一种甘蓝型油菜组织培养的光源控制方法

1.一种甘蓝型油菜组织培养的光源控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）不定芽分化阶段：切取带有部分叶柄的0.5厘米的子叶，先在添加0.1 mg/L 2,4-D的MS培养基中光强为0的条件下暗培养2天；然后转入添加0.8 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA和1.0 mg/L AgNO3的MS培养基中，蓝光与红光比例为3:1的LED光源下培养15天，培-2 -1
养光强为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃；
2）不定芽增殖阶段：切取丛生芽转入MS培养基中，蓝光与红光比例为3:1的LED光源-2 -1
下培养15天，培养光强为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃；
3）幼苗光质处理阶段:切取一叶一心的幼苗，接入含0.5 mg/L NAA的MS培养基中，先在荧光灯下培养5天，然后转入蓝光与红光比例为3:1的LED光源下培养35天，所有培养-2 -1
的光强为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述光源是由长为105个发光二极管灯头和宽为30个发光二极管灯头组成的长方形发光二极管光源，由一个变压器APR1510H来控制电压0-2.2伏和电流0-20毫安，从而调控光强的大小要求。

一种甘蓝型油菜组织培养的光源控制方法 \n[0001] 一、技术领域 \n[0002] 本发明涉及一种甘蓝型油菜组织培养光源的控制方法，属于生物技术领域。\n[0003] 二、背景技术 \n[0004] 植物培养中使用的光源一般是荧光灯、金属卤化物灯、高压钠灯和白炽灯。然而这些光源的光谱能量分布是依据人眼对光的高效需求原则设计生产的，含有很多不必要的波长，光效很低。同传统的光源相比，近年来发光二极管（LED）作为一种可用于植物照明的新型半导体光源日益受到关注。LED的基本结构是一块电致发光的半导体材料，置于一个有引线的架子上，四周用环氧树脂密封，起到保护内部芯线的作用。LED波宽窄，光色纯，波长种类丰富，与植物光合作用和形态建成的光谱范围吻合。LED还具有较小的质量和体积、较长的寿命，调节其频率和占空比可以节省能源和提高光合效率。由于这些显著的特征，LED光源适合应用于可控环境中的植物培养或栽培，如植物组织培养、设施园艺与工厂化育苗和航天生态生保系统等。\n[0005] 用于植物栽培的LED光源表现以下优势：LED光输出半波宽窄，接近单色光，单独使用或组合使用均可，使用LED光源可以集中特定波长的光均衡地照射作物，不仅可以调节作物开花与结实，而且还能控制株高和植物的营养成分。植物栽培上应用的LED属于冷光源，光照系统发热少，实现了低热负荷，可以置于离植物很近的地方而不会把作物烤伤，光的利用率很高，可用于多层栽培立体组合系统；LED形状极小，可以制备成多种形状的器件，占用空间很小，安装方便，使植物生产设施小型化；此外，其特强的耐用性也降低了运行成本。 \n[0006] 本方法探索了甘蓝型油菜组织培养光源的控制技术的试验，建立了完整可行的试验方法，操作步骤简单，试验效果稳定、清晰。可以用于甘蓝型油菜的组织培养、植株再生、基因的遗传转化、植株的快速繁殖等领域。在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。 \n[0007] 三、发明内容\n[0008] 技术问题 \n 本发明的目的在于提供一种高效、节能、环保的光源控制技术，LED光源可以广泛应用于甘蓝型油菜组织培养、植株再生、基因的遗传转化、幼苗的快速扩繁等领域。\n[0009] 技术方案\n[0010] 本发明提供了一种甘蓝型油菜组织培养的光源控制技术，使用蓝红比为3:1的LED混合光源最适合甘蓝型油菜组培幼苗的生长，该光源可以用于甘蓝型油菜组织培养幼苗培育的全过程，替代目前广泛使用的荧光灯光源。\n[0011] 包括以下步骤： \n[0012] 1）不定芽分化阶段：切取带有部分叶柄的约0.5厘米的子叶，先在添加0.1 mg/L \n2,4-D的MS培养基中暗培养（光强0）2天；然后转入添加0.8 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA和1.0 mg/L AgNO3的MS培养基中，然后转入蓝红比3:1的LED光源下培养15天，所有培-2 -1\n养光强均为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃；\n[0013] 2）不定芽增殖阶段：不定芽分化阶段所用光源为荧光灯；切取丛生芽转入MS培养-2 -1\n基中，然后转入蓝红比3:1的LED光源下培养15天，所有培养光强均为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃；\n[0014] 3）幼苗光质处理阶段:不定芽分化和增殖阶段所用的光源都为荧光灯；切取一叶一心的幼苗，接入含0.5 mg/L NAA的MS培养基中，先在荧光灯下培养5天，然后转入蓝红-2 -1\n比3:1的LED光源下培养35天，所有培养光强均为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃。\n[0015] 4）光源:本光源是由长为105个发光二极管灯头和宽为30个发光二极管灯头组成的长方形发光二极管组合光源和一个变压器(APR1510H)来控制控制电压（0-2.2伏）和电流（0-20毫安），从而调控光强的大小。 \n[0016] 有益效果\n[0017] 本发明提供了一种对甘蓝型油菜组织培养光源控制技术。幼苗培养阶段，所有LED光源对油菜幼苗的培养效果均优于荧光灯光源。蓝红比为3:1的LED混合光源最适合甘蓝型油菜组培幼苗的生长，是可以应用于甘蓝型油菜组织培养再生成植株全过程的光源。替代通常所用的荧光灯光源，克服荧光灯光源能耗高、效率低、寿命短、废弃灯管污染环境等缺点。\n[0018] 本发明的光源控制技术具有以下优点：1)操作简单，效果好；2）节省能源环保；3）植株生长快速健壮。本发明方法和结果为开展与甘蓝型油菜组织培养有关的生物学研究和开发提供了新的途径和依据。 \n[0019] 试验证明蓝红比3:1 处理，油菜组培苗植株生长快速、健壮，幼苗的分化率（见\n5.5.1）、根长、鲜重、干重（见5.5.2）和根系活力（见5.5.7），叶片中可溶性糖的含量（见\n5.5.3）、叶绿素含量（见5.5.6）、可溶性蛋白(见5.5.8)和抗坏血酸含量（见5.5.9）、叶片解剖结构（见5.5.10）和幼苗的移栽成活率（见5.5.11）等各项生理生化指标(见5.5)都要高于传统的组培光源荧光灯处理（对照），因此,蓝红比3:1处理可以作为油菜组培苗培养及植株再生系统各阶段的最佳光源。 \n[0020] 四、附图说明\n[0021] 图1，蓝红组合光3：1光处理的叶绿素含量高于对照处理。\n[0022] 图2，蓝红组合光3：1光处理的根系活力高于对照处理。 \n[0023] 图3，蓝红组合光3：1光处理的可溶性蛋白含量高于对照处理。 \n[0024] 图4，蓝红组合光3：1光处理的抗坏血酸含量高于对照处理。 \n[0025] 图5，蓝红组合光3：1光处理的叶片的厚度、栅栏组织和海绵组织高于对照处理。 [0026] 图6，各种光处理前油菜幼苗的生长状态一致。 \n[0027] 图7，蓝红组合光3：1光处理的油菜幼苗在光处理后明显优于其他光处理。 [0028] 五、具体实施方式\n[0029] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为体积百分含量。\n[0030] 首先用本发明的方法对甘蓝型油菜（品种为Westar，该品种是组织培养和培育转基因油菜中广泛使用的品种）进行发光二极管光（LED）光源处理，包括以下三个步骤： [0031] 5.1）外植体的制备\n[0032] 先在流水中冲洗油菜种子2-3个小时，然后在超净工作台中用75%酒精消毒30秒，15%的次氯酸钠消毒10-15分钟，15%的双氧水消毒10-15分钟，无菌水冲洗5-6次；用镊子夹取种子接入MS培养基中，先在黑暗处（光强0）培养2天， 然后在荧灯光下（光强为-2 -1\n60μmol·m ·s ）培养5天，光周期为12小时,培养温度26±2℃，子叶展平后取带有0.5厘米叶柄的子叶作为外植体。\n[0033] 5.2）完整植株的培养 \n[0034] 5.2.1）不定芽分化阶段：切取带有部分叶柄的约0.5厘米的子叶，先在添加0.1 mg/L 2,4-D的MS培养基中暗培养（光强0）2天；然后转入添加0.8 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA和1.0 mg/L AgNO3的MS培养基中，然后转入蓝红比3:1的LED光源下培养15天，所有-2 -1\n培养光强均为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃；\n[0035] 5.2.2）不定芽增殖阶段：不定芽分化阶段所用光源为荧光灯；切取丛生芽转入MS培养基中，然后转入蓝红比3:1的LED光源下培养15天，所有培养光强均为-2 -1\n60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃；\n[0036] 5.3）幼苗光质处理阶段:不定芽分化和增殖阶段所用的光源都为荧光灯；切取一叶一心的幼苗，接入含0.5 mg/L NAA的MS培养基中，然后转入蓝红比3:1的LED光源下培-2 -1\n养35天，所有培养光强均为60μmol·m ·s ,光周期为12小时,培养温度26±2℃。\n[0037] 5.4）光源:本光源是由长为105个发光二极管灯头和宽为30个发光二极管灯头组成的长方形发光二极管组合光源和一个变压器(APR1510H)来控制控制电压（0-2.2伏）和电流（0-20毫安），从而调控光强的大小。 \n[0038] 5．5)处理效果 \n[0039] 5.5.1不同光源对油菜组培苗的分化率和增殖率的影响\n[0040] 在B:R=3:1 的LED光源处理下（B为蓝光，R为红光），幼苗的分化率最大，分化率为46.67%，较荧光灯处理增加25.6%，其次为B:R=1:1 的LED光源处理，红光处理下幼苗的分化率最小。在蓝光下，幼苗的增殖率最大，增殖率为98.45%，较荧光灯处理增加51.78%，其次为B:R=3:1光源，荧光灯和红光处理的增殖率最小（表1）。结果说明，B:R=3:1较有利于油菜幼苗的分化和增殖，蓝光较有利于油菜幼苗的增殖。\n[0041] 5.5.2不同光源对油菜组培苗生长的影响 \n[0042] 在B:R=3:1 的LED光源处理下，幼苗根长、鲜重和干重都最大，分别为8.72cm、\n0.64g和65.12mg，分别较对照荧光灯处理增加167%、129%和82.41%，荧光灯下最小。在红光处理下，幼苗的株高最大，株高为9.14cm，较荧光灯对照增加43.26%，蓝光处理下最小（表2）。结果说明，蓝红比为3:1处理下的油菜植株生长最健壮。\n[0043] 5.5.3不同光源对油菜组培苗糖含量的影响 \n[0044] 在B:R=3:1的 LED光源处理下，幼苗叶片中可溶性糖的含量最大,含量为105.20 mg/g，较荧光灯对照处理增加74.23%，其次为红光，荧光灯处理最小。在蓝光处理下，幼苗叶片中蔗糖的含量最大，含量为11.90 mg/g，较荧光灯处理增加27.96%，荧光灯对照最小（表3）。\n[0045] 在红光处理下，幼苗叶片中淀粉含量最大，含量为3.28 mg/g，较荧光灯处理增加\n241.67%，其次为B:R=1:3，荧光灯处理下最小（表3）。结果说明，蓝光较有利于叶片蔗糖的积累，而红光较有利于淀粉的积累，B:R=3:1处理较有利于叶片可溶性糖的积累。 [0046] 5.5.4 不同光源对油菜组培苗茎解剖结构的影响 \n[0047] 在B:R=3:1的 LED光源处理下，幼苗茎的直径最大，直径为1730.30μm，较荧光灯处理增加17.24%，其次为蓝光，红光处理最小。在蓝红比1:3（B:R=1:3）处理下，幼苗茎的皮层长度最大，为289.44μm，较荧光灯处理增加17.80%，其次为蓝光，红光处理最小。在蓝光处理下，幼苗茎的维管束最大，为173.75μm，较荧光灯处理增加18.37%，其次为荧光灯，红光处理最小。在B:R=3:1处理下，幼苗茎的中束鞘最大，为486.53μm，较荧光灯处理增加\n15.61%，其次为蓝光，红光处理最小（表4）。结果表明，B:R=3:1处理较有利于茎的发育。\n[0048] 5.5.5不同光源对油菜组培苗气孔的影响 \n[0049] 在B:R=3:1的 LED光源处理下，幼苗叶片的下表皮的气孔频度和上表皮的气孔长度最大，气孔频度和气孔长度分别为495.38μm和25.33μm。在B:R=1:3光源处理下，幼苗叶片的上表皮的气孔频度最大，气孔频度为464.47，红光处理最小。在蓝光的处理下，幼苗叶片的表皮气孔宽度最大，气孔宽度为10.49μm，荧光灯处理最小。在B:R=1:1光源处理下，幼苗叶片的上表皮的气孔宽度和下表皮的气孔长度最大，气孔宽度和气孔长度分别为\n9.54μm和24.2μm（表5）。结果表明，B:R=3:1、B:R=1:1和蓝光处理较有利于油菜幼苗叶片表皮气孔的打开。\n[0050] 5.5.6不同的光源处理对油菜组培苗叶绿素含量的影响 \n[0051] 在B:R=3:1 LED光源处理下，幼苗叶片中的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量、类胡萝卜素等色素的含量都最高，分别为2.24 mg/g、1.06 mg/g、3.14 mg/g和0.84 mg/g，分别较荧光灯处理增加21.08%、29.27%、23.13%和20%，其中荧光灯处理下最低（图1）。结果说明，B:R=3:1处理较有利于色素的积累。\n[0052] 5.5.7不同的光源处理对油菜组培苗根系活力的影响 \n[0053] 在B:R=3:1 的LED光源处理下，幼苗的根系活力最大，根系活力为477.05 mg/g/h，较荧光灯处理增加133.86%，其次为蓝光，荧光灯处理下最小（图2）。结果说明，B:R=3:1处理较有利于提高幼苗的根系活力。\n[0054] 5.5.8不同的光源处理对油菜可溶性蛋白的影响 \n[0055] 在B:R=3:1的LED光源处理下，幼苗叶片中的可溶性蛋白含量最大，含量为10.98 mg/g，较荧光灯处理增加23.79%，其次为蓝光，其中荧光灯处理最小（图3）。结果说明，B:R=3:1处理较有利于叶片可溶性蛋白的积累。\n[0056] 5.5.9不同的光源处理对油菜叶片中的抗坏血酸（VC）的影响 \n[0057] 在B:R=3:1的 LED光源处理下，幼苗叶片中的抗坏血酸含量最大，含量为42.49 mg/g，较荧光灯处理增加352.50%，其次为蓝光和B:R=1:1处理，其中荧光灯处理最小（图\n4）。结果说明，B:R=3:1 LED光源处理较有利于叶片抗坏血酸的积累。\n[0058] 5.5.10不同的光源处理对油菜叶片解剖结构的影响 \n[0059] 在B:R=3:1的 LED光源处理下,幼苗叶片栅栏组织和海绵组织的厚度都最大，厚度分别为91.00μm和64.18μm，分别较荧光灯处理的幼苗栅栏组织和海绵组织的厚度增加83.02%和38.05%。在红光处理下,幼苗叶片厚度最大，厚度为164.92μm，较荧光灯处理的幼苗叶片厚度增加29.69%（图5）。结果表明，红光较有利于叶片厚度的增加，而B:R=3:1处理较有利于栅栏组织和海绵组织的发育。\n[0060] 5.5.11不同的光源处理后对油菜幼苗移栽成活率的影响 \n[0061] 在B:R=3:1 的LED光源处理下,幼苗的移栽成活率最高，移栽成活率为76.67%，较荧光灯增加30%，其次为蓝光处理，B:R=1:1和B:R=1:3处理下移栽成活率最小（表6）。结果说明，B:R=3:1光源较有利于油菜幼苗的移栽成活。\n[0062] 5.6不同光源处理油菜组培苗的效果总结 \n[0063] 蓝红比3:1 处理，油菜组培苗植株生长快速、健壮，幼苗的分化率（见5.5.1）、根长、鲜重、干重（见5.5.2）和根系活力（见5.5.7），叶片中可溶性糖的含量（见5.5.3）、叶绿素含量（见5.5.6）、可溶性蛋白(见5.5.8)和抗坏血酸含量（见5.5.9），叶片解剖结构（见\n5.5.10）和幼苗的移栽成活率（见5.5.11）等各项生理生化指标(见5.5)都要高于传统的组培光源荧光灯处理（对照），因此,蓝红比3:1处理可以作为油菜组培苗培养及植株再生系统各阶段的最佳光源。\n[0064] \n[0065] \n[0066] \n[0067] \n[0068] \n[0069] \n