用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和植物乳杆菌

1.用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌的应用，将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)F-08、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)V9和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HM-20进行混菌固态发酵培养，制备豆粕发酵制品，其特征在于：所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)F-08、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HM-20和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)V9，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.6735、CGMCC No.6744和CGMCC No.5470。
2.用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌的使用方法，其特征在于包括下列步骤：将干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9进行混合固态发酵，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)F-08、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HM-20和动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)V9，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.6735、CGMCC No.6744和CGMCC No.5470；所述干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20种子培养基为：棉籽糖2％，豆粕1％，加水至100％，pH7.0-7.2；固态发酵培养基：58％豆粕，2％的糖，水分含量40％；
所述干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20的种子培养条件：干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20置于恒温箱中静置培养，动物双歧杆菌V9置于厌氧恒温箱中静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h；
所述固态发酵培养条件为：干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9接
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种量分别为4％、6.0％和4％，发酵的益生菌活菌数在10 cfu/g以上。
3.根据权利要求2所述的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌的使用方法，其特征在于：在干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9混合发酵过程中，pH呈缓慢下降趋势，pH变化范围为5.1-6.5。
4.根据权利要求2所述的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌的使用方法，其特征在于：干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9混菌发酵，经过48h发酵后，游离氨基态氮含量可达到262.1umol/g，与单菌发酵相比小肽含量增加35％，大肽减少12.3％。

用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧\n杆菌和植物乳杆菌\n技术领域\n[0001] 本发明属于饲料添加剂益生菌固体发酵领域，尤其是一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌，应用于动物饲料添加剂方面。\n背景技术\n[0002] 目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。\n发明内容\n[0003] 本发明目的在于采用干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20进行混合固态发酵豆粕，提供一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌。\n[0004] 本发明是通过下述技术方案实现的：\n[0005] 用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和植物乳杆菌，其特征在于：所述干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）F-08、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）HM-20和动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）V9均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.6735、CGMCC No.6744和CGMCC No.5470，其中，干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20保藏日期为\n2012年10月29日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路；动物双歧杆菌V9保藏日期为2011年11月18，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。\n[0006] 用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和植物乳杆菌的应用，其特征在于：将所述干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20进行混菌固态发酵培养，得到益生菌的固态发酵豆粕产品。\n[0007] 用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和植物乳杆菌和动物双歧杆菌的使用方法，其特征在于包括下列步骤：\n[0008] 将干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9进行混合固态发酵，[0009] 所述干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20种子培养基为：棉籽糖2%，豆粕1%，加水至100%，pH7.0-7.2。固态发酵培养基：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%。\n[0010] 所述干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20的种子培养条件：干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20置于恒温箱中静置培养，动物双歧杆菌V9置于厌氧恒温箱中静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。\n[0011] 所述固态发酵培养条件为：干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20接种量分别为4.0%、6.0%和4.0%。\n[0012] 在发酵初期，干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20以初始pH6.5进行混合发酵，pH呈缓慢下降趋势，pH最小值为5.10，\n[0013] 在干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20混合发酵48h后，其游离氨基态氮含量为：262.1umol/g。\n[0014] 干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20混合发酵，在发酵48h后，小肽（<1000Da）含量增加了35.7%，大肽（>10000Da）减少了11.3%。\n[0015] 本发明的优点和积极效果：\n[0016] 1.本发明中采用干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20进行混合固态发酵豆粕。\n[0017] 2.本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作，可广泛应用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵技术；\n[0018] 3.采用干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20进行发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，使豆粕发酵产品更容易为消费者所接受；\n[0019] 4.采用干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20发酵豆粕，可以使豆粕中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。\n附图说明:\n[0020] 图1为干酪乳杆菌F-08接种量对活菌数影响的示意图；\n[0021] 图2为动物双歧杆菌V9接种量对活菌数影响的示意图；\n[0022] 图3为植物乳杆菌HM-20接种量对活菌数影响的示意图；\n[0023] 图4为本发明在固态发酵时，时间对动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数影响的示意图；\n[0024] 图5为动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20进行混菌固态发酵时，氨基态氮含量随时间变化的示意图；\n[0025] 图6为动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20进行混菌固态发酵\n48h后，不同多肽分子量百分含量的示意图。\n具体实施方式\n[0026] 下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。\n[0027] 用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和植物乳杆菌，干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9，分类名称分别为Lactobacillus casei F-08、Bifidobacterium animalis V9和Lactobacillus plantarum HM-20，三株菌中干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20，于2012年10月29日，而动物双歧杆菌V9于2011年11月18日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：\n中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。\n[0028] 用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌的使用方法，包括下列步骤：\n[0029] 1.菌体的种子液制备\n[0030] 将干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌V9从冻藏的甘油管中接到装有液体种子的培养基中，所述干酪乳杆菌F-08、动物双歧杆菌V9和植物乳杆菌HM-20的种子培养条件：干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20置于恒温箱中静置培养，动物双歧杆菌V9置于厌氧恒温箱中静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。其中液体种子培养基（g/L）为：棉籽糖20，豆粕10，pH7.0-7.2。\n[0031] 2.固态发酵\n[0032] 将动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20分别以6%、4.0%和4.0%的接种量接菌到湿灭好的豆粕培养基，密封之后置于恒温培养箱静置培养。\n[0033] 固态发酵培养基为：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。\n[0034] 3.测定活菌数\n[0035] 一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。\n[0036] 4.pH值的测定\n[0037] 称取10g发酵后的豆粕产品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。\n[0038] 5.氨基态氮含量的测定\n[0039] 取10g发酵后的豆粕，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入\n5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。\n[0040] 6.豆粕多肽分子量测定\n[0041] 取10g发酵后的豆粕，匀浆器破碎后，将所得发酵物用5倍无菌生理盐水在4℃浸提4h，在4500r/min条件下离心取上清液，冷冻干燥取粉末，另有未接种固态发酵物作为空白对照。\n[0042] 色谱条件\n[0043] 色谱柱：GE SuperdexTM Peptide 10/300GL（10×300nm）；\n[0044] 流动相：50mM磷酸盐缓冲溶液（pH为7.2，并含有0.15MNacl）；\n[0045] 柱压：小于18bar；\n[0046] 流速：0.5ml/min；\n[0047] 检测波长：214nm\n[0048] 柱温：室温\n[0049] 进样量：10ul。\n[0050] 7.发酵制品的包装\n[0051] 豆粕发酵制品存在大量的活菌，因此豆粕发酵产品必须进行封口包装，并于低温保藏，保质期大约为6个月。\n[0052] 以下是对以豆粕为基质的益生菌发酵产品的生产方法的一些参数的确定，以及一些培养条件的优化。\n[0053] 一、动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20最佳接种量[0054] 固态发酵培养基为：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。\n[0055] 动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的接菌量为1%、4%和6%时，培养温度37±1℃，培养时间28h。1%接种量时，发酵制品中动物双歧杆菌V9、干酪乳杆\n7 8 8\n菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数分别为3.8×10cfu/g、1.6×10cfu/g和2.3×10cfu/g；4%接种量时，发酵制品中动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活\n7 8 8\n菌数分别为3.4×10cfu/g、2.1×10cfu/g和2.8×10cfu/g；6%接种量时，发酵制品中\n7\n动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数分别为4.1×10cfu/g、\n8 8\n1.3×10cfu/g和1.4×10cfu/g（参见图1、图2、图3）。\n[0056] 结论：动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的最适接种量分别为6%、4%和4%。\n[0057] 二、最佳浸泡水pH的选择\n[0058] 浸泡水的pH分别为6.0、6.5和7.0时，动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的种量分别为6%、4%和4%时，培养温度37±1℃，培养时间32h。测得浸泡水的pH为6.0时，发酵制品中动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活\n7 8 8\n菌数分别7.8×10cfu/g、3.5×10cfu/g和5.6×10cfu/g；浸泡水的pH为6.5时，发酵制\n7\n品中动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数分别为8.9×10cfu/\n8 8\ng、5.4×10cfu/g和6.9×10cfu/g；浸泡水的pH为7.0时，发酵制品中动物双歧杆菌V9、\n7 8\n干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数分别为7.9×10cfu/g、4.7×10cfu/g和\n8\n3.6×10cfu/g。\n[0059] 结论：当浸泡水的pH为6.5时，动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的活菌数最高。\n[0060] 三、动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20混合发酵对活菌数的影响\n[0061] 动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20分别以6%、4%和4%的不同接种量进行三株菌复配，浸泡水pH为6.5，培养温度37±1℃，培养32h，测得动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的接种量分别为6%、4%和4%时，发酵制品中动\n7\n物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数最高，分别为8.52×10cfu/\n9 9\ng、7.24×10cfu/g和9.56×10cfu/g。\n[0062] 结论：动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20混合发酵时，其最适接种量分别为6%、4%和4%。\n[0063] 四、最佳固态发酵时间的选择\n[0064] 固态发酵培养基为：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。\n[0065] 动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20接种量分别为6%、4%和4%，浸泡水pH6.5，培养温度37±1℃，培养时间48h，分别于28h、36h和48h取样测定活菌数。\n发酵28h时，发酵制品中动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数分\n7 8 8\n别为4.2×10cfu/g、3.8×10cfu/g和4.7×10cfu/g；发酵36h时，发酵制品中动物双歧杆\n7 9\n菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20活菌数分别为8.52×10cfu/g、7.24×10cfu/\n9\ng和9.56×10cfu/g；发酵48h时，发酵制品中动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳\n8 9 10\n杆菌HM-20活菌数分别为1.32×10cfu/g、9.86×10cfu/g和1.24×10 cfu/g（参见图4、图5、图6）。\n[0066] 结论：当动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20混菌发酵时，最适发酵时间为48h。\n[0067] 综上所述，动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20混合菌株的种量分别为6%、4%和4%，浸泡水pH为6.5，培养温度37±1℃，培养时间48h，测得活菌数较高，\n8\n测动物双歧杆菌V9、干酪乳杆菌F-08和植物乳杆菌HM-20的活菌数分别为1.32×10cfu/\n9 10\ng、9.86×10cfu/g和1.24×10 cfu/g。