一种丝素蛋白的提纯方法

1.一种丝素蛋白的提纯方法，以家蚕生丝或家蚕茧壳为原料，其特征在于进行如下步骤的加工：
（1）按浴比1:10～1:100，在温度为30～60℃的条件下将原料置于浓度为1g/L～
100g/L的渗透剂溶液中浸泡处理20～60min后取出；所述的渗透剂为单硬脂酸甘油硫酸酯钠盐、脂肪醇聚氧乙烯醚、顺丁烯二酸二仲辛酯磺酸钠中的一种；
（2）按浴比1:30～1:100，将上一步骤处理后的原料用质量分数为0.01%～1%的碳酸氢钠水溶液煮沸20～30min，洗涤；
（3）重复步骤（2）1～2次，得到初步脱胶后的原料；
（4）在温度为30～70℃的条件下，将初步脱胶后的原料置于浓度为1～10g/L的蛋白酶溶液中浸泡脱胶处理20～100 min，再经去离子水洗净、干燥后得到脱胶丝；
（5）将步骤（4）得到的脱胶丝溶解于9.3M溴化锂溶液中，用去离子水透析后得到丝素蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白的提纯方法，其特征在于：所述的蛋白酶为木瓜酶、胰蛋白酶中的一种。

一种丝素蛋白的提纯方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种蛋白质的纯化方法，特别是丝素蛋白的提纯方法，属于生物材料技术领域。\n背景技术\n[0002] 家蚕丝主要由丝素和丝胶两种蛋白质组成，其中丝素约占70%左右，丝胶占30%左右。由于纯丝素蛋白抗原性较低，而丝胶具有一定的抗原性，因此作为生物医用材料的丝素蛋白需要提纯去除丝胶。丝胶是构成蚕丝纤维外层组织的蛋白质，其蛋白链上有许多侧链较长的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸等, 以及许多极性亲水基团(如羟基、羧基、氨基、亚氨基等)。丝胶具有水溶性，易溶于热水、酸、碱溶液中，而丝素蛋白仅有水溶胀性，不溶于水。通常利用丝胶的这种性质进行脱胶。脱胶的方法不仅会影响到丝胶是否去除完全，还会影响到丝素蛋白分子的性质，不同的脱胶方法对丝素蛋白分子量很大的影响。好的脱胶方法是在获得不含丝胶的丝素蛋白同时保留丝素蛋白的完整性，尽量减少丝素蛋白的降解，从而不影响由丝素蛋白为原料制备的丝素膜、丝素凝胶、丝素微球，丝素多孔膜等材料的性能。\n[0003] 现有技术中，蚕丝脱胶提纯的方法概括起来有五种：沸水法、皂煮法、有机酸法和酶法和碱法。文献([J]聊城师院学报(自然科学版),1999,01:43-47+62)中，介绍了沸水法脱胶要求高温、长时间，并且脱胶不彻底；皂法脱胶，耗皂量大，约占生丝的20～30%，而且对皂的要求较高，一般的皂效果不理想，脱胶能力较弱，标准脱胶所使用的皂是马赛皂(一种由橄榄油制备的皂)，来源有限，需要进口，价格昂贵，也不能彻底脱除丝胶；文献([J]日本蚕丝学杂志，1955，1(6) 32～64)中使用有机酸酒石酸作为胶脱剂，脱胶条件：\n酒石酸浓度16%，温度93℃，2h，脱胶率为80%，延长脱胶时间脱胶速度变的比较缓慢，而且酒石酸易为丝素所吸咐，难除尽，残留量高达2.5% ，严重影响其后丝素蛋白的应用；文献([J]丝绸,2009,08:20-22)中介绍了木瓜酶的脱胶方法。酶脱胶的条件比较温和，但是时间长，成本高，对乳化剂的要求也颇为苛刻。公开号为CN102337599A的中国发明专利中，公开了一种蚕丝脱胶的方法，将蚕茧装入布袋内，用水浸泡16～19小时，清水冲净、甩干，放入纯碱浓度为1.8％～2.5％，升温至碱液沸腾，煮50～60分钟，边煮边搅拌，用流水冲洗至中性，但该方法并没有考虑到碱的用量对丝素蛋白产生的腐蚀作用，使获得的丝素蛋白的分子量降低。\n发明内容\n[0004] 为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种丝素蛋白的提纯方法，能够保证丝胶去除干净，且能获得高分子量的丝素蛋白。\n[0005] 为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案是提供一种丝素蛋白的提纯方法，以家蚕生丝或家蚕茧壳为原料，进行如下步骤的加工：\n[0006] 1、按浴比1:10～1:100，在温度为30～60℃的条件下将原料置于浓度为1g/L～\n100g/L的渗透剂溶液中浸泡处理20～60min后取出；\n[0007] 2、按浴比1:30～1:100，将浸泡处理后的原料用质量分数为0.01%～1%的碳酸氢钠水溶液煮沸20～30min，洗涤；重复本步骤1～2次，得到初步脱胶后的原料；\n[0008] 3、在温度为30～70℃的条件下，将初步脱胶后的原料置于浓度为1～10g/L的蛋白酶溶液中浸泡脱胶处理20～100 min，再经去离子水洗净、干燥后得到脱胶丝；\n[0009] 4、将步骤3得到的脱胶丝溶解于9.3M溴化锂溶液中，用去离子水透析后得到丝素蛋白溶液。\n[0010] 本发明技术方案中，所述的渗透剂为单硬脂酸甘油硫酸酯钠盐、脂肪醇聚氧乙烯醚、顺丁烯二酸二仲辛酯磺酸钠中的一种；所述的蛋白酶为木瓜酶、胰蛋白酶中的一种。\n[0011] 本发明的原理是：由于丝胶凝固在丝素的表面，在储存、运输过程中有部分丝胶变性成β-折叠结构，难以溶于水中，直接用热水溶解丝胶难以去除完全。由于生丝在生产时的加捻或者茧壳中蚕丝纤维的叠加，丝素纤维与丝胶聚集在一起，因此，本发明先采用渗透剂浸泡，使蚕丝纤维分离开来，然后采用弱碱性的NaHCO3 脱胶，去除大部分的丝胶，最后部分难溶的丝胶由酶降解脱除。直接使用碳酸钠脱胶，其pH在10以上，一般0.05 wt%的碳酸钠pH值在11以上，对于丝素产生很强的破坏作用。而NaHCO3的pH值小很多，即使高浓度的碳酸氢钠，其pH值也不会超过9，基本上对于丝素蛋白没有破坏。用低浓度的NaHCO3就可以避免碱性大对丝素蛋白的腐蚀问题。但是低浓度的NaHCO3 难以将丝胶去除完全，所以需要进一步采用酶脱胶，由于剩余的丝胶含量较少，酶的用量，脱胶的时间可以大大降低。\n蛋白酶有很多种，酶的选择会影响到丝素分子量的大小。本发明选择用来蚕丝脱胶的酶为木瓜酶、胰蛋白酶。这两种酶的酶切位点为精氨酶、赖氨酸部位，丝素中精氨酸含量0.96%，丝胶中精氨酸含量4.61%，因此，这两种酶主要作用于外层的丝胶，对丝素蛋白的危害较小。\n如果采用碱性蛋白酶，催化部位为丝氨酸，丝素中丝氨酸含量为13.74%，丝胶中丝氨酸含量为30.14%，所以碱性蛋白酶不仅会作用于丝胶中的丝氨酸，也可能作用于丝素中的丝氨酸。\n其他的蛋白酶要么价格较贵，要么对丝素也产生降解，不适合用于纯化丝素蛋白。因此本发明NaHCO3 —酶脱胶法能够在保证丝胶去除干净的同时，获得高分子量的丝素蛋白。\n[0012] 与现有技术相比，本发明避免了一般脱胶方法对丝素蛋白的腐蚀或者脱胶不干净，成本高的问题，具有的明显优点是：得到的丝素蛋白既不含丝胶并且分子量降解很少，能够保持原丝素蛋白中的H链和L链和P25，很好地保持了原丝素蛋白的分子量，由此为原料制得的丝素蛋白材料的性能可以获得提高。\n附图说明\n[0013] 图1是按不同脱胶方法得到的蚕丝纤维经苦味酸胭脂红染色后得到的K/S曲线图；\n[0014] 图 2 按不同脱胶方法得到的丝素蛋白水溶液的电泳图片。\n具体实施方式\n[0015] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。\n[0016] 实施例1\n[0017] 取40克桑蚕生丝，40℃下在质量分数为5% 脂肪醇聚氧乙烯醚浸泡30min,浴比\n1:10，之后用质量分数为0.01%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,重复上述步骤两次,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10,木瓜蛋白酶浓度3g/L,温度65℃的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=6）中浸泡60min脱胶，去离子水洗净后60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0018] 实施例2\n[0019] 取40克桑蚕茧丝，40℃下质量分数为2%脂肪醇聚氧乙烯醚浸泡30min,浴比\n1:20，之后用质量分数为0.5%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10,木瓜蛋白酶浓度5g/L,温度\n60℃的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=6）中浸泡60min脱胶，去离子水洗净后60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0020] 实施例3\n[0021] 取40克桑蚕茧丝，60℃下质量分数为5%单硬脂酸甘油硫酸酯钠盐浸泡30min,浴比1:50，之后用质量分数为0.01%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,重复上述步骤两次,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10,胰蛋白酶浓度10g/L,温度37℃的PBS缓冲液（pH = 8）中浸泡60min脱胶，去离子水洗净后\n60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0022] 实施例4\n[0023] 取40克桑蚕茧丝，50℃下质量分数为5%单硬脂酸甘油硫酸酯钠盐浸泡30min,浴比1:10，之后用质量分数为0.01%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,重复上述步骤两次,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10, 胰蛋白酶浓度10g/L,温度37℃的碳酸氢铵缓冲液（pH = 8）中浸泡100min脱胶，去离子水洗净后60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0024] 实施例5\n[0025] 取40克桑蚕生丝，50℃下质量分数为1%顺丁烯二酸二仲辛酯磺酸钠浸泡30min,浴比1:10，之后用质量分数为0.1%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10,木瓜蛋白酶浓度2g/L,温度65℃的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=7）中浸泡60min脱胶，去离子水洗净后60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0026] 实施例6\n[0027] 取40克桑蚕生丝，60℃下质量分数为1%顺丁烯二酸二仲辛酯磺酸钠浸泡30min,浴比1:20，之后用质量分数为0.05%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,重复上述步骤两次,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10, 木瓜蛋白酶浓度1g/L,温度65℃的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=7）中浸泡100min脱胶，去离子水洗净后60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0028] 实施例7\n[0029] 取40克桑蚕茧丝，40℃下质量分数为2%脂肪醇聚氧乙烯醚浸泡30min,浴比\n1:10，之后在质量分数为0.01%的碳酸氢钠水溶液煮沸，浴比1:50，时间30min,重复上述步骤两次,去离子水冲洗干净后，放入60℃烘箱中烘干，烘干后的蚕丝在浴比1:10,木瓜蛋白酶浓度4g/L,温度55℃，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=6）中浸泡60min脱胶，去离子水洗净后60℃烘箱中烘干。干燥后的脱胶丝经过9.3M溴化锂溶液溶解，3～4天去离子水透析获得纯丝素蛋白溶液。\n[0030] 参见附图 1，它是按不同脱胶方法得到的蚕丝纤维经苦味酸胭脂红染色后的K/S曲线图；图中，曲线a、b、c、d和e依次为未脱胶的蚕丝、NaHCO3 脱胶、NaHCO3 —木瓜酶脱胶、NaHCO3 —碱性蛋白酶脱胶、Na2CO3脱胶的样品；图1表明，波长为520nm时为胭脂红的吸收峰，吸收程度由大到小依次为样品a、b、c、d、e，最高值的曲线为未脱胶的蚕丝，样品b仍然可以看到胭脂红的吸收峰，说明存在丝胶，样品c、d、e几乎是平直的，并且区别很小，表明丝胶已几乎不存在，证明采用本实施例的技术方案，能使丝胶去除完全。\n[0031] 参见附图2，它是按不同脱胶方法得到的丝素蛋白水溶液的电泳图片；图中c、d、e依次是NaHCO3 —碱性蛋白酶脱胶、Na2CO3 脱胶、NaHCO3 —木瓜酶脱胶后得到的丝素蛋白水溶液的样品，f、g、h、i、j、k依次为实施例2～7脱胶后得到的丝素蛋白水溶液的样品。浓缩胶为5%，分离胶为6%，用于分离分子量比较大的蛋白质，图片中的蛋白标准品（marker）的型号为SM0661，分子量范围为 10～200 kDa 。样品e的条带主要集中在200kD以上，丝素蛋白分子的H链分子量为369kD，因此，NaHCO3 —木瓜酶脱胶得到的丝素蛋白的H链分解的比较少，大部分分子量集中在200kD以上，样品c的条带部分比样品e的范围广，说明NaHCO3 —碱性蛋白酶脱胶比NaHCO3 —木瓜酶脱胶得到的丝素蛋白分解多一些。而样品d的整个条带的颜色都比较深，整个范围内都存在蛋白质分子，说明Na2CO3 脱胶的丝素蛋白分子很大一部分已经被分解，并且分解的比较厉害。而f、g、h、i、j、k依次为实施例2～\n7脱胶后得到的丝素蛋白水溶液的样品，它们的条带与样品e的一致，说明本发明提供的技术方案可以得到大分子量的丝素蛋白分子。