用于治疗帕金森病的方法

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用于治疗帕金森病的方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及用于治疗帕金森病或抵抗帕金森病的症状的组合物和方法。\n背景技术\n[0002] 帕金森病(PD)是中枢神经系统的变性障碍。帕金森病的运动症状源自黑质(中脑的一个区域)中多巴胺产生细胞的死亡；该细胞死亡的原因不明。在PD的临床症状变成明显的时间之前，大约70-80％的纹状体多巴胺能神经元已经丧失。在该疾病的进程的早期，最明显的症状是运动相关的。以后，认知和行为问题可能产生，通常在该疾病的晚期发生痴呆。尽管多巴胺能治疗能够有效地治疗该疾病的早期阶段的运动症状，但是，它不是令人满意的治疗，因为它的效力在该疾病的晚期阶段发生损耗，并且它的长期使用会导致运动并发症。\n[0003] 帕金森病(PD)的主要运动症状运动徐缓、运动不能和休息性震颤源自纹状体DA含量的下降，该下降会造成神经元回路中的失衡。\n[0004] 使用DA(多巴胺)前体L-二羟基苯丙氨酸(左旋多巴(L-Dopa))或多巴胺(D)2/3受体激动剂的DA(多巴胺)替代疗法是当前治疗策略的主流。但是，这样的治疗仅仅控制主要疾病临床症状，不会治疗该疾病的根本原因，即多巴胺能细胞的进行性损失。相反，由于异常不随意运动(AIM)或运动障碍的诱导，它们可能使情形复杂化。此外，使用左旋多巴的长期治疗伴有它的效应的不能预见的波动。因此，需要新策略来治疗运动症状，改善或预防运动障碍，以及延迟、预防或逆转多巴胺能神经元损失。因而，干扰这些事件中的一个、或理想地干扰这些事件中的几个的治疗剂可以潜在地导致可能具有PD的缓解疾病性能的新类型的药物。预期这些新药物象左旋多巴一样有效，但是应当不会诱导运动波动或与多巴胺能治疗交叉敏化。\n[0005] 在PD的早期阶段，左旋多巴被代谢成多巴胺，所述多巴胺存储在纹状体的存活突触前多巴胺能纤维末梢(充当存储器和缓冲器)中。如果反馈回路是完整的，那么它的释放受到控制。但是，随着越来越多的末梢发生损失，对多巴胺的存储和缓冲能力发生损失，并且左旋多巴的效应的持续时间缩短。因而，经口摄入和随后基底神经节的搏动暴露会引起峰剂量运动障碍和/或运动波动。黑质变性已经发展至运动症状出现的水平以后，左旋多巴的单次注射足以建立被称作‘激发’的应答(Morelli等人，1987；Delfino等人，2004)：左旋多巴已经被施用并诱导运动障碍以后，每次随后的药物暴露将会引起该应答-即使它还没有施用几周。弱NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗剂金刚烷胺可以降低运动障碍强度，从而提示，谷氨酸能输入在基底神经节中的过度活性牵涉激发和运动障碍(Blanchet等人，\n1998)。临床和临床前研究提供了运动障碍的动物和患者中纹状体的改变的谷氨酸能功能的证据，包括谷氨酸受体的表达、磷酸化和突触组构的变化(Chase等人，2000)。此外，在纹状体中富含含有NR2B亚基的NMDA受体，且有证据表明，AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸)受体拮抗剂也可以抑制运动障碍(Bibbiani等人，2005)。这些数据似乎指示，运动障碍涉及异常的谷氨酸能皮质纹状体输入。\n[0006] 为了逆转建立的运动障碍或首先预防运动障碍的发生，一个方案是，在治疗的早期替代多巴胺能治疗。由于它们在基底神经节内的独特分布以及它们与多巴胺相关细胞内信号传递级联的相互作用，已经开发了A2A拮抗剂和NR2B-亚基选择性的NMDA拮抗剂。但是，使用A2A拮抗剂(伊曲茶碱，Mizuno等人，2010)或NR2B拮抗剂(曲索罗地，Nutt等人，2008)作为PD患者中的治疗的临床试验没有表明预期的效力。\n[0007] 如已提及的，经典地将激发定义为这样的过程：通过该过程，脑变得敏化，使得多巴胺能疗法的施用会改变对随后多巴胺能治疗的应答。在切除神经的脑中的急性多巴模拟物治疗会诱导激发。\n[0008] 单侧6-羟基多巴胺(6-OHDA)损害的大鼠模型可以代表激发的定量模型。用多巴胺能药物(左旋多巴或多巴胺激动剂)长期治疗的这样的6-OHDA损害的大鼠发生对侧旋转(rotation)(即远离损害侧)的进行性增加，这被称作“行为敏化”。在该模型中，所谓的‘激发”剂量的DA受体激动剂的施用会使动物对DA激动剂的随后攻击的效应敏化。\n[0009] 当受试者变成对某种物质(其不同于所述受试者已经敏化的物质)敏化时，可以观察到“交叉敏化”的现象。\n[0010] 已经在偏侧帕金森病(hemiparkinsonian)小鼠的咖啡因-和左旋多巴-诱导的行为之间观察到交叉敏化(Yu等人，2006)。\n[0011] 腺苷受体代表被称作嘌呤受体的嘌呤核苷酸和核苷G蛋白偶联受体集合中的一个亚类；主要的药理学上不同的腺苷受体亚型被称作A1、A2A、A2B和A3。在脑中的优势腺苷受体亚型是A1和A2A。尽管A1腺苷受体亚型以高密度遍布于脑中，A2A受体的分布是更受限的；它以高密度存在于纹状体(尾状壳核、伏核、嗅觉结节)中，在此处它与多巴胺D2受体一起共同定位在纹状体-苍白球的输出神经元上。A2A受体在纹状体内的不连续定位和它的在功能上拮抗D2受体的作用的能力，已经提示A2A受体拮抗剂用于帕金森病(PD)的对症治疗的潜在效用。\n[0012] N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体是亚基的异聚体组件。2个基本亚基家族被命名为NR1和NR2。NR2亚基家族分成4种亚基类型，它们是NR2A、NR2B、NR2C、NR2D，它们表现出不同的生理学和药理学性能，诸如离子门控、镁敏感性、药理学特性和在解剖学分布方面。\n[0013] 尽管NMDA受体抑制主要在疼痛和神经变性疾病的治疗中具有治疗效用，许多可得到的NMDA受体拮抗剂存在可以造成潜在严重副作用的显著倾向。NR2B亚基在中枢神经系统中的更加不连续的分布可能支持选择性地作用于该部位的药剂的减少的副作用特性。但是，即使选择性的NR2B拮抗剂也可能表现出对NMDA受体的NR2B亚基的低亲和力。并且，一些NR2B拮抗剂(其据称是NR2B选择性的)可能不是完全特异性的。\n[0014] Hauber和Munkle(1996)声称，通过非选择性的腺苷受体拮抗剂/磷酸二酯酶抑制剂茶碱的共同施用，可能增强NMDA受体拮抗剂CGP37849(竞争性的)和地佐环平(MK-801，非竞争性的)的抗僵硬作用。\n发明内容\n[0015] 本发明涉及用于治疗帕金森病、或抵抗帕金森病的或与帕金森病有关的症状、或抵抗帕金森病的治疗副作用的组合物和方法。\n[0016] 本发明的第一方面涉及在哺乳动物中治疗帕金森病(PD)的方法，所述方法包括：\n施用第一种药学试剂和第二种药学试剂，其中所述第一种药学试剂是腺苷受体2(A2A)的拮抗剂，且所述第二种药学试剂是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚型NR2B的拮抗剂。\n[0017] 本发明的第二方面涉及治疗帕金森病的方法，其中将A2A拮抗剂和NR2B拮抗剂基本上与左旋多巴一起施用。在疾病的早期阶段且在使用左旋多巴之前，或在已经开始施用左旋多巴之后与左旋多巴结合地，施用A2A拮抗剂和NR2B拮抗剂。\n[0018] 本发明的第三方面涉及一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的治疗有效量的腺苷A2A受体拮抗剂和NR2B拮抗剂的组合。\n[0019] 本发明的第四方面涉及部件套件(a kit of parts)，其包括：\n[0020] (a)第一容器(containment)，其含有包含治疗有效量的A2A受体拮抗剂的药物制剂，和\n[0021] (b)第二容器，其含有包含治疗有效量的NR2B拮抗剂的药物制剂。\n[0022] 本发明的其它方面将从详述的说明书中显而易见。\n具体实施方式\n[0023] 本发明的主要方面由在哺乳动物中治疗帕金森病(PD)的方法组成，所述方法包括：施用第一种药学试剂和第二种药学试剂，其中所述第一种药学试剂是腺苷受体2(A2A)的拮抗剂，且所述第二种药学试剂是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚型NR2B的拮抗剂。\n[0024] A2A拮抗剂是通过正构相互作用或通过变构相互作用阻断或抵抗A2A受体的功能的化学化合物或肽或蛋白。也就是说，将阻止内源性配体腺苷或A2A激动剂刺激受体和引起作用的试剂。重要的是，本发明是基于A2A拮抗剂(即选择性的腺苷受体拮抗剂)的应用。\n[0025] NR2B拮抗剂是阻断或抵抗NR2B受体的功能的化学化合物或肽或蛋白，迄今鉴别出的所有NR2B选择性的拮抗剂都通过结合受体上的变构位点而起作用。共激动剂谷氨酸盐(glutamate)和甘氨酸(或NMDA)对NR2B受体的活化会导致钙的流入，所述流入可以被拮抗剂阻止。\n[0026] 多种A2A拮抗剂是已知的，并且已经在例如下述国际专利申请中要求保护，它们的公开内容通过引用并入本文：WO 2012/03898、WO2011/06152、WO 2011/06020、WO 2011/\n053507、WO 2010/040003、WO2010/037122、WO 2009/055308、WO 2009/050198、WO 2008/\n055711、WO 2007/047293、WO 2007/038212、WO 2006/137527、WO 2006/129626、WO 2006/\n124770、WO 2006/083949、WO 2012/03898、WO 2011/06152、WO 2011/06020、WO 2011/\n05350、WO 2010/04000、WO 2010/03712、WO 2009/055308、WO 2009/050198、WO 2008/\n055711、WO 2007/047293、WO 2007/038212、WO 2006/137527、WO 2006/129626、WO 2006/\n124770、WO 2006/083949。\n[0027] 已知的A2A拮抗剂包括下述的，其中的一些正在临床开发中：\n[0028] ●伊曲茶碱(KW-6002)\n[0029] ●MSX-3\n[0030] ●普瑞丁奈(SCH-420,814)\n[0031] ●PFB-509\n[0032] ●SCH-58261\n[0033] ●SCH-412,348\n[0034] ●SCH-442,416\n[0035] ●SCH-800900\n[0036] ●ST-1535\n[0037] ●ST-4206\n[0038] ●咖啡因\n[0039] ●VER-6623\n[0040] ●VER-6947\n[0041] ●VER-7835\n[0042] ●V-81444\n[0043] ●Vipadenant(BIIB-014)\n[0044] ●ZM-241,385\n[0045] 一种优选的A2A拮抗剂选自伊曲茶碱(KW-6002)、ASP5854、Vipadenant(BIIB014)、ST-1535、普瑞丁奈(SCH420814)、SYN-115、ZM-241,385、V-81444。\n[0046] 伊曲茶碱(KW-6002)的化学结构如下：\n[0047]\n[0048] ASP5854(5-[5-氨基-3-(4-氟苯基)吡嗪-2-基]-1-异丙基吡啶-2(1H)-酮)的化学结构如下：\n[0049]\n[0050] Vipadenant(BIIB014)的化学结构如下：\n[0051]\n[0052] ST-1535的化学结构如下：\n[0053]\n[0054] 普瑞丁奈(SCH420814)的化学结构如下：\n[0055]\n[0056] ZM-241,385的化学结构如下\n[0057]\n[0058] 在本发明的一个实施方案中，在本发明中使用的A2A拮抗剂是式(I)之一[0059]\n[0060] 它是4-羟基-4-甲基-哌啶-1-甲酸(4-甲氧基-7-吗啉-4-基-苯并噻唑-2-基)-酰胺，及其药学上可接受的酸加成盐和共晶(co-crystal)。\n[0061] 多种NR2B拮抗剂是已知的，并且已经在例如下述国际专利申请中要求保护，它们的公开内容通过引用并入本文：WO 2010/1221、WO2009/118187、WO 2009/058261、WO 2009/\n025265、WO 2008/155778、WO 2007/099828、WO 2007/063839、WO 2007/063286、WO 2007/\n006157、WO 2006/137465、WO 2006/113471、WO 2006/017409、WO 2006/010967、WO 2006/\n010964、WO 2005/102390、WO 2005/080317、WO 2005/035522、WO 2005/030720、WO 2005/\n035523、WO 2005/019222、WO 2005/019221、WO 2004/108705、WO 2004/089366、WO 2004/\n048364、WO 2004/054579、WO 03/091241、WO 03/084931、WO 03/010159、WO 02/100352、WO02/080928、WO 02/068409、WO 02/34718、WO 02/12892、WO 02/09736、WO 02/00629、WO \n01/98262、WO 01/30330、WO 01/32634、WO01/32171、WO 01/32177、WO 01/32615、WO 01/\n32179、WO 01/32174、WO 00/67803。\n[0062] 已知的NR2B拮抗剂包括下述的，其中的一些正在临床开发中。\n[0063] ●MK-0657\n[0064] ●曲索罗地(CP-101,606)\n[0065] ●EVT-101\n[0066] ●EVT-102\n[0067] ●EVT-103\n[0068] ●雷拉地尔(RGH 896)\n[0069] ●RG-1\n[0070] ●ED-1529\n[0071] ●NeurOp\n[0072] ●NeurOp-2\n[0073] ●NeurOp-3\n[0074] ●NeurOp-4\n[0075] ●TXT-0300\n[0076] ●HON-0001\n[0077] ●艾芬地尔\n[0078] ●safaprodil\n[0079] ●N-{(1S,3S)-3-[3-(4-甲基苄基)-1,2,4-噁二唑-5-基]环戊基}-1H-吡唑并[3,\n4-d]嘧啶-4-胺(在下面和在表1中也命名为“化合物1”)。\n[0080] 本文中提及的NR2B拮抗剂或A2A拮抗剂是商购可得的，或可以根据本领域技术人员已知的方法(包括在本文中提及的专利参考文献)制备。\n[0081] 一种优选的NR2B拮抗剂选自曲索罗地(CP-101,606)、雷拉地尔(RGH 896)、EVT-\n101、EVT-102、EVT-103、艾芬地尔、MK-0657、Safaprodil或命名为化合物1的N-{(1S,3S)-3-[3-(4-甲基苄基)-1,2,4-噁二唑-5-基]环戊基}-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺。\n[0082] 曲索罗地(CP-101,606)的化学结构如下：\n[0083]\n[0084] 雷拉地尔(RGH 896)的化学结构如下\n[0085]\n[0086] EVT-101的化学结构如下\n[0087]\n[0088] 艾芬地尔的化学结构如下\n[0089]\n[0090] MK-0657的化学结构如下\n[0091]\n[0092] Safaprodil的化学结构如下：\n[0093]\n[0094] N-{(1S,3S)-3-[3-(4-甲基苄基)-1,2,4-噁二唑-5-基]环戊基}-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物1)的化学结构如下：\n[0095]\n[0096] 在本发明的一个实施方案中，所述A2A拮抗剂具有超过其它腺苷受体亚型A1、A2B和A3中的每一种至少10倍的选择性、优选30倍的选择性和理想地100倍或更多的选择性。\n[0097] 在本发明的一个实施方案中，所述NR2B拮抗剂具有超过其它NMDA受体亚型NR2A、NR2C和NR2D中的每一种至少10倍的选择性、优选30倍的选择性和理想地100倍或更多的选择性。\n[0098] 在本发明的一个实施方案中，A2A拮抗剂与NR2B拮抗剂的剂量比率(ratio)在30:1至1:30之间变化，在另一个实施方案中，它在10:1至1:10之间变化，在另一个实施方案中，它在3:1至1:3之间变化，在另一个实施方案中，它是约1:1。\n[0099] 在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含作为NR2B拮抗剂的雷拉地尔和作为A2A拮抗剂的Tozadenant的组合。这2种化合物之间的比率可以在30:1至1:30之间变化，在另一个实施方案中，它在10:1至1:10之间变化，在另一个实施方案中，它在3:1至1:3之间变化。\n[0100] 在根据本发明的方法中，基本上同时施用两种药学试剂：A2A拮抗剂和NR2B拮抗剂。\n在一个实施方案中，单独地或与用于治疗PD的其它药物产品联合地准确地同时施用它们。\n[0101] 在另一个实施方案中，已经开始左旋多巴的施用以后，在任意时间一起施用所述A2A拮抗剂和所述NR2B拮抗剂。\n[0102] 在另一个实施方案中，在疾病的治疗过程中，在任意时间与多巴胺激动剂一起施用所述A2A拮抗剂和所述NR2B拮抗剂。\n[0103] 在另一个实施方案中，与左旋多巴一起施用所述A2A拮抗剂和所述NR2B拮抗剂。左旋多巴目前是治疗帕金森病的黄金标准。标准制剂(息宁，Atamet)将左旋多巴与卡比多巴组合，这会改善左旋多巴的作用并减少一些它的副作用，特别是恶心。剂量会变化，尽管经常每天在3或4个分份剂量中施用所述制剂。\n[0104] 左旋多巴/卡比多巴的典型剂量是：在疾病的早期阶段中，左旋多巴/卡比多巴\n100/25mg，3次/天。在晚期阶段，可以每天施用多达1000mg左旋多巴和30mg卡比多巴，尽管当前的推荐不建议高于400-600mg左旋多巴的剂量。\n[0105] 用于治疗PD的其它药物产品包括金刚烷胺 苯扎托品\n溴隐亭 恩他卡朋 培高利特 普拉\n克索 罗匹尼罗 司来吉兰 息宁 (卡比多巴/\n左旋多巴)、托卡朋 罗替高汀\n[0106] 在本发明的一个实施方案中，每天1次单独地或与左旋多巴一起施用所述A2A拮抗剂和所述NR2B拮抗剂。\n[0107] 本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中或与药学上可接受的赋形剂混合的、治疗有效量的腺苷A2A受体拮抗剂和NR2B拮抗剂的组合。\n[0108] 在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物中A2A拮抗剂与NR2B拮抗剂的剂量比率在30:1至1:30之间变化，在另一个实施方案中，它在10:1至1:10之间变化，在另一个实施方案中，它在3:1至1:3之间变化，在另一个实施方案中，它是约1:1。\n[0109] 在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含作为NR2B拮抗剂的雷拉地尔和作为A2A拮抗剂的Tozadenant的组合。这2种化合物之间的比率可以在30:1至1:30之间变化，在另一个实施方案中，它在10:1至1:10之间变化，在另一个实施方案中，它在3:1至1:3之间变化。\n[0110] 所述药物组合物可以是在一个片剂中将腺苷A2A受体拮抗剂与NR2B拮抗剂组合的固定组合，或者所述药物组合物可以是部件套件。\n[0111] 在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物形成部件套件，其包括：\n[0112] (a)第一容器，其含有包含治疗有效量的A2A受体拮抗剂的药物制剂，和[0113] (b)第二容器，其含有包含治疗有效量的NR2B拮抗剂的药物制剂。\n[0114] 根据本发明的组合物可以用于制备药物组合物，所述药物组合物用于治疗帕金森病。这样的组合物通常含有活性药物成分和药学上可接受的赋形剂。\n[0115] 合适的稀释剂和载体可以呈多种形式，取决于期望的施用途径，例如，口服途径、直肠途径、胃肠外途径或鼻内途径。\n[0116] 适合用于口服施用的药物组合物可以是固体或液体，且可以例如呈片剂、丸剂、糖衣丸、明胶胶囊剂、溶液、糖浆剂、口香糖等的形式。\n[0117] 可以例如口服地、胃肠外地(即，静脉内地、肌肉内地或皮下地)、鞘内地、通过吸入或鼻内地施用包含根据本发明的化合物的药物组合物。\n[0118] 为此目的，可以将活性成分与惰性稀释剂或无毒的药学上可接受的载体(诸如淀粉或乳糖)混合。任选地，这些药物组合物还可以含有：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶，崩解剂诸如海藻酸，润滑剂诸如硬脂酸镁，助流剂诸如胶体二氧化硅，甜味剂诸如蔗糖或糖精，或着色剂或矫味剂诸如薄荷或水杨酸甲酯。\n[0119] 本文使用的“药学上可接受的盐”表示这样的衍生物：其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐而修饰。药学上可接受盐的例子包括、但不限于：碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括母体化合物(例如从无毒的无机或有机酸形成)的常规无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括从无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)衍生出的盐；以及从有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。\n[0120] 本发明也预见到可以以受控方式释放活性物质的组合物。可以用于胃肠外施用的药物组合物是呈常规形式，诸如通常被包含在安瓿、一次性注射器、玻璃或塑料管形瓶或输注容器中的水性或油性溶液或悬浮液。\n[0121] 除了活性成分以外，这些溶液或悬浮液还可以任选地含有：无菌稀释剂诸如注射用水、生理盐水溶液、油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂，抗细菌剂诸如苯甲醇，抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂诸如乙二胺四乙酸，缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节渗量的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。\n[0122] 本发明还包括这样的药物组合物：其含有呈药学上可接受的共晶形式的本发明的化合物。\n[0123] 剂量可以在宽限度内变化，并且当然必须在调节至在每个特定情况下的个别需要。在口服施用的情况下，成年人的剂量可以在约0.01mg至约1000mg/天的通式I的化合物或对应量的其药学上可接受的盐之间变化。所述日剂量可以作为单剂量或分份剂量来施用，并且另外也可以超过上限(当发现指出该情况时)。\n[0124] 优选地，为了治疗人患者而施用的所述A2A拮抗剂和所述NR2B拮抗剂中的每一种或它的药学上可接受的盐的量调至每天约2mg至约200/1000mg。总每日剂量可以作为单剂量或分份剂量来施用。这样的每日治疗量或总每日剂量可以是约5mg至约45mg、约6mg至约\n35mg、约8mg至约30mg、约10mg至约25mg、约12mg至约20mg、约14mg至约18mg、约15mg至约\n18mg、或所有上面列出的量中的任意范围。例如，每日治疗量是约2mg、5mg、约6mg、约8mg或约10mg至约12mg、约14mg、约15mg、约16mg、约18mg、约20mg、约25mg、约30mg或约35mg。具体地，每日治疗量是约2mg或约4mg至约20mg、约25mg或约30mg。\n[0125] 可得到的数据提示，在根据本发明的组合物和使用方法中涉及协同作用。\n[0126] 实施例\n[0127] 帕金森病(PD)的经典运动症状与黑质多巴胺能细胞的损失和尾状壳核多巴胺含量的下降(其导致多巴胺替代疗法的引入)有关。6-羟基多巴胺(6-OHDA)向内侧前脑束中的单侧立体定位注射会造成黑质纹状体途径的破坏和向纹状体的多巴胺能输入的损失。\nUngerstedt(Ungerstedt1971；Ungerstedt和Arbuthnott 1970)在1970年开发的该模型模仿晚期PD的状态，并用于试验针对症状的药物。在一个脑半球内的多巴胺能系统的大量病损会建立两个体测之间的感觉运动失衡，从而导致特定的行为缺陷。刺激通常被多巴胺靶向的突触后受体位点的药物(例如，多巴胺激动剂或左旋多巴)会造成大鼠在与被破坏侧相对的方向转动(逆向旋转)。该转动应答被视作多巴胺能受体超敏感性的后果，所述超敏感性发生在纹状体(的某些部分)的去神经支配之后(关于综述，参见Schwarting和Huston \n1996)。\n[0128] 长久以来，左旋多巴诱导的对侧转动(contralateral turning)应答已经代表一种有用的且预测性的筛选和鉴别新抗-帕金森病药物的模型，从而定量地评估药物对感觉运动恢复的影响。\n[0129] 已经证实，A2A/NR2B拮抗剂的组合使用与单独的每种拮抗剂相比会提供下述惊人优点：\n[0130] ●在药物首次用于实验的帕金森病大鼠(尚未接受任何治疗的帕金森病大鼠)中的单一治疗(单独NR2B/A2A combo的施用)：可以证实，对运动症状的效力与完全有效剂量的左旋多巴所达到的效力相当/基本上类似，但是不像左旋多巴，长期(chronic)combo治疗不会产生运动并发症。\n[0131] ●在左旋多巴激发的大鼠(即通过先前的左旋多巴治疗造成运动障碍的大鼠)中的单一治疗(单独NR2B/A2A combo的施用)：在没有异常运动存在下完全恢复运动活动的能力。\n[0132] ●向非活性剂量的左旋多巴的追加治疗：该组合会提供有效的非活性剂量的左旋多巴；这发生在没有异常运动存在下。向活性剂量的左旋多巴的追加治疗：该组合会增强左旋多巴对对侧旋转的影响并减少左旋多巴诱导的-AIM在长期治疗中的发展(即抗左旋多巴激发效应)。\n[0133] 方法\n[0134] 帕金森病的临床前模型:单侧6-OHDA损害的大鼠模型\n[0135] 受试者：使用雄性Sprague-Dawley大鼠(Janvier，法国)，在外科手术时体重为\n250-275g，在药物试验时体重为400-450g。\n[0136] 在从饲养者到达之后且在实验之前，使大鼠在动物间内的居住笼中习惯1周(5只大鼠/笼子)。将它们保持在12:12光/暗周期，其中在06:00h开灯，并在维持于20-21℃的温度和约40％的湿度圈养。在分配至实验组之前，所有动物自由接近标准丸粒食品和水。\n[0137] 用于6-ODHA损害的外科手术\n[0138] 在外科手术当天，到达以后1周，大鼠接受向右内侧前脑束中的单侧6-OHDA注射。\n在外科手术之前15分钟，给每只大鼠施用盐酸丙米嗪(Sigma)，以保护去甲肾上腺素能(NE)神经元。将大鼠用氯胺酮(Ceva，75mg/kg)和赛拉嗪(Bayer，10mg/kg)麻醉，并放在立体定位框(David Kopf Instrument)中。在注射部位上方在头盖骨中钻一个小孔以后，在相对于前囟点和硬脑膜表面的下述坐标(以mm计)将6-OHDA注射进右上升内侧前脑束中：AP＝-3.5，ML＝-1.5，DV＝-8.7。每只大鼠接受持续5分钟(0.5μl/min)的1次6-OHDA(4μg/μl)注射，每只大鼠共计10μg。在4分钟以后抽出针头，以避免毒素回流。然后将动物放在热源下的清洁笼子中，并允许在随意获取食品和水的情况下恢复。定期监测和操作每只大鼠持续3周，以确保完全恢复和顺应实验者和环境。\n[0139] 6-OHDA损害的评价\n[0140] 为了选择成功地损害的动物，在外科手术后第21天将所有大鼠用小剂量的阿扑吗啡(Sigma，0.05mg/kg，皮下)攻击。在研究中包括在45-min记录时段时表现出超过90逆向旋转(360°)的大鼠。以前已经证实，满足这些判据的大鼠具有多巴胺能神经元的单侧损失和超过95％(内部数据)的纹状体多巴胺的单侧耗竭。\n[0141] 使用的A2A和NR2B拮抗剂\n[0142] 将A2A和NR2B拮抗剂参照化合物溶解在每千克5ml媒介物的体积中。以5ml/kg的体积，将左旋多巴甲酯(Sigma)和苄丝肼(Sigma)溶解在生理盐水溶液中。用含有1％甲基纤维素的5％二甲亚砜(DMSO)和95％蒸馏水，制备参照化合物的媒介物溶液。以4μg 6-OHDA/μl的浓度，将用于损害的6-OHDA-HBr溶解在0.02％抗坏血酸盐-蒸馏水中。\n[0143] 使用下述A2A拮抗剂：SCH-58261、普瑞丁奈、Tozadenant和KW-6002。使用的NR2B拮抗剂是雷拉地尔、Co-101244、化合物1。除了仅仅口服地施用的Tozadenant以外，通常腹膜内地施用药物。所以，当与Tozadenant联合施用雷拉地尔时，在该情况下，口服地施用雷拉地尔。\n[0144] 行为记录设备\n[0145] 旋转活动(同侧/对侧旋转)\n[0146] 使用自制的计算机化的系统，记录旋转行为。将大鼠固定在铠甲中，所述铠甲连接至机械传感器，所述机械传感器与个人计算机(PC)直接连接。自动地记录每个360°顺时针或逆时针转动，直到达到240分钟最大值。在实验中，将大鼠分配至各个试验笼。可以将8个透明丙烯酸室(50×40cm)中的每一个细分成4个25×22cm的单个方形试验笼，所述丙烯酸室放在水平的透明玻璃底上，由稳健的框支撑。可除去的丙烯酸板充当盖子。将便携式数字照相机(Samsung，SCB-3001PH)直接定位在每个场所的下面，以便观察被室覆盖的整个表面。该安排允许借助于1个照相机同时记录1或4只大鼠，每个期间共记录32只大鼠中的8只。\n用单独固定在框的每条腿上的氖管提供光照。将影像序列记录在硬盘上进行存储，并随后传送至个人计算机用于分析和保存。\n[0147] 一般活动(距离和后腿站立(rearing))\n[0148] 记录在测量水平和垂直运动的大开放场内的一般活动，并连接至个人计算机。在\n12个室(LE8811IR，Panlab)中单个地试验大鼠，每个室由0.5cm透明丙烯酸片制成的正方形外壳组成，没有底(45×45cm表面×40cm高度)。将每个外壳放在充当底板的正方形不锈钢(inox)片上。将塑料包被的片调节进板中。将每个设备放在73.5cm高度的实验室台子上。通过16个以3cm高度位于外壳的每侧上的红外光束传感器，检测和测量行进。传感器彼此间隔\n2.5cm，并与侧面的每个末端相距4.0-cm，使得光束在表面上方形成15×15正方形矩阵。由个人计算机记录活动计数。使用Acti-Track软件(Actitrack°，Panlab)将在获取期(acquisition session)中产生的原始数据转化成统计上可分析的参数。将参数“移动的距离”和“后腿站立计数”保持为有关的因变量。\n[0149] 在开放场中的行为特性分析\n[0150] 经由8个与影像获取系统连接的照相机，记录单侧6-OHDA损害的大鼠的具体行为特性。将处理下的大鼠自由地放在小环境(转子流量计(rotometer)，25×22cm)或大开放场(50×40cm)中，并对行为进行影像记录55分钟(共3300秒)。在小(转子流量计)或大(开放场)环境中的放置可能取决于试验。如在关于旋转活动的部分中所述，从下面记录大鼠。\n[0151] 现场数据记录以后，随后通过Ethovision程序(得自Noldus，版9.0)分析影像。根据3个点(鼻子、中心和尾巴)定义动物和它的运动和位移。根据在程序中用特定标准和阈值限定的过滤器分析，建立运动、身体的位置和空间占据。分析不同的行为参数，并且仅将有关的参数(即不相关的参数)保留用于最终的行为描述。\n[0152] 用在Ethovision 9.0中定义的特定参数，进行异常不随意运动(“AIM”)的分析。参数“身体伸长”用于辨别大鼠的运动障碍的(即张力障碍的)位置的强度和频率。为此目的，确定了3个水平：\n[0153] -“收缩”＝严重AIM(阈值<30％)，该参数表示在这样的位置花费的时间(秒)：其中大鼠依靠它的后爪(垂直直立位置，具有严重的身体平截)，并表现出非常强的张力障碍的身体位置。从下面，身体形状看起来象圆圈。\n[0154] -“正常”＝中等AIM(阈值，30％<正常<50％)，该参数表示在这样的位置花费的时间(秒)：其中大鼠依靠3只爪子，并表现出中等张力障碍的位置(水平身体位置，具有一些身体平截)。\n[0155] -“伸长”＝无AIM(阈值>50％)，该参数表示在这样的位置花费的时间：其中大鼠更经常地依靠4只爪子(水平位置)，并表现出一些稳定性，没有身体的平截；\n[0156] 最终参数鉴别和用于分析的阈值的决定是基于在牢固地固定的确定分析中的第一直接观察结果。\n[0157] 用在影像分析程序(Ethovision 9.0)中选择的特定参数进行其它类型的行为的分析，以便尽可能最佳地描述视觉上观察到的行为，并且能够将它量化。从该分析中提取参数“距离”、“逆时针方向旋转”、“顺时针方向旋转”、“伸长”。从该系统得到的原始数据计算其它参数“回转半径(gyration radius)”。\n[0158] -距离(＝“距离”)：动物移动的总距离(cm)\n[0159] -逆时针方向(＝“同侧转动”)：在损害侧同侧意义上的同侧转动的360°转动次数的计数。\n[0160] -顺时针方向(＝“对侧转动”)：在损害侧对侧意义上的对侧转动的360°转动次数的计数。\n[0161] -伸长(＝“适当体位”)：在这样的位置花费的时间：其中大鼠用它的四只爪子站立，没有躯干的任何弯曲位置。在该程序中，这是用于辨别适当体位的强度和频率的参数“身体伸长”。将阈值固定在70％。\n[0162] -回转半径(＝“适当轨迹(trajectory)”)：对于特定的时间间隔，在该特定时间间隔内，动物位置和它的平均位置之间的平均距离。该参数反映了大鼠使用该场所的整个空间的能力，并以厘米为单位测量。\n[0163] 统计分析\n[0164] 一般活动(活动度测量计)和转动(转子流量计)：借助于参数统计，进行一般活动(距离和后腿站立)和旋转(对侧)的统计分析。\n[0165] 用A2A拮抗剂(2水平)和NR2B拮抗剂(2水平)作为组间因素并用时间(6或24水平)作为受试者内因素，通过三因素混合ANOVA评估在活动度测量计中测量的一般活动(距离和后腿站立)的水平。通过Tukey事后检验，进行平均值之间的多重逐对比较。\n[0166] 用药物治疗(4水平)作为组间因素，并用时间(12或18水平)作为受试者内因素，通过两因素混合ANOVA评价A2A和/或NR2B治疗对左旋多巴诱导的对侧转动水平的影响。通过LSD事后检验，进行平均值之间的多重逐对比较。\n[0167] 用长期期间作为受试者内因素(10期间水平)，通过两因素重复测量ANOVA来分析在A2A和/或NR2B拮抗剂+左旋多巴/苄丝肼治疗下的获取期的数据。使用F统计值，用计划的对比来评估平均值之间的差异的可靠性。另外，单独对变量“治疗”进行事后分析(Tukey,事后检验)。\n[0168] 对于每个检验，如果P<0.05，假定统计显著性。\n[0169] 特定行为分析：用参数统计值分析为彻底行为分析保留的5种行为(即距离、对侧转动、同侧转动、适当体位和适当轨迹)，但是假设没有观察到数据的方差均一性(对于相同方差的Bartlett氏检验)。这些后者用非参数统计(Kruskal-Wallis)进行分析。在两种情况下，进行单因素ANOVA以辨别不同治疗对每种独立行为的影响。通过Tukey事后检验或Dunn氏多重比较检验(p<0.05)，确定平均值之间的显著差异。\n[0170] 缩写的列表\n[0171] Ip:       腹膜内\n[0172] Po:       口服,口服施用\n[0173] mg/kg:    毫克/千克\n[0174] sec:     秒\n[0175] cm:       厘米\n[0176] Rad 3:    3mg/kg剂量的雷拉地尔\n[0177] Toz 30:   30mg/kg剂量的Tozadenant\n[0178] Combo:    A2A和NR2B受体拮抗剂的任意组合，和具体地特定情况：\n Tozadenant30mg/kg+雷拉地尔3mg/kg。\n[0179] CO1:    1mg/kg剂量的Co-101244\n[0180] SCH1:   1mg/kg剂量的SCH-58261\n[0181] Veh:    媒介物\n[0182] LD25:  左旋多巴25mg/kg\n[0183] LD/BZ:  左旋多巴+苄丝肼\n[0184] AIM:    异常的不随意运动\n[0185] 实验部分\n[0186] A.A2A拮抗剂与NR2B拮抗剂一起在偏侧帕金森病大鼠中的单一治疗\n[0187] 实施例1：在6个不同实施方案中A2A拮抗剂与NR2B拮抗剂的组合对活动量的效力[0188] 根据表1，在帕金森病的单侧6-OHDA损害的大鼠模型中试验了A2A拮抗剂与NR2B拮抗剂(＝COMBO)一起的6次不同共同施用。\n[0189] 记录的行为参数是“移动的距离”和“后腿站立计数”。这些后者(these latter)在活动度测量计中自动地测量。与用单独化合物进行的治疗相比，所有共同施用表明活动(距离和/或后腿站立计数)的水平的显著增加。\n[0190] 表1\n[0191]\n[0192] +:试验的A2A/NR2B组合，并且距离和/或后腿站立的活动优于单独化合物的试验[0193] 在每种组合(combo)中，这样的治疗对偏侧帕金森病大鼠行为的附加价值是显著的和意外的。与媒介物治疗的大鼠和用单独化合物治疗的大鼠相比，所有combo(如果适当的剂量选择)能够通过增加活动水平而恢复运动功能。另外，该刺激行为与典型不对称行为倾向性(bias)和用当前多巴胺能PD疗法(即DA激动剂或左旋多巴)观察到的异常体位(即张力障碍的体位)无关。在活动度测量计中试验的过程中，在视觉上观察到对行为的这种特定作用。\n[0194] 实施例2：用一个具体实施例(Tozadenant和雷拉地尔)证实所述组合对受刺激的运动活动量的效力\n[0195] NR2B拮抗剂和A2A拮抗剂的共同施用已经在6种不同combo中表现出活动(移动的距离和后腿站立计数)的水平的意外增加。当将动物放在活动室(活动度测量计)中时在视觉上观察到的该意外行为特性(即增加具有优良体位的运动活动)，在后面的实施例中进行了详细描述，并且通过不同行为参数的定量测量进行了举例说明。\n[0196] 将雷拉地尔(3mg/kg，po)与Tozadenant(30mg/kg，po)的口服共同施用对大鼠行为的影响与以下试验进行了对比：\n[0197] 1)单独的这些化合物\n[0198] 2)部分活性剂量的左旋多巴(25mg/kg，ip)\n[0199] 3)完全活性剂量的左旋多巴/苄丝肼(16/4mg/kg，ip)。\n[0200] 基于影像记录，用自动化的行为分析系统详细分析行为特性(参见关于描述的方法部分)。另外，还使用行为的经典测量结果(转子流量计和活动度测量计)来评估运动量。\n[0201] 运动量分析：刺激效应的持续时间\n[0202] 当在自动化设备中试验时，combo表现出持久效应，而活性剂量的左旋多巴/苄丝肼持续了约3小时，且部分活性剂量持续了约1小时(非常短的作用效力)。在使用combo的实验中，在口服施用化合物(即Tozadenant和/或雷拉地尔)以后60分钟，将大鼠放入试验场所中，而在左旋多巴施用(ip)以后10min将接受25mg/kg的左旋多巴的大鼠和在腹膜内施用以后15min将用左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠放入转子流量计中。\n[0203] 图2中的数据(即媒介物组、左旋多巴25组和左旋多巴/苄丝肼组的对比)来自不同实验，并一起分组用于后续分析。\n[0204] 图1：\n[0205] 右图：三因素混合ANOVA。雷拉地尔(3mg/kg)的显著影响，F(1,28)＝51.45,p<\n0.001。Tozadenant(30mg/kg)的显著影响，F(1,28)＝176.0,p<0.001。时间的显著影响，F(23,644)＝42.28,p<0.001。显著的《雷拉地尔×Tozadenant》相互作用，F(1,28)＝14.81,p<0.01。\n[0206] Tukey事后检验(p<0.05)：与得自VEH/VEH组、TOZ 30/VEH组和VEH/RAD 3组的那些评分相比，用TOZ 30/RAD 3组合治疗的大鼠具有更高的距离评分。\n[0207] 左图：三因素混合ANOVA。雷拉地尔(3mg/kg)的显著影响，F(1,28)＝9.40,p<0.01。\nTozadenant(30mg/kg)的显著影响，F(1,28)＝64.60,p<0.001。时间的显著影响，F(23,644)＝16.67,p<0.001。显著的《雷拉地尔x Tozadenant》相互作用，F(1,28)＝4.60,p<0.05。\n[0208] Tukey事后检验(p<0.05)：与得自VEH/VEH组、TOZ 30/VEH组和VEH/RAD 3组的那些评分相比，用TOZ 30/RAD 3组合治疗的大鼠具有更高的后腿站立评分。\n[0209] 图2：\n[0210] 治疗效应显示出显著影响F(2,21)＝43.68,p<0.001。还观察到时间的显著影响F(17,357)＝20.05,p<0.001以及显著的相互作用F(34,357)＝11.74,p<0.001。额外的事后对比检验表明，这仅仅是左旋多巴/苄丝肼的作用，其与媒介物治疗的大鼠相比具有显著活性(Tukey,p<0.05)。\n[0211] 运动质量分析：不同类型的行为的详细定量和定性\n[0212] 彻底行为分析表明，combo对偏侧帕金森病大鼠的行为具有意外作用：雷拉地尔和Tozadenant的组合(即“combo”)会恢复运动量，其与用活性剂量的左旋多巴/苄丝肼观察到的量相当(对于单独试验的化合物，并非如此)。另外，该combo也会提供行为质量的强改善。\n方向、轨迹和体位得到显著改善，并且对应于在未损害的大鼠中观察到的行为。\n[0213] 通常，左旋多巴-治疗的大鼠表现出(1)刻板的对侧旋转(完全不能从对侧方向转换至同侧方向)，(2)弯曲的体位，和(3)非常短的位移轨迹(回转半径)，因为它们在受到刺激时仅做紧密的对侧旋转。\n[0214] 相反，combo治疗的大鼠表现出(1)从对侧方向转换至同侧方向的能力，(2)没有弯曲体位(如果参照未损害的大鼠的位置则为适当体位，所述未损害的大鼠用它的4只爪子较好地站立，没有任何躯干变形)，和(3)更大的轨迹，因为它们直线移动，并且没有表现出任何紧密的刻板对侧旋转(象在左旋多巴下通常观察到的那些)。\n[0215] 表2：分成3个行为类别：(1)运动量，(2)转换方向的能力，(3)轨迹和体位，对比单独的雷拉地尔和Tozadenant、由“Tozadenant+雷拉地尔”组成的combo、以及部分活性剂量的左旋多巴(25mg/kg)和显著活性剂量的左旋多巴/苄丝肼(16/4mg/kg)的作用。结果代表与媒介物治疗的偏侧帕金森病大鼠相比变化的百分比；目的是测量恢复指数。为试验的2个不同时间点表达那些数据。\n[0216] 该表表明，combo-治疗的大鼠的运动量(距离)非常优于用媒介物治疗的大鼠观察到的量，并且该效应与由左旋多巴/苄丝肼-治疗的大鼠产生的效应相当。相反，与单独的化合物、媒介物和左旋多巴/苄丝肼-治疗的组的试验相比，使用combo时的“适当体位”和“适当轨迹”的百分比高度增加。与媒介物治疗的大鼠相比，左旋多巴/苄丝肼组也显示出向对侧的强倾向性。使用combo或使用单独的化合物时，没有观察到这样的倾向性。\n[0217] 表2\n[0218]\n[0219] 表示为媒介物治疗的百分比<200％  ‐\n[0220]                       200‐300％  +\n[0221]                       300‐500％  ++\n[0222]                          >500％   +++\n[0223]                         >1000％   ++++\n[0224] 图3显示了在试验的前20分钟和最后20分钟，combo产生与用左旋多巴/苄丝肼-治疗的大鼠观察到的量等量的运动(距离)的能力。\n[0225] 图4显示了combo的诱导同侧和对侧转动(运动)的能力，而左旋多巴/苄丝肼-治疗的大鼠仅表现出向对侧移动的能力。该观察结果清楚地证实了(1)在combo下的大鼠在受到刺激时能够从一个方向转换至另一个方向的能力，和(2)当combo-治疗的大鼠受到刺激时，这些大鼠的主要对侧旋转活动的缺失。\n[0226] 图5证实了与用左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠相比，combo-治疗的大鼠的轨迹和体位的改善。实际上，在记录的2个时间段中，在combo治疗的大鼠中通过回转半径测得的轨迹比用其它组观察到的轨迹更高。该观察结果定量地反映了在受到刺激时，与在它们的对侧旋转过程中执行非常紧密运动的左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠相比，用combo治疗的大鼠在试验场所中具有更大的轨迹。在combo下的大鼠的体位表明，即使那些大鼠受到治疗的刺激，它们也可以用它们的4只爪子站立，且不具有弯曲位置。\n[0227] 这些意外的观察结果和描述证实，利用联合治疗，可能在单侧6-OHDA损害的大鼠中实现等同水平的刺激，而没有通常与多巴胺能疗法有关的异常运动并发症。\n[0228] 实施例3：“Tozadenant+雷拉地尔”的联合施用对运动症状的效力，在长期治疗以后没有发展任何异常运动\n[0229] 使用combo的10天长期治疗没有导致任何用左旋多巴观察到的异常运动并发症的发展。即使经过对试验场所的一些习惯化过程，大鼠也保持活跃。尽管存在该正常现象，仍然观察到combo对活动水平和对运动质量的显著影响。\n[0230] 实施例4：combo对偏侧帕金森病大鼠的运动症状的效力，所述大鼠已经预先通过先前左旋多巴长期治疗造成完全运动障碍\n[0231] “Tozadenant+雷拉地尔”的联合施用具有在偏侧帕金森病大鼠中恢复增加的运动活动的能力。但是，该特定共同施用也具有完全意外的作用，因为它在左旋多巴-激发的偏侧帕金森病大鼠(其通过长期左旋多巴治疗造成完全运动障碍)中恢复了运动活动，没有异常不随意运动。\n[0232] 在14mg/kg的左旋多巴和3.5mg/kg的苄丝肼下治疗了10个获取期的偏侧帕金森病大鼠发展了增加的对侧旋转和严重异常不随意运动(AIM)的水平(即行为敏化)。与长期左旋多巴/苄丝肼治疗相一致，当在开放场中试验时，在该长期治疗结束时，它们表现出非常高的对侧旋转和AIM水平。当给这些高度运动障碍的偏侧帕金森病大鼠中断左旋多巴并在一些天以后(例如3天以后)用combo治疗时，我们观察到适当运动活动的完全恢复，没有任何异常不随意运动或没有对侧旋转水平的任何增加。在对侧旋转和AIM结果水平上的交叉敏化的这种缺失是完全意外的。\n[0233] 表3显示了，对于7种行为，当用媒介物、3mg/kg的雷拉地尔、30mg/kg的Tozadenant或combo治疗时，相对于相同大鼠(但是其中这些后者在几天以前用活性剂量的左旋多巴/苄丝肼治疗)表现的各种行为而言，大鼠表达的变化的百分比。\n[0234] 表3显示了，对于combo-治疗的大鼠：\n[0235] (1)与用左旋多巴/苄丝肼治疗的那些相当的移动的距离水平，而用单独化合物治疗的大鼠表现出降低的活动水平；\n[0236] (2)与用左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠相比，左旋多巴诱导的对侧旋转的减少和同侧旋转的增加；\n[0237] (3)与用左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠相比，在适当体位花费的时间的增加和改善的轨迹；\n[0238] (4)与用左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠相比，没有花费时间在表现异常不随意运动(AIM)。\n[0239] 图6和7表明，用左旋多巴/苄丝肼治疗10个获取期的大鼠表现出对侧转动水平的强增加(这在左旋多巴/苄丝肼下预见到)和没有同侧转动，而在combo下，那些大鼠仅表达较低水平的对侧转动和一定水平的同侧转动。该后一观察结果证实，在combo下刺激的大鼠能够从一个方向转换至另一个方向。与对侧旋转的强增加平行地，在左旋多巴下的大鼠具有在严重AIM中花费的时间的强增加，而一旦在combo下，那些大鼠花费的大多数时间是在“无AIM”位置(图8)。左旋多巴/苄丝肼治疗会高度地刺激大鼠。通过在那些大鼠中测量的移动距离的高水平，反映了该观察结果。但是，在combo下的大鼠表现出与在左旋多巴/苄丝肼下测量的那些等同水平的移动距离(图9)。这表明，combo效应(即使它没有诱导任何对侧旋转本身)仍然具有刺激动物的能力。非常令人感兴趣的是，与用左旋多巴/苄丝肼治疗时相比，用combo刺激的大鼠在“适当体位”花费更多的时间(图10)。combo-治疗的大鼠也表现出与在左旋多巴/苄丝肼下的治疗相比显示出好得多的空间占据和轨迹，因为它们的运动的回转半径与当用左旋多巴/苄丝肼治疗它们时相比增加(图11)。\n[0240] 表3\n[0241]\n[0242] ↑与LD/BZ下的治疗相比，行为增加\n[0243] ↓与LD/BZ下的治疗相比，行为减少\n[0244] 与LD/BZ下的治疗相比，行为无变化\n[0245] B.A2A拮抗剂与NR2B拮抗剂一起在偏侧帕金森病大鼠中的追加(add-on)治疗[0246] 实施例5：当在给亚活性或部分活性剂量的左旋多巴急性追加治疗中施用时的行为观察\n[0247] 与单独试验的化合物相比，NR2B拮抗剂与A2A拮抗剂的联合施用会增强亚活性或部分活性剂量的左旋多巴的效力。\n[0248] CO-101244+SCH-58261+亚活性剂量的左旋多巴\n[0249] 与媒介物治疗的大鼠相比以及与用单独化合物治疗的大鼠(所有组都用15mg/kg的左旋多巴治疗)相比，作为对亚活性剂量的左旋多巴(15mg/kg)的追加治疗施用的1mg/kg的Co-101244与1mg/kg的SCH-58261的共同施用显著地增加对侧旋转的水平。\n[0250] 图12：双因素ANOVA显示了治疗的显著影响(F3,28)＝5.62,p<0.01,时间的显著影响(11,308)＝22.21,p<0.001，和显著治疗×时间相互作用(F33,308)＝4.71,p<0.001.*,p<0.05:SCH1/CO1显著不同于VEH/VEH、SCH1/VEH和VEH/CO1组(LSD事后检验)。\n[0251] TOZADENANT+雷拉地尔+部分活性剂量的左旋多巴\n[0252] 与媒介物治疗的大鼠相比以及与用单独化合物治疗的大鼠(除了25mg/kg的左旋多巴以外)相比，作为对部分活性剂量的左旋多巴(25mg/kg)的追加治疗施用的3mg/kg的雷拉地尔与30mg/kg的Tozadenant的联合施用显著地增加对侧旋转的水平。\n[0253] 图13:治疗的显著影响(F3,28)＝70.60,p<0.01,时间的显著影响(17,746)＝\n200.89,p<0.001和显著治疗×时间相互作用(F17,476)＝2.83,p<0.001.#,p<0.05:RAD3/TOZ30组显著不同于VEH/VEH、VEH/TOZ30和RAD3/VEH组(LSD事后检验)。\n[0254] 实施例6：当在对活性剂量的左旋多巴和苄丝肼的长期追加治疗中施用时的行为观察\n[0255] 作为意外的观察结果，数据表明，combo具有增加左旋多巴的准时起效的潜力，伴有一些运动失能的减少。\n[0256] 与媒介物治疗的大鼠相比以及与用单一化合物治疗的大鼠相比，在对活性剂量的左旋多巴/苄丝肼的追加疗法中施用的长期组合的“Tozadenant+雷拉地尔”施用会显著地增加左旋多巴对对侧旋转的作用。除了该增加的作用以外，在较大开放场中的试验表明，与用Tozadenant治疗的大鼠相比，用combo和雷拉地尔治疗的大鼠降低了严重AIM水平。\n[0257] TOZADENANT+雷拉地尔+活性剂量的左旋多巴/苄丝肼\n[0258] 图14：组合Tozadenant+雷拉地尔与活性剂量的左旋多巴/苄丝肼一起施用的实验设计\n[0259] 表4：在小转子流量计中施用10个获取期的治疗\n[0260]\n[0261] 当在转子流量计中测量时，在给媒介物、Tozadenant、雷拉地尔或两种化合物的组合共同施用中施用的10个获取期(1次/天)的左旋多巴(14mg/kg)/苄丝肼(3.5mg/kg)逐渐增加了左旋多巴诱导的对侧旋转的水平(图15)。该效应对于combo-治疗的大鼠而言是更显著的。\n[0262] 图16显示了用媒介物、雷拉地尔、tozadenant或combo与左旋多巴/苄丝肼治疗的大鼠的行为特性，但是在较大开放场中试验。基于影像记录的特有自动化行为分析表明，除了左旋多巴/苄丝肼以外还用combo治疗的大鼠具有更高的刺激水平(即通过距离和对侧旋转的水平的显著增加来测量)。但是，与Tozadenant-治疗的组相比，用combo和LD/BZ治疗的那些大鼠也表现出在表达严重AIM中花费的更少时间。\n[0263] 图15：两因素混合ANOVA显示了治疗的显著影响F(3,28)＝15.06；p<0.001,获取期的显著影响，F(9,252)＝29.23,p<0.001，但是没有治疗×时间相互作用(p＝0.18)。额外的事后检验表明，与媒介物-、toz-和雷拉地尔-治疗的组相比(Tukey,p<0.05)，combo组具有显著更高的活动水平。\n[0264] 总之，鉴别出下述惊人的协同作用：\n[0265] 1)与媒介物治疗的大鼠相比和与用单独A2A拮抗剂或NR2B拮抗剂治疗的大鼠相比，通过组合不同的A2A和NR2B拮抗剂产生的6种不同组合(combo)在单侧6-OHDA损害的大鼠中表现出活动(移动的距离和后腿站立)的水平的显著增加。\n[0266] 2)对一种特定A2A/NR2B拮抗剂组合(Tozadenant+雷拉地尔)进行的彻底行为分析表明，除了活动水平(其与用活性剂量的左旋多巴/苄丝肼观察到的值相当)的显著增加以外，与在左旋多巴治疗下观察到的值相比，在combo下的大鼠行为显著改善(没有刻板的紧密对侧旋转且没有张力障碍体位)。\n[0267] 3)使用A2A和NR2B拮抗剂的组合的长期治疗没有导致任何异常运动并发症的发展。\n[0268] 4)左旋多巴和combo之间的交叉敏化作用的缺失：在长期左旋多巴治疗的大鼠(其通过左旋多巴-治疗具有运动障碍)中使用A2A/NR2B组合的急性治疗表现出恢复高质量运动活动的能力，没有任何异常的不随意运动。\n[0269] 5)与媒介物治疗的大鼠相比以及与用单独的A2A或NR2B拮抗剂(并加上与接受的等同剂量的左旋多巴，但是combo组除外)治疗的大鼠相比，当在给亚活性或部分活性剂量的左旋多巴的共同施用中施用时，使用A2A和NR2B拮抗剂的组合的急性治疗显示出左旋多巴诱导的对侧旋转的显著增加。\n[0270] 6)与用A2A拮抗剂治疗的大鼠相比，在给活性剂量的左旋多巴/苄丝肼(引起左旋多巴诱导的异常运动AIM发生的剂量)的共同施用中施用的A2A和NR2B拮抗剂的长期治疗显示出左旋多巴对对侧旋转水平的作用的增强和与此同时AIM的严重程度的下降。\n[0271] 参考文献\n[0272] ●Schwarting RK,Huston JP(1996)The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioural brain research.Analysis of functional deficits,recovery and treatments.Prog Neurobiol 50:275-331\n[0273] ●Ungerstedt U(1971)Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system.Acta Physiol Scand Suppl 367:69-93\n[0274] ●Ungerstedt U,Arbuthnott GW(1970)Quantitative recording of \nrotational behaviour in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system.Brain Res 24:485-493\n[0275] 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