一株生防球孢链霉菌及在防治柑橘青霉病中的应用

1.一种防治柑橘青霉病的球孢链霉菌，其特征在于，该菌株为球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)JK-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：
M2010093。

一株生防球孢链霉菌及在防治柑橘青霉病中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株球孢链霉菌，尤其是涉及一株可以产生抗真菌挥发性物质的球孢链霉菌的分离鉴定及其在防治柑橘青霉病中的应用。\n背景技术\n[0002] 柑橘是世界上主要的果树之一，年产量已超过6500万吨。柑橘果实在采收后贮藏运输期间很容易发生由真菌或细菌引起的霉烂变质，会直接造成柑橘产量的下降以及贮藏品质的降低，从而造成很大的经济损失。柑橘青霉是柑橘贮藏期最严重的病害之一，据报道，在中国每年由柑橘青霉病所造成的柑橘产量损失为10-30％，严重时可达30-50％。目前防治柑橘贮藏期病害的一般方法是使用抑霉哇、特克多等化学农药，然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防治效果，并且频繁和高浓度的使用化学农药会造成农药在果蔬中的残留，不但污染了环境，而且严重威胁到人类的身体健康。随着人们生活水平的不断提高，公众对身体健康和环境条件的日益关注，我们必须探索出安全有效、环境友好的防治柑橘贮藏期病害的方法，才能满足当代社会的需要。\n[0003] 挥发性物质是一类低分子量的非极性化合物(＜300Da)，前人报道过一些真菌、细菌和放线菌可以产生挥发性物质，并且发现内生真菌Muscodor albus产生的挥发性物质具有抗真菌活性，已被作为生物杀菌剂来防治灰霉、毛霉、青霉、炭疽、褐腐等果蔬的贮藏期病害(Grimme et al.，2007；Strobel et al.，2007)。放线菌产生的挥发性物质可以引起曲霉病菌分生孢子的异常萎缩，镰刀菌、青霉菌、绿色木霉菌等的薄壁液泡增大，并且使绿色木霉菌丝分枝增多，畸形(Moore-Landecker et al.，1973)。近年来，有人报道普特拉链霉菌产生的挥发性物质在密闭容器中对水稻纹枯病、油菜菌核病、草莓灰霉病具有较好的防治效果(Wan et al.，2008)。迄今为止，还没有链霉菌产生的挥发性物质防治柑橘贮藏期病害的报道。\n发明内容\n[0004] 本发明的目的是提供一株可产生抗真菌的挥发性物质的生防菌-球孢链霉菌，该菌株可以产生挥发性物质并能有效抑制柑橘青霉病菌菌丝生长、孢子萌发以及孢子的形成，从而达到防治贮藏保鲜中的柑橘青霉病的目的。\n[0005] 本发明的技术方案如下：\n[0006] 本发明的微生物是在湖北省武汉市华中农业大学湖北省作物病害检测与安全控制重点实验室自然污染的PDA平皿上分离得到一株球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)，申请人将其命名为JK-1，该菌株已于2010年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2010093。\n[0007] 球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)JK-1的菌学特征：\n[0008] 球孢链霉菌JK-1为革兰氏阳性细菌，在PDA平板上的菌落呈圆形，初期白色，后为灰色或黄绿色。孢子圆柱形或椭圆形，孢子链直或波曲，有二级分枝；顶端不形成螺旋结构，偶尔呈钩状。\n[0009] 本发明制备的球孢链霉菌JK-1菌株的保藏：将球孢链霉菌的菌体保存在25％的甘油中，-20℃冷冻保藏。\n[0010] 申请人供了一种球孢链霉菌JK-1菌剂的制备方法，其步骤如下所示：\n[0011] (1)制备球孢链霉菌JK-1的一级种子液：取甘油管保存的保藏号为CCTCC NO：\nM2010093的球孢链霉菌JK-1菌种，划线接种于PDA固体培养基的上面，置于28℃下培养6\n6\n天后，加少量无菌水洗下菌落表面的孢子，稀释成1×10 个/mL之后取100μL加入到含有\n100mL PDB培养基的三角瓶中(250mL)，置于28℃下，在转速为150rpm摇床上震荡培养6\n8\n天，得到球孢链霉菌的一级种子液，使球孢链霉菌为1×10cfu/ml\n[0012] (2)制备球孢链霉菌JK-1的二级种子液：将步骤(1)的球孢链霉菌JK-1菌一级种子液，按体积比1～2％的比例接种到盛有PDB液体培养基(PDB培养基成分：按g/L计，马铃薯200g葡萄糖20g补充蒸馏水至1000ml)的250ml的三角瓶中，置于28℃，在转速为\n8\n150rpm摇床上震荡培养6天，得到球孢链霉菌的二级种子液，使球孢链霉菌为1×10cfu/ml。\n[0013] (3)球孢链霉菌JK-1的发酵培养：将步骤(2)的球孢链霉菌JK-1的二级种子液按体积质量比1％～2％接种到盛有灭菌小麦粒培养基的三角瓶中，摇匀后置于28℃下培养14天，得到含球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物。\n[0014] 其中：PDB液体培养基的配方是：\n[0015] 马铃薯200g葡萄糖20g补充蒸馏水至1000ml。\n[0016] 制作方法是：将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸约半个小时，用纱布虑去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。\n[0017] (4)将培养14d的球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物(以空白麦粒培养基为对照)取\n40g放入顶空微萃取瓶中，进行气相色谱/质谱(GC/MS)分析，鉴别挥发性物质的成分。\n[0018] (5)在培养皿组成的空间为500mL的密闭容器中测定不同量(0g，1.875g，3.75g，\n7.5g，15g，30g)的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物对柑橘青霉菌的菌丝生长、孢子萌发以及孢子形成的影响；在分离筛组成的空间为2L的密闭容器中测定不同量(0g，30g，60g，120g，\n240g，480g)的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物对柑橘青霉病的防治效果。\n[0019] (6)在分离筛组成的空间为2L的密闭容器中测定240g的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物产生的挥发性物质对柑橘自然发病的柑橘青霉病的防治效果。\n[0020] 本发明的优点是：该球孢链霉菌JK-1麦粒培养物可以在密闭容器中不接触水果而通过气体的作用来抑制柑橘青霉菌菌丝生长、孢子萌发、孢子形成以及防治柑橘青霉病等柑橘果实上主要的贮藏期病害，减少了球孢链霉菌本身对柑橘的影响以及对人类的毒害作用。由于球孢链霉菌产生的挥发性物质本身易挥发，熏蒸处理后残留在柑橘表皮的挥发性物质在常温下很容易挥发从而减少了对柑橘品质的影响和对人体健康的危害。另外，本发明确定了对柑橘青霉有抑制作用和防治效果的链霉菌麦粒培养物的用量，具有很强的实用性。\n附图说明\n[0021] 图1为未接种孢链霉菌JK-1的麦粒培养基产生挥发性物质的气相色谱图。\n[0022] 图2为接种球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物产生挥发性物质的气相色谱图。\n[0023] 图3为球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉病菌菌丝生长的影响的柱状图。\n[0024] 图4为球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉菌孢子形成影响的柱状图。\n[0025] 图5为球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉菌孢子萌发的抑制作用的柱状图。\n[0026] 图6为球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉病的防治效果图。图中：A，\n0g；B，30g；C，60g；D，120g；E，240g；F，480g链霉菌麦粒培养物熏蒸。\n[0027] 图7为球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对自然发病的柑橘青霉病的防治效果图。图中：A，240g球孢链霉菌麦粒培养物熏蒸处理；B未处理对照。\n具体实施方式\n[0028] 实施例1：球孢链霉菌JK-1的分离筛选与发酵培养\n[0029] 一、分离与筛选过程\n[0030] 本发明的微生物是在湖北省武汉市华中农业大学湖北省作物病害检测与安全控制重点实验室自然污染的PDA平皿上分离得到1株较强拮抗活性的链霉菌，分离纯化为常规方法，参照文献：方中达(1998)，方法是，从自然污染的PDA平皿上挑取链霉菌菌落，经\n5ml无菌水稀释后，用接种针沾取少量稀释液在PDA平皿上画线，挑选所需特征单菌落，经过3次相同的划线培养，最终得到纯的链霉菌菌株。申请人将其命名为JK-1。参照链霉菌鉴定手册(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975)对链霉菌JK-1进行形态学观察和生理生化试验，将链霉菌JK-1鉴定为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。对球孢链霉菌JK-1进行了初步的生防测试，发现该菌株具有抗真菌活的挥发性物质产生，对所产生的抗真菌活的挥发性物质进行了进一步地跟踪研究(见表1和表2)，确定该菌株对贮藏中的柑橘青霉病菌具有明显的拮抗作用(见实施例3、4、5、6所述)。该菌株已于2010年4月20目送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2010093。\n[0031] 二、球孢链霉菌JK-1的种子培养和发酵培养\n[0032] (1)制备球孢链霉菌的一级种子液：取甘油管保存的保藏号为M2010093的球孢链霉菌JK-1菌种，划线接种于PDA固体培养基的上面，置于28℃下培养6天后，加少量无菌水\n6\n洗下菌落表面的孢子，稀释成1×10 个/mL之后取100μL加入到含有100mLPDB培养基的三角瓶中(250mL)，置于28℃下，转速为150rpm摇床上震荡培养6天，得到球孢链霉菌的一\n8\n级种子液，使得菌体浓度为1×10 个/ml。\n[0033] (2)制备球孢链霉菌JK-1的二级种子液：将步骤(1)球孢链霉菌JK-1菌一级种子液，按体积比1～2％的比例接种到盛有PDB液体培养基的的250ml的三角瓶中，置于28℃，\n8\n转速为150rpm摇床上震荡培养6天，得到球孢链霉菌的二级种子液，使菌体浓度为1×10个/ml。\n[0034] (3)球孢链霉菌JK-1的发酵培养：将步骤(2)的球孢链霉菌JK-1的二级种子液按体积质量比1％～2％接种到盛有灭菌小麦粒培养基的三角瓶中，摇匀后置于28℃下培养14天。其间每隔2d摇匀一次麦粒培养基，以便链霉菌生长均匀。\n[0035] PDB液体培养基的配方：马铃薯200g葡萄糖20g蒸馏水1000ml。\n[0036] 制备方法：将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸约半个小时，用纱布虑去马铃薯，然后加入葡萄糖，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。\n[0037] 实施例2：球孢链霉菌JK-1产生挥发性物质成分的初步鉴定\n[0038] 将培养14d的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物(不加球孢链霉菌JK-1，培养14d的灭菌麦粒培养物为对照，下同)取40g放入顶空微萃取瓶中，再加入饱和的NaCl溶液50mL磁力搅拌，在60℃下平衡40min后回收萃取头，从萃取瓶中拔出萃取头并立即插入气相色谱进样孔，于280℃解吸5min进行气相色谱/质谱(GC/MS)分析，气相色谱图如图1、2所示。\n将所得到的各气体成分的质谱图与NIST数据库(Agilent7890A，美国Agilent公司)进行比对，从而鉴别出挥发性物质的成份。从链霉菌麦粒培养物产生的物质成分中鉴定出35种化合物，如表1所示。\n[0039] 实施例3：球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉病菌菌丝生长以及孢子形成的抑制作用\n[0040] 在直径150mm高30mm的大培养皿中放四个没有盖的直径60mm高15mm的小培养皿底；其中三个小培养皿盛5mL左右的PDA培养基(方中达，1998)并接种直径5mm的柑橘青霉菌菌丝块，另外一个小培养皿放置球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物，然后将大培养皿用封口膜密封。分别设5个不同处理，球孢链霉菌JK-1麦粒培养物的量分别为0g，1.875g，\n3.75g，7.5g，15g，30g。在25℃的条件下培养5d后，观察测量各小培养皿中菌落直径的大小以及各培养皿产生的孢子量的多少。结果如图1、2所示。球孢链霉菌JK-1麦粒培养物产生的挥发性物质对青霉菌菌丝生长和孢子的形成有明显的抑制作用，菌落直径随着球孢链霉菌的麦粒培养物量的增多而减小。在30g球孢链霉菌JK-1麦粒培养物存在的情况下，青霉菌的菌丝生长完全被抑制，并且未见孢子的形成。\n[0041] 实施例4：球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉病菌孢子萌发的抑制作用\n[0042] 在直径150mm高30mm的大培养皿中放四个没有盖的直径60mm高15mm的小培养皿；其中三个小培养皿盛5mL左右的PDA培养基，并用50μL的柑橘青霉分生孢子的悬浮液\n4\n(浓度为10 个/mL)涂皿。将制备好的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物置于另外一个小培养皿中，然后将大培养皿用封口膜密封，在25℃培养12h后测定孢子萌发情况。分别设5个不同处理，球孢链霉菌JK-1麦粒培养物的量分别为0g，1.875g，3.75g，7.5g，15g，30g。在25℃培养12h后，空白对照柑橘青霉菌的孢子萌发率达95.3％(图3)，而在15g或30g球孢链霉菌JK-1麦粒培养物存在的情况下，柑橘青霉菌的孢子萌发率分别为31.3％和3.4％。这说明本发明的球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物产生的挥发性物质对孢子萌发具有明显的抑制作用。\n[0043] 实施例5：不同量的球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对柑橘青霉病的防治效果(应用实施例)\n[0044] 选取颜色、大小一致的沙糖橘(一种宽皮柑橘类商品果品，在贮藏中很容易诱发柑橘青霉病)，先用浓度为75％的酒精对果实进行表面消毒1min，再用无菌水清洗干净，晾\n6\n干。在与果蒂相对的表皮中央用针刺伤果皮，点接20μL的柑橘青霉菌的孢子液(10 个/mL)并放在金属分离筛(直径25cm，高5cm)里面，不同量(0g，30g，60g，120g，240g，480g)的球孢链霉菌的麦粒培养物放在分离筛下面的筛底中；在金属筛上面盖上盖子后用封口膜密封，并置于25℃的条件下培养5d后观察砂糖橘的柑橘青霉病的发病情况。结果发现在25℃条件下培养5d后，未处理的沙糖橘的发病率为100％，而用60g，120g，240g和480g的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物熏蒸处理沙糖橘的柑橘青霉的发病率与对照相比明显降低(见表\n2)。并且随着球孢链霉菌JK-1麦粒培养物量的增加，发病率减少。在60g和120g的球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物熏蒸处理下的沙糖橘的发病率分别为70.6％和19.0％，而在240g和480g球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物熏蒸处理情况下的沙糖橘的发病率均为0。这表明本发明的球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物产生的挥发性物质对柑橘青霉病有很好的防治效果。\n[0045] 实施例6：球孢链霉菌JK-1产生的挥发性物质对自然发病的柑橘青霉病的防治效果\n[0046] 选取颜色、大小一致的沙糖橘(购自商品)，放在金属分离筛(直径25cm，高5cm)里面，取240g的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物放在该金属筛底，在金属筛上面盖上盖子后用封口膜密封。在25℃培养10d后观察计算沙糖橘自然发病情况。结果如图5所示，在240g球孢链霉菌JK-1麦粒培养物熏蒸的情况下，沙糖橘的柑橘青霉的发病率为7.5％，而未用球孢链霉菌JK-1麦粒培养物处理的对照组的沙糖橘的柑橘青霉的发病率为25.3％，本发明的防效高达70.4％。这说明本发明的球孢链霉菌JK-1麦粒培养物产生的挥发性物质对自然侵染的柑橘青霉病具有很好的防治效果。\n[0047] 附表和文献：\n[0048] 表1(请参见第6-7页)。\n[0049] 表2(请参见第7页)。\n[0050] 参考文献(请参见第7页)。\n[0051] 表1应用气相色谱/质谱分析鉴定球孢链霉菌JK-1的麦粒培养物产生的挥发性物质成分\n[0052] \n[0053] \n[0054] 表2球孢链霉菌JK-1的产生的挥发性物质对柑橘青霉病发病率和严重度的影响[0055] \n[0056] 参考文献\n[0057] 中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册.北京：科学出版社，\n1975；方中达.植病研究方法(第三版).北京：中国农业出版社，1998；\n[0058] Grimme，E.，Zidack，N.K.，Sikora，R.A.，Strobel，G.A.&Jacobsen，B.J.，2007.Comparison of Muscodor albusvolatiles with a biorational mixture for control of seedling diseases of sugar beet and root-knot nematode ontomato.Plant Dis.91，\n220-225.\n[0059] Herrington，p.R.，Graig，J.T.，Chea，C.Y.&Sheridan，J.E.，1985.Inhibition of spore germination of volatiles fromStreptomyces griseoruber.Soil Biol.Biochem.19，509-512.\n[0060] Moore-Landecker，E.&Stotzky，G.，1973.Morphological abnormalities of fungi induced by volatile microbialmetabolites.Mycologia65，519-530.[0061] Strobel，G.A.，Kluck，K.，Hess，W.M.，Sears，J.，Ezra，D.&Vargas，P.N.，\n2007.Muscodor albus E-6，anendophyte of Guazuma ulmifolia making volatile antibiotics：Isolation，characterization and experimentalestablishment in the host plant.Microbiology153，2613-2620.\n[0062] Wan，M.，Li，G.，Zhang，J.，Jiang，D.&Huang，H.C.，2008.Effect of volatile substances of Streptomyces platensisF-1 on 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