简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法

1.一种简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于，其具体技术解决方 案是：
(1)配制10％～20％乙二醇(EG)溶液：取1～2ml乙二醇溶液+9～8ml PBS 充分混合即成；
(2)配制EFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成21％～18％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.35Mol/L～0.3Mol/L (FS液中蔗糖的含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇相 应按7∶3～6∶4的比例(V/V)混合后制成EFS30～EFS40玻璃化溶液；
(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％EG溶液中预 处理5～10min，然后移入含有EFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封 口即投入液氮中冷冻保存；
(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物， 在显微镜下回收胚胎。
2.根据权利要求1所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于， 其中所采用的抗冷冻保护剂乙二醇(EG)可由丙三醇(GL)代替，则其技术 方案为：
(1)配制10％～20％丙三醇(GL)溶液：取1～2ml丙三醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；
(2)配制GFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成30％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.5Mol/L(FS液中蔗糖的 含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL)按5∶5的 比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；
(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％6L溶液中预处 理5～10min，然后移入含有GFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口 即投入液氮中冷冻保存；
(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s中解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物， 在显微镜下回收胚胎。
3.根据权利要求1所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于， 其具体技术解决方案可以是：
(1)配制10％乙二醇(EG)溶液：取1ml乙二醇溶液+9ml PBS充分混 合即成；
(2)配制EFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成21％和0.35Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇 按7∶3的比例(v/v)混合后制成EFS30玻璃化溶液；
(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％EG溶液中预处理5min， 然后移入含有EFS30即玻璃化溶液的细管中平衡30s，封口即投入液氮中冷冻 保存；
(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显 微镜下回收胚胎。
4.根据权利要求2所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于， 其具体技术解决方案可以是：
(1)配制10％丙三醇(GL)溶液：取1ml丙三醇溶液+9ml PBS充分混合 即成；
(2)配制GFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70，000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL) 按5∶5的比例(V/V)混合后制成6FS50玻璃化溶液；
(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％GL溶液中预处理5min， 然后移入含有GFS50玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中 冷冻保存；
(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微 镜下回收胚胎。

技术领域\n本发明涉及一种胚胎冷冻解冻方法，特别是用于哺乳动物的胚胎冷冻解 冻方法，属胚胎生物技术领域。\n技术背景\n1972年Whittingham等首先利用小鼠2～8细胞胚胎冷冻保存(传统冷冻 法)成功并移植后获得后代，他们采用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide：DMSO) 为主体抗冻保护剂，浓度为1.5Mol/L，使用降温冷冻仪，以-0.3℃/min的 速度降至-30℃～-35℃，然后再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液 氮中。冷冻解冻后胚胎成活率为50％～70％，妊娠率为65％，产仔率为48 ％。该技术所使用的降温冷冻仪约4万美元/台，费用昂贵，且整个冷冻程序 需3小时，操作时间长、效率低，更不适应于边远牧区的胚胎冷冻。\n1985年Rall等又发明了胚胎玻璃化冷冻方法，他们利用DMSO，乙酰胺 (Acetamide)丙二醇(Propylene glycol)为主体的抗冻保护剂，配制成浓 度高达6Mol/L的玻璃化溶液(VS液)，不使用降温冷冻仪，在室温下对小鼠 2细胞、8细胞和桑椹胚进行冷冻保存，该方法需要分三步降温(22℃下胚胎 于25％VS液中平衡15min，4℃下于50％VS液中平衡10min，4℃下于100％ VS液中平衡10min)，整个程序需要35min。该技术由于所用抗冻保护剂对胚 胎的化学毒性较大，冷冻后胚胎的成活率不稳定(46％～95％)，产仔率较低 (22％～38％)。\n发明内容\n本发明的目的是要提供一种速度快、成本低、操作简单、效率高的胚胎冷 冻解冻方法。\n为了达到本发明的目的，本发明者首先对几种抗冻保护剂进行筛选，通 过对胚胎的毒性试验及胚胎细胞膜的通透性测定，证明乙二醇(Ethylene glycol：EG)的化学毒性最小且通透性强，其次是丙三醇(Glycerol：GL)、丙 二醇、DMSO、乙酰胺。为此，发明者以乙二醇(或丙三醇)为主体抗冻保护 剂，添加大分子物质聚蔗糖和蔗糖配制成EFS(或GFS)液，其浓度大于 7.0Mol/L。为避免其对胚胎的化学毒性伤害，冷冻前将胚胎在浓度为10～20 ％EG(或GL)溶液中预处理5～10min，再移入EFS(或GFS)溶液中平衡30s～ 1min后直接投入液氮即二步法冷冻保存。目的是既能使抗冻保护剂乙二醇(或 丙三醇)较为缓和地透入胚胎细胞内部，又能在冷冻的瞬间形成玻璃化状态。 本方法冷冻保存的小鼠原核胚～孵化囊胚，其成活率均能达到95％左右，并 获得了较高的移植妊娠率(60～75％)。本方法对其他家畜如兔、牛和绵羊胚 胎的冷冻保存也获得了基本相同的效果。\n本发明的具体技术解决方案是：\n(1)配制10％～20％乙二醇(EG)溶液：取1～2ml乙二醇溶液+9～8ml PBS 充分混合即成；\n(2)配制EFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成21％～18％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.35Mol/L～0.3Mol/L (FS液中蔗糖的含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇相 应按7∶3～6∶4的比例(V/V)混合后制成EFS30～EFS40玻璃化溶液；\n(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％EG溶液中预 处理5～10min，然后移入含有EFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封 口即投入液氮中冷冻保存；\n(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物， 在显微镜下回收胚胎。\n上述技术解决方案中所采用的抗冷冻保护剂乙二醇(EG)可由丙三醇(GL) 代替，则其技术方案为：\n(1)配制10％～20％丙三醇(GL)溶液：取1～2ml丙三醇溶液+9～8ml PBS 充分混合即成；\n(2)配制GFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成30％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.5Mol/L(FS液中蔗糖的 含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL)按5∶5的 比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；\n(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％GL溶液中预处 理5～10min，然后移入含有GFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口 即投入液氮中冷冻保存；\n(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s中解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物， 在显微镜下回收胚胎。\n在上述的技术解决方案中，其步骤(3)的冷冻过程中所用的细管为0.25ml 塑料细管。\n本发明具有如下优点：\n(1)速度快：改变传统冷冻方法的时间长、速度慢，即由一个冷冻程序3h 缩短为30s；\n(2)降低成本、操作简单：传统方法中使用降温冷冻仪(约4万美元/台) 冷冻胚胎，改为室温(20～25℃)下徒手操作；\n(3)无冰晶：传统冷冻方法有冰晶生成，本方法无冰晶生成，即呈玻璃化 状态，主要是使用了高分子物质聚蔗糖(WF：70,000)，可避免冰晶对胚胎的 物理性损伤；\n(4)适用范围广：传统的方法需要在实验室内进行，本方法可在现场操作， 特别是在无电和边远牧区更为实用；\n(5)效率高：与传统的方法相比，本方法用EFS冷冻后胚胎成活率(94％～ 100％)、移植妊娠率(66％～75％)和产仔率(56％～66％)可提高5％～10 ％。用GFS冷冻后胚胎成活率为92％，移植妊娠率为60％，产仔率高达74％。\n附图说明\n图1为本发明的胚胎玻璃化冷冻方法的实施例示意图；\n图2为本发明的胚胎玻璃化解冻方法的实施例示意图。\n实施例\n下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。\n如图1所示，将胚胎于PBS液中洗净，用巴氏吸管将胚胎移入10％的EG (或GL)液中，在20～25℃室温下预处理5min，然后将胚胎移入含有EFS(或 GFS)液和蔗糖溶液的0.25ml塑料细管的EFS(或GFS)液段中平衡30s，用 封口粉封口即投入液氮，移入液氮罐中保存。\n如图2所示，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴 中，约10s解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收 胚胎，并将回收的胚胎移入新鲜0.5Mol/L蔗糖溶液中，再将胚胎移入PBS液 中洗净后培养。以上冲洗、回收、移入步骤在5min内完成。\n下面是本发明简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，的两个具体实施例：\n例1：(1)配制10％乙二醇(EG)溶液：取1ml乙二醇溶液+9ml PBS充 分混合即成；\n(2)配制EFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成21％和0.35Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇 按7∶3的比例(v/v)混合后制成EFS30玻璃化溶液；\n(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％EG溶液中预处理5min， 然后移入含有EFS30或EFS40即玻璃化溶液的细管中平衡30s，封口即投入液 氮中冷冻保存；\n(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显 微镜下回收胚胎。\n例2：(1)配制10％丙三醇(GL)溶液：取1ml丙三醇溶液+9ml PBS充 分混合即成；\n(2)配制GFS玻璃化溶液：将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用 PBS稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL) 按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；\n(3)冷冻：在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％GL溶液中预处理5min， 然后移入含有GFS50玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中 冷冻保存；\n(4)解冻：需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～ 25℃水浴中，约10s解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微 镜下回收胚胎。