组的氨态氮至少降低了29.32ug/L；亚硝酸盐氮至少降低了15.24ug/L；\n7\nCOD至少降低了5.449mg/L。在水中或者是在饲料中添加浓度为10-10cfu/mL光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合体菌液，全池换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对氨态氮、亚硝酸盐氮、COD影响不大，都能达到改善水质的目的。\n[0064] 由此可见，无论在水中还是在饲料中添加浓度为10-107cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合液，能够达到提高鱼的免疫力、促进摄食和快速生长的目的，并且能够降解氨氮、抑制水中的致病菌、减少换水频率，全池换水时间可以延长至40天一次，从而达到改善水质，节省成本，提高经济效益，促进养殖业的快速发展。\n[0065] II鱼的生长指标\n[0066] 鱼的生长指标包括：大菱鲆成活率、增重率、鱼体长增长率。\n[0067] 鱼体长度测定采用精密度为1mm的游标卡尺度量，体长为鱼的吻端到脊椎骨最下端之间的距离。体重采用电子天平称量。\n[0068] 试验生长指标按如下公式计算：\n[0069] 成活率(％)＝结束时大菱鲆数目×100/初始时大菱鲆数目\n[0070] 体重增长率(％)＝(结束时鱼的体重-初始时鱼的体重)×100/(初始时鱼的体重)；\n[0071] 体长增长率(％)＝(结束时鱼体长-初始时鱼体长)×100/(初始时鱼体长)；\n[0072] 表五 生长指标的检测\n[0073] \n[0074] 表六 生长指标的检测\n[0075] \n[0076] 表七 生长指标的检测\n[0077] \n[0078] \n[0079] 表八 生长指标的检测\n[0080] \n[0081] 从表五至表八中可以看出，与A组相比，B、C、D组的成活率、增重率、体长增长率都有明显的提高。其中B、C、D组的成活率至少分别增加了15.84％、17.03％、18.58％；增重率至少分别增加了255.9％、334.5％、413.85％；体长增长率至少分别提高了9.73％、\n7\n12.76％、15.66％。在水中或者是在饲料中添加浓度为10-10cfu/mL光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，全池换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对成活率、增重率、体长增长率影响不大，都能达到促进摄食和生长的目的。\n[0082] 因此，无论是在水中还是饲料中添加浓度为10-107cfu/mL光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，全池换水时间长达40天一次都会促进大菱鲆的摄食和快速生长。且D组效果最好。\n[0083] III免疫指标的检测\n[0084] 免疫指标包括：溶菌酶活力、酚氧化酶(PO)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力。\n[0085] 1、溶菌酶活力测定(Ellis A E.Lysozyme assays.[M]//Stolen JS，Fletcher T C，Anderson D P，et al.Techniques in Fish ImmunologyI.USA：SOS Publications，1990：\n101-103.)。\n[0086] 将 5μl血 清 加 入 3mL 浓 度 为 0.2mg/mL 溶 壁 微 球 菌 (Micrococcus lysodeikticus)菌液中，置722型分光光度计中(波长540nm)，分别在0.5min和4.5min后记录吸光值。以1min内吸光值下降0.001为一个活性单位(U)，计算公式为：溶菌酶活力(U/mL)＝1000×(OD1-OD2)/4×5×0.001。\n[0087] 2、酚氧化酶(PO)活力的测定\n[0088] 酚氧化酶活性测定采用Hernández-López等(Hernández-López J，Gollas-Galvan T.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidasesystem of the brown Penaeus californiensis Holmes[J].Comp BiochemPhysiol，1996.113C：61-66.)的方法。\n以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0.001，定义为1个酶活性单位(U)。\n[0089] 3、超氧化物歧化酶(SOD)活力\n[0090] 超氧化物歧化酶(SOD)活力按邓碧玉等改进的连苯三酚自氧化法进行。(邓碧玉，袁勤生，李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化学与生物物理展，1991，18(2)：163～163)\n[0091] 活性单位定义为每mL血清中超氧化物歧化酶活力抑制率达到50％所对应的超氧化物歧化酶量为1个酶活性单位。\n[0092] 表九 免疫指标\n[0093] \n[0094] 表十 免疫指标\n[0095] \n[0096] \n[0097] 表十一 免疫指标\n[0098] \n[0099] 表十二 免疫指标\n[0100] \n[0101] 从表九至表十二中可以看出，与A组相比，B、C、D组的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力都有明显的提高。其中B、C、D组的溶菌酶活力至少分别增加了23.42U/mL、34.13U/mL、42.74U/mL；超氧化物歧化酶活力至少分别增加了102.5U/mL、\n188.49U/mL、213.55U/mL；酚氧化酶活力至少分别增加了14.03U/mL、18.05U/mL、22.63U/\n7\nmL。在水中或者是在饲料中添加浓度为10-10cfu/mL光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，全池换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力影响不大，都能达到提高免疫力的目的。\n[0102] 试验结果表明，B、C、D组的养殖方式能够达到提高鱼的免疫力、促进摄食和快速生长的目的，且E组效果最佳，成活率高达100％。即：无论在水中还是在饲料中添加浓度为\n7\n10-10cfu/mL光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，全池换水时间长达40天一次，都能够显著提高大菱鲆的成活率、增重率、体长增长率等生长指标，同时还能明显改善养殖池中的水质，在水中和饲料中同时添加，效果更佳。换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对成活率、增重率、体长增长率均无明显影响。