一种用于测定人Ⅲ型前胶原的试剂盒及其测定方法

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本发明涉及的是医药诊断试剂，特别是一种在放射免 疫法测定下的诊断肝纤维化的人Ⅲ型前胶原hPCⅢ诊断试 剂，其制备方法和其在放射免疫测定中的使用方法。\n据认为肝纤维化是各种慢性活动性肝炎向肝硬化发展 的必经阶段，在肝硬化进一步造成肝实质细胞严重损害后， 才能被肝功能实验确诊，但一般常规肝功能试验无法诊断 肝纤维化和早期肝硬化。目前临床主要依靠肝活检来判断， 但此方法为创伤性检查，且受穿刺部位的局限，并且难以 进行肝纤维化进展的动态观察。根据肝硬化乃至肝癌的形 成和发展过程，世界肝病专家认为阻止或减慢肝纤维化的 发生将会治愈大多数慢性肝病患者。因此，早期诊断肝纤 维化特别是在临床上建立肝纤维化的可靠标志物对于防止 肝硬化的形成和发展具有非常重要的意义。\n近年来，国内外许多学者报道，血清Ⅲ型前胶原肽 (Procollagen type Ⅲ Peptide,PⅢP)是诊断肝纤维 化较好的血清学指标。测定方法多采用放射免疫分析法， 所用抗原从动物胎皮中提取，如德国贝林格公司(Behr- ingwerke Co.)生产的PⅢP放免试剂盒中的关键材料PⅢP 就是从牛胎皮中提取。也有从羊、鼠等胎皮中提取PⅢP的 报道。其作为诊断肝纤维化标志物的依据是肝硬化早期以 Ⅲ型胶原(Collagen type Ⅲ,CⅢ)增多为主，细胞在 合成胶原时以前胶原形式分泌出细胞外，而血清PⅢP是Ⅲ 型前胶原(Procollagen type Ⅲ,PCⅢ)经氨基端内切肽 酶作用脱落下来的多肽链，所以测定PⅢP含量可以反映CⅢ 的代谢状况。然而动物与人类胶原分子在结构上的一些抗 原决定簇存在某些差异，必然对测定结果带来影响。此外， 有些学者还发现肝细胞的炎症和坏死均可使在肝内存在的 CⅢ裂解以致血清PⅢP值升高，因而血清PⅢP值不一定提示 胶原合成的增加，亦即是血清PⅢP值诊断肝纤维化会受到 其他因素的影响而不准确。此外，目前从国外进口PⅢP放 免试剂的价格非常昂贵，其具体的放免测定操作复杂，需 经过复杂计算才可以得到病人血清中的PⅢP含量。\n本发明的目的是：1．提供一种包括从人工流产的死胎 皮肤中提取的人Ⅲ型前胶原(human Procollagen typeⅢ) 即hPCⅢ，其抗体anti-hPCⅢ，同位素标记抗原125Ⅰ-hPCⅢ 的放免试剂盒；2．提供所述试剂盒的放射免疫测定方法。\n由于上述目的，本发明存在以下两方面的内容。\n一、一种用于放射免疫法测定人Ⅲ型前胶原的试剂 盒，包括纯抗原试剂、抗体试剂、标记抗原试剂和分离 剂；其特征在于：纯抗原试剂为人Ⅲ型前胶原hPCⅢ，抗 体试剂为人Ⅲ型前胶原抗体anti-hPCⅢ，标记抗原试剂为 标记抗原125Ⅰ-hPCⅢ；其中：\n1、所述纯抗原试剂hPCⅢ按法马西(Pharmacia)公司 蛋白质标准检验达到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯，用电泳考马 斯亮兰R250染色呈粉红色，电泳图谱观察为单一区带，经β -巯基乙醇还原后电泳图谱可见两条区带，分别代表肽链 Proαl(Ⅲ)和Pαl(Ⅲ)，前者的迁移率为0.238，蛋白 质分子量为19万，后者的迁移率为0.310，蛋白质分子量为 17万；\n2．所述抗体试剂anti-hPCⅢ为hPCⅢ免疫家兔获得，其 工作液用0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA),2％(v/v)正常兔血 清(NRS)及0.1M,pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制；\n3、所述标记抗原试剂125Ⅰ-hPCⅢ用1％(w/v)BSA,0.1M, pH7.4的PBS配制成浓度为每100微升液体每分钟γ-射线计 数值(cpm/100μl)30000；\n4、分离剂为0.1M,pH7.4的PBS配制6％(w/v)聚乙二醇 (PEG)和羊抗兔抗血清(第二抗体)获得。\n本发明有如下附图：\n附图1为hPCⅢ的PAGE图谱；\n附图2为SDS-PAGE图谱；\n附图3为从胎皮中纯化hPCⅢ过程中的中间产物SDS- PAGE图谱；\n附图4为肝活检纤维化程度与血清PCⅢ相关关系统计 图；\n附图5为病理肝纤维化分级为0级的病理标本的显微图 像；\n附图6为病理肝纤维化分级为轻级的病理标本的显微 图像；\n附图7为病理肝纤维化分级为中级的病理标本的显微 图像；\n附图8病理肝纤维化分级为重级的病理标本的显微图 像。    \n本发明所述试剂盒中的试剂的质量鉴定方法及结果如 下：\n1、参见附图1，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及考马 斯亮兰R250染色鉴定，获得的hPCⅢ为单一区带，说明纯 度已达到电泳纯，箭头所指区带为粉红色，符合胶原蛋白 特征；参见附图2，经β-巯基乙醇还原后电泳(SDS-PAGE) 可见两条区带，分别为Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)，但其迁 移率比牛Ⅲ型前胶原略低，图中，各纵向区带数字代表不 同物质成分：1-PCⅢ(牛Ⅲ型前胶原)；2-hPCⅢ(人Ⅲ型前 胶原)；3-HMW(高分子量蛋白质标准)；4-hPCⅠ(人Ⅰ型前 胶原)；5-CⅢ(Ⅲ型胶原)；其中纵向区带2中：带a-Pro  α1(Ⅲ)，带b-Pα1(Ⅲ)。经与进口法马西公司高分子量 蛋白质标准(HMW)对照测定，获得的hPCⅢ分子的亚单位的 分子量分别为：Proα1(Ⅲ)链190000道尔顿(Dolton, D),Pαl(Ⅲ)链170000D。而牛型Ⅲ型前胶原的Proαl (Ⅲ)链为170000D,Pα1(Ⅲ)链为150000D。参见附图3： 从胎皮中纯化hPCⅢ过程的中间产物SDS-PAGE图谱，看到 提纯过程中hPCⅢ逐步被纯化情况，图中，1-DEAE-32层 析前，可见杂质成分很多；2-DEAE-52层析前，可见杂质量 减少很多；5-DEAE-52层析后，得到清晰两条带的纯品hPC Ⅲ。当原料来源太差时尚需增加的层析步骤：3,4-Sepha- dex G100层析前，可见还混有少量杂质成分，经5-Sephadex G100层析后得到纯品hPCⅢ。\n2、anti-hPCⅢ的鉴定：\n将上述制备的抗血清作系列稀释，按放免法，不加竞争 性抗原，绘制抗血清稀释曲线，测定其效价；免疫组织化学： 取肝硬化与慢性活动性肝炎病人各10例肝活检标本，将上 述制备的抗血清按效价稀释至1∶100，该高价抗血清用于免 疫组织化学肝活检标本，在光学显微镜下可见肝硬化假小 叶之间的胶原纤维，证实为特异性抗体。\n3、将前述125Ⅰ-hPCⅢ用三氯醋酸法测定，放射化学纯 度达99.6％。\n二．本发明所指的试剂的放射免疫测定方法系采用双 抗体PEG法，非平衡法加样，操作前试剂按以下容量分装：\n1、hPCⅢ标准液：共7瓶，分别用S0～S6标示，每瓶容量 1ml；其浓度分别为So 0μg/L,S1 25μg/L,S2 50μg/L, S3 100μg/L,S4 250μg/L,S5 500μg/L,S6 1000μg/L；\n2、PBS:1瓶，2ml；\n3、anti-hPCⅢ:3瓶，共22ml；\n4、125I-hPCⅢ:2瓶，共11ml；\n5、分离剂：3瓶，共22ml；\n6、质控血清：1瓶，1ml。\n本发明用于放射免疫测定中的测定方法按以下操作步 骤：    \n(1)100μl标准液或待测病人血清标本中加入100μ1 anti-hPCⅢ后，4℃放置42～48小时；\n(2)加人100μl计数值为30000cpm的125Ⅰ-hPCⅢ溶液， 4℃放置6小时；\n(3)加入分离剂200μl，室温放置30分钟；\n(4)4000转/分，4℃～10℃条件下离心30分钟；\n(5)吸弃上清液后用v计数仪测定沉淀物的放射性计数 值，其值用Bx表示(下标x代表不同浓度标准工作液或病人 标本)；\n(6)在半对数坐标纸上以((B标准液-BNSB)/(Bo-BNSB))(％) (Bo代表最大结合，B标准液代表标准液结合，BNSB代表非特异性 结合)为纵坐标，以hPCⅢ标准液浓度([hPCⅢ(μg/L)])为 横坐标绘制标准工作曲线；\n(7)用((B病人标本-BNSB)/(Bo-BNSB))(％)反查标准工作曲线即 可得到病人血清中hPCⅢ含量。    \n用上述操作步骤获取的数据绘制的标准曲线的竞争抑 制关系良好，落差大，测定范围宽，完全满足临床测定要 求。灵敏度为6μg/L，批内和批间变异系数分别为5.2％和 6.2％，回收率为97.6～102.3％，与其他类型胶原无交叉反 应，方法稳定。以上指标已达到放射免疫法的质量标准要 求。\n上述计算结果与肝活检纤维化程度的关系：37例肝活 检标本经H-E染色，按纤维化分布范围和成纤维细胞增生 程度分为轻、中、重三级。无纤维增生者为0级。其血清 PCⅢ测定结果：病理0级，11例，血清PCⅢ为89.5±18.1 μg/L(下同)；轻级，10例，135.5±20.5；中级，8例， 260.8±39.2；重级，8例，369.8±68.0。血清PCⅢ随肝 纤维化程度加重而递增，两者呈密切正相关(r=0.984,P ＜0.001)(参见图4)。\n图5图8为其中4例有代表性的表现不同肝纤维化 程度的肝活检标本的病理显微照片，其相应的血清PCⅢ含 量为：图5，病理0级，血清PCⅢ含量为58.9μg/L(下 同)；图6，轻级，125.3；图7，中级，210.2；图8，重 级，323.5。证明本发明的测定结果与实际病情了一致。\n本发明的试剂及放免测定方法经重庆市肿瘤医院及全 国7所大医院临床试用，其效果参见下表： 重庆市肿瘤医院    七家医院结果综合 组    别            例数    均值  ± 标准差    例数    均值 ± 标准差 正常对照            100     85.0  ±  17.5    265     83.4  ± 17.8 急性肝炎            22      131.1 ±  30.2    53      111.2 ± 30.1 慢迁肝              18      94.9  ±  26.5    143     93.6  ± 26.2 慢活肝              13      188.2 ±  73 9    122     174.0 ± 42.6 代偿性肝硬化        10      277.4 ±  91.0    13      210.3 ± 86.6 失代偿性肝硬化      20      228.2 ±  157.1   129     211.1 ± 67.9 肝硬化合并肝癌      46      288.7 ±  101.4   62      269.7 ± 66.6 原发性肝癌(单纯型)  22      168.5 ±  39.3 胆石症              12      88.0  ±  18.6    15      87.9  ± 16.6 其他：肝病          7       88.2  ±  28.0    23      93.4  ± 19.7\n非肝病          11      88.6  ±  10.5 从上表可以看出，肝硬化各组和慢活肝组病人血清PC Ⅲ升高最为显著，慢迁肝、胆结石和其他疾病均无显著升 高，充分说明肝细胞的炎性坏死对血清PCⅢ测定影响较 小，即PCⅢ能正确反映体内肝纤维化发展程度。\n              小 结\n1、从雷佛诺尔人工引、流产的死胎皮肤中提取、纯 化人Ⅲ型前胶原，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和还原后亚单位 测定等证实人Ⅲ型前胶原为纯品。\n2、用人Ⅲ型前胶原免疫家兔获得高价抗血清，并经免 疫组织化学试验证实肝脏胶原纤维可着色。\n3、Na125Ⅰ标记人Ⅲ型前胶原，放化纯度达到99.6％。\n4、建立的血清Ⅲ型前胶原放免法各项指标均符合临 床测定要求。\n5、临床上测定281例血清Ⅲ型前胶原结果：100例正常 对照(均值±标准差)为85.0±17.5μg/L(单位下略)，正 常上限为120；肝硬化组上升最高，代偿性、失代偿性和合 并肝癌组分别为227.4±91.0、266.2±157.5和288.7± 101.4；慢活肝组有显著升高为188.2±73.9；急性肝炎组 和肝癌(单纯型)组略有升高，各为131.1±30.2和168.5 ±39.3；慢迁肝、胆石症和其他组均无明显增高。\n6、37例肝活检按纤维化程度分为：0、轻、中和重级， 其血清PCⅢ分别为89.5±18.1、135.5±20.5、260.8± 39.2和369.8±68.0。两者呈密切正相关(r=0.984,P (0.001)。\n本发明的积极效果是：\n1、以hPCⅢ建立的放射免疫分析法测定血清Ⅲ型前胶 原指标，能客观地反映体内肝组织纤维化程度，对诊断肝纤 维化及早期肝硬化的防治具有重要价值。\n2、用本发明所述方法能获得hPCⅢ纯品，用氯胺T法 标记hPCⅢ时以半胱氨酸作还原剂所得的125I-hPCⅢ稳定 性大于1.5月，明显较以偏重亚硫酸钠为还原剂的标记方 法为好，对hPCⅢ分子的损伤很小，且放射化学纯度达到 99.6％。\n3、操作简单，所有成分均配制成应用液体，分别按 顺序加入即可，不必再作其他附加工作；待测的病人血清 不必作任何稀释即可得到PCⅢ含量，测定范围足够临床使 用；灵敏度达6μg/L，批内和批间变异系数分别为5.2％和 6.2％，回收率为97.6～102.3％，所有指标均已达到放射 免疫法质量标准要求。