α－1，4－葡聚糖裂解酶在制备1，5－D－脱水果糖中的应用

1.1，5-D-脱水果糖作为抗氧化剂的用途。
2.权利要求1的用途，其中1，5-D-脱水果糖被加入到食品或饮 料中。
3.权利要求1的用途，其中1，5-D-脱水果糖被加入到聚合物中。

                     技术领域\n本发明涉及-种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”) 在从以α-1，4-葡聚糖为基础的底物中制备1，5-D-脱水果糖 (“AF”)中的应用。\n本发明还涉及糖，特别是1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为抗 氧化剂，特别是作为食料和饮料的抗氧化剂的应用。\n本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为增甜剂，特别是 作为食料和饮料，优选人类食料和饮料中的增甜剂的应用。\n                   背景技术\nFR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27 No.11 pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌中生 产AF。AF的产量相当低。尽管提到了可能的酶促反应，但两篇文献 都没有提供任何酶的氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。 这些文献认为AF可能是制备抗生素吡喃酮羟基羟甲基吡喃酮 (microthecin)的前体。\nYu等在Biophysica Acta([1993]Vol 1156 pp313-320)中 报道了从红海藻中制备GL并用它降解α-1，4-葡聚糖以生产AF。 AF的产量相当低。尽管提到了酶GL，但该文献未提供任何该酶的氨 基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列。该文献还认为GL 的来源就是藻类。\n典型的以α-1，4-葡聚糖为基础的底物是淀粉。现在已发现淀 粉在工业上的广泛用途主要是因为它们是廉价的天然物质。\n淀粉降低酶可分成不同类。淀粉水解酶产生葡萄糖或葡萄糖寡聚 物。第二组淀粉降解酶是磷酸化酶，它在无机磷酸盐存在的条件下从 淀粉产生葡萄糖-1-磷酸。\nAF也可经化学合成(见Lichtenthaler在Tetrahedron Letters Vol 22 pp1429-1432中的工作)。然而，该化学合成涉及许多步骤 而且并不产生大量的AF。\n因此生产AF的化学合成途径非常昂贵。\n于是需要一种以廉价和简便的方式且还能大量产生AF的方式制 备AF的方法。\n另外，通常用抗氧化剂抑制诸如食品的物质具有有害影响的氧。 两种通常使用的抗氧化剂是GRINDOX 142和GRINDOX 1029。这些抗氧 化剂含有许多成份且生产相当昂贵。\n因此需要具有简单和廉价形式的抗氧化剂。\n此外，在食品和饮料制备中通常使用增甜剂。然而许多增甜剂制 备昂贵且复杂。\n因此，需要具有简单和廉价形式的增甜剂。\n                        发明内容\n根据本发明，提供了一种制备糖1，5-D脱水果糖的方法，包括 用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖，其特征在于该 酶以基本纯的形式使用。\n如果葡聚糖除了α-1，4-键外还含有不同于该键的其它键时， 优选的是将α-1，4-葡聚糖裂解酶与能打开这类其它键的合适试剂 (如水解酶，优选葡聚糖水解酶)结合使用。\n优选地，葡聚糖是淀粉或以化学或酶促法制备的淀粉片段。如果 以酶促法制备，该反应可在加入α-1，4-葡聚糖裂解酶前进行或可 同时进行该反应。合适的试剂可以是辅助酶。优选的辅助酶是α-或 β-淀粉酶。优选使用脱支酶。更优选的辅助酶是至少一种支链淀粉 酶(pullanase)或异淀粉酶(isoamylase)。\n优选地，α-1，4-葡聚糖裂解酶结合到支持物上，或更优选的 是以溶解的形式。\n优选地，该酶从真菌，优选Morchella costata，或普通羊肚菌， 或从真菌感染的藻类，优选Gracilariopsis lemaneiformis或仅从 藻类优选的从Gracilariopsis lemaneiformis中分离。\n优选地，使用未被该酶降解的凝胶从真菌或从真菌感染的藻类或 仅从藻类中分离和/或进一步纯化该酶。\n优选地，该凝胶以糊精或其衍生物为基础。\n优选地，该凝胶是环糊精，更优选β一环糊精。\n优选地，该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1的氨基酸序列SEQ. ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No. 6，或其任何变异体。\n在另外优选的实施方案中，该酶包含在SEQ.ID.No.s9-11 中所示的任何一个氨基酸序列或其任何变异体。\n术语“其任何变异体”是指在所得的酶具有裂解酶活性的前提下 对该序列进行一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增 加。\n优选的是该酶与支链淀粉或糊精结合使用。\n优选的是从编码该酶的核苷酸序列中表达来获得该酶。\n优选的是所述核苷酸序列是DNA序列。\n优选的是所述DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No. 4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何序列相同，或互补， 或基本上同源，或含任何合适的密码子取代的序列。\n在另外的优选的实施方案中，DNA序列包含与SEQ.ID.No.s 12-14所示的序列相同，或互补，或基本上同源，或含任何合适 的密码子取代的任何一个序列。\n术语“基本上同源”包括有关结构和/或核苷酸成份和/或生物 学活性的同源性。\n术语“含任何合适的密码子取代”包含在所得的酶具有裂解酶活 性的前提下用编码相同氨基酸的另一密码子进行任何密码子置换或取 代或对其进行的任何增加或缺失。\n换句话说，本发明还包括修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸 缺失，取代或修饰或其中至少插入一个增加的核苷酸以便编码具有葡 聚糖裂解酶活性的多肽，优选具有增加的裂解酶活性。\n优选使用高浓度-例如最高至25％溶液浓度的淀粉。\n优选在缓冲液存在的条件用该酶处理底物。\n优选在基本上纯的水存在的条件下用该酶处理底物。\n优选在不存在辅助因子的条件下用该酶处理底物。\n根据本发明，还提供了制备糖1，5-D-脱水果糖的方法，包括 用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖，其特征在于该 酶含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1或氨基酸序列SEQ.ID.No.2或 氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或氨基 酸序列SEQ.ID.No.s9-11中的任何一个序列，或其任何变异体。\n根据本发明还提供了以本发明的方法制备的糖1，5-D-脱水果 糖。\n以13C NMR证实和表征了以本方法制备的AF。\n本方法的-个关键的优势是可以比以前大得多的数量制备糖1，5 -D-脱水果糖且该方法比已知方法相对更简便和更廉价。例如现在 该糖的制备量可以是例如大于100g，如500g，与此相比，背景技术的 方法仅生产更少的量，如微克量。\nGL可催化的典型反应可概括如下：\n1).支链淀粉→AF+有限糊精\n2).直链淀粉→AF+有限糊精\n3).糊精→AF+葡萄糖\n在反应1)中，两种产物的比率取决于支链淀粉的结构或α- 1，6-糖苷键在支链淀粉分子中的分布。\n在反应2)和3)中，产物比率取决于底物聚合度(DP)数值。 在反应3中，AF与葡萄糖之间的比率取决于DP。例如，如果糊精含 10个葡萄糖单元，则AF∶葡萄糖的比率是9∶1。\n本发明的另一优势是可基本上降低含不同于α-1，4-键之键的 葡聚糖，而以前仅达到部分降解。1，5-D-脱水果糖前体的基本上 降解是导致增加1，5-D-脱水果糖产量的因素之一。\n其它优选是，AF是天然存在的物质，因此从人类的角度看具有 潜力。例如，它可由AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮。已 知抗生素在食品生物防腐中的用途，它是食品技术的重要方面。然而， 到现在为止，AF及还有羟基羟甲基吡喃酮的制备具有许多缺陷。例 如仅可少量生产。另外，方法昂贵。\n本发明通过提供AF及还有其它产品如羟基羟甲基吡喃酮的更大 量生产和更廉价的生产克服了这些问题。以这一方式可制备克到千克 量的AF。\n进一步的优势是裂解酶在4℃至少稳定1年并能冻干而不损失活 性。\n另一优势是裂解酶直接从淀粉产生AF而不需要任何辅助因子存 在。\n另一优势是酶可在纯水中使用。这一结果是非常惊人的。\n根据本发明裂解酶的简单特性，可期望AF的生产成本可与葡萄 糖的成本相提并论。本发明的裂解酶不必需要一般非常昂贵的任何辅 助因子存在，这一点特别具有优势。\n一般来说，α-1，4-葡聚糖可用作该酶的底物。\n可使用淀粉作为优选的底物。\n在优选的方法中，可使用可溶的或胺化的淀粉或淀粉水解产物。 可经过化学或酶促方法制备淀粉水解产物。\n如果使用部分降解淀粉的酶，该酶可在加入裂解酶或任何其它额 外的淀粉降解试剂，如葡聚糖水解酶之前加入，它们也可同时加入。\n裂解酶可将葡聚糖转变为AF。该酶可从非还原端附着到底物上并 仅仅不转化还原糖。可用本文已描述的一些已知方法去掉残留的葡萄 糖。\n使用本文描述的反应可大量生产纯的AF。\n在一个实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色 谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上 进行凝胶过滤从真菌感染的藻类(如Gracilariopsis lemaneiformis) 纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生 1，5-脱水-D-果糖。\n从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分离的真菌裂 解酶的特征在于当使用支链淀粉时，最适pH为3.5-7.5，最适温度 为50℃，pI为3.9。\n在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色 谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上 进行凝胶过滤从真菌Morchella costata中纯化α-1，4-葡聚糖裂 解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖产生1，5-脱水-D-果糖。\n经过在pH梯度为3至9的凝胶上进行等电聚焦测定真菌裂解酶 显示pI大约为5.4。经过在8-25％梯度凝胶上进行SDS-PAGE测定 分子量为110kDa。酶表现出pH最佳范围为pH5-7。发现最适温度 在30-45℃之间。\n在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色 谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上 进行凝胶过滤从普通羊肚菌真菌中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯 化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。\n在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色 谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上 进行凝胶过滤从藻类如Gracilariopsis lemaneiformis纯化α-1，4 -葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水- D-果糖。\n对于根据本发明的几个GL酶，裂解酶催化反应的典型pH和温度 最适值如下： GL 来源   最适pH   最适pH范围   最适温度 M.costata   6.5   5.5-7.5   37℃；40℃a 普通羊肚菌   6.4   5.9-7.6   43℃；48℃a 真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis   3.8   3.7-4.1   40℃；45℃a\na使用糖原作底物测定的参数；使用支链淀粉作底物测定其它参数。\n本发明的酶将直链淀粉和支链淀粉转变成1，5-脱水果糖。\n在试验的麦芽糖类中，发现裂解酶对麦芽糖表现出较低活性，对 麦芽三糖和麦芽七糖活性更低，对麦芽四糖和麦芽五糖活性最高。在 这些麦芽糖中，酶对高达10mg/ml的浓度不表现底物抑制。\n已测序了各个优选来源的酶并随后提供了其氨基酸序列。后面还 提供了编码该酶的DNA序列。\n因此，本发明描述了一种新的淀粉降低酶，称为新的α-1，4一 葡聚糖裂解酶。这是首次纯化和表征的一种酶。\n如上所述，本发明还涉及AF的一些特殊用途。\n特别是本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为一种抗氧 化剂，特别是作为食品和饮料的抗氧化剂的应用。\n因此根据本发明，提供了1，5-D-脱水果糖(AF)作为抗氧化 剂的应用。\n优选AF作为或用于食用物质。\n优选AF用于或作为食品或饮料。\n优选AF与其它抗氧化剂结合使用。\n优选根据本发明的方法制备AF。\nAF用作抗氧化剂的主要优势是它是天然产物，不可代谢，易于 生产，水溶性且一般无毒性。\n因此在优选的实施方案中本发明涉及纯AF的酶促制备法，纯的 AF作为有吸引力的水溶性抗氧化剂可用于食品和非食品用途。在本 申请的实施例中给出了在食品配方中AF作为抗氧化剂的应用。\n在所附实施例中可见AF可与已知高质量的商品食物抗氧化剂相 比。\n非食品例子包括在聚合物化学中用作聚合物合成过程中的氧清除 剂。另外，AF还可用于生物可降解性塑料的合成。\n实验表明，AF可作为有效的还原剂(抗氧化剂)，因为它易于 将3，5-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸。\nAF是天然存在的物质，因此它在用作可接受的抗氧化剂时有巨 大潜力。AF也可经AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮。已知 抗生素在食品生物保护中的应用，它是食品生物技术的一个重要方面。\n另一方面，本发明还涉及1，5-D-脱水果糖作为增甜剂的应用， 特别是作为食品和饮料优选人类食品和饮料的增甜剂。\n因此根据本发明的该方面提供了1，5-D-脱水果糖作为增甜剂 的应用。\n优选AF用作或用于人类食品或饮料。\n可以任意所需的量，如5％的溶液或100mg/kg到500mg/kg使 用AF。\n使用AF作为增甜剂的优势在于它是天然产物，一般无毒性，水 溶性，不可代谢并易于生产。\n因此本发明还涉及AF作为增甜剂的新应用。\n优选根据本发明的方法制备AF。\n本发明的其它方面包括：\n一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包括从真菌感 染的藻类，真菌或藻类本身中分离该酶；\n一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2或SEQ. ID.No.5或SEQ.ID.No.6或其任何变异体的酶；\n一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.9或SEQ.ID.No.10或SEQ. ID.No.11或其任何变异体的酶；\n一种编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，其中优选该序 列不在其天然环境中(即，它不形成能表达该酶的细胞生物体的部分 天然基因组)，其中优选该核苷酸序列是DNA序列；\n一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No. 3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任 何一种相同，或互补，或基本同源，或含任何合适的密码子取代的序 列，其中优选该序列以分离的形式存在。\n一种核苷酸序列，其中DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No. 12或SEQ.ID.No.13或SEQ.ID.No.14中任何一种相同，或互 补，或基本同源，或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序 列是分离的形式。\nβ-环糊精在纯化一种酶，优选GL中的应用。\n本发明其它优选的实施方案包括下列任意一个：作为导入本文所 述的DNA序列的结果而具有产生AF之能力的转化宿主生物：这种转 化的宿主生物是一种微生物，其中优选该宿主生物选自细菌，霉菌， 真菌和酵母；优选该宿主生物选自糖酵母属，克鲁维氏酵母属，曲霉 属，木霉属，汉逊氏酵母属，毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属，链霉菌属， 埃希氏杆菌属，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢 杆菌，大肠杆菌；一种制备1，5-D-脱水果糖的方法，包括使用表 达编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列的转化宿主生物，其中 优选该核苷酸序列是DNA序列，其中优选该DNA序列是上文描述的序 列之一；一种掺入了上文所述的核苷酸序列的载体，其中优选该载体 是一种复制型载体，其中优选该载体是含有启动子序列下游之核苷酸 序列的表达载体，优选该裁体包含一种标记(如抗性标记)；用这种 载体转化的细胞生物体或细胞系。一种生产α-1，4-葡聚糖裂解酶 或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该 载体转染的生物体(或细胞系的细胞)并回收该产物。\n特别是在表达系统中，优选分泌该酶以简化其纯化。为做到这点， 将编码成熟酶的DNA与来自选定生物的信号序列启动子和终止子融合。\n为了在黑色曲霉中表达，将gpdA(来自构巢曲霉的甘油醛-3- 磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟的裂解酶DNA 5′端 融合。来自黑色曲霉trpC基因的终止子序列放到该基因的3′端 (Punt，P.J.et al.1991-(1991)：J.Biotech.17，19-34)。 将该构建体插入到含有大肠杆菌复制起点和选择起点和黑色曲霉选择 标记的载体中。黑色曲霉选择标记的例子是amdS基因，argB基因， pyrG基因，hygB基因，BmlR基因，它们都曾用于转化子的选择。 将该质粒转化进黑色曲霉并以转化子的培养基中回收成熟的裂解酶。 最终该构建体可转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中该裂解酶 的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al.1992-Biotechnol.Lett. 14，357-362)。\n除了黑色曲霉作宿主之外，可使用已知其好表达系统的其它工业 重要微生物，如米曲霉，曲霉属种类，木霉属种类，啤酒糖酵母，克 鲁维氏酵母属种类，汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种类，枯草芽 孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，芽孢杆菌属种类，链霉属种类或大肠杆菌。\n根据布达佩斯条约于1994年6月20日将下列样品保藏于认可 的保藏单位(The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited at 23 St.Machar Drive，Aberdeen， Scotland，United Kingdom)：\n含质粒pGL1的大肠杆菌(NCIMB 40652)-[参考DH5α-pGL1]；\n和含质粒pGL2的大肠杆菌(NCIMB 40653)-[参考DH5α-pGL2]。\n下列样品根据布达佩斯条约于1994年10月11日作为保藏品 被认可的保藏单位(The Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3， Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)接受： 真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/1)-[参 考GLQ-1(青岛)]。\n因此，本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL 编码序列表达获得的GL酶.该质粒是保藏物NCIMB 40652或保藏物 NCIMB 40653的主体；可从作为保藏物CCAP 1373/1主体的真菌感 染的藻类中获得的GL酶。\n根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月3日保藏在认可 的保藏单位(The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)at 23St.Machar Drive， Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB 2 1RY)： 含质粒pMC的大肠杆菌(NCIMB 40687)-[参考DH5α-pMC]： 含质粒pMV1的大肠杆菌(NCIMB 40688)-[参考DH5α-pMV1]； 含质粒pMV2的大肠杆菌(NCINB 40689)-[参考DH5α-pMV2]。\n质粒pMC是含从Morchella costata构建的基因组文库中分离的 4.1kb片段的pBluescript IIKS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂 解酶的基因。\n质粒pMV1是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的2.45kb 片段的pBluescript IIKS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的 基因5′端。\n质粒MV2是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的3.1kb片 段的pPUC19。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因3′端。\n在下面讨论中，MC代表Morchella costata，MV代表普通羊肚 菌。\n如上所述，普通羊肚菌的GL编码序列包含在两个质粒中。参考 图15，pMV1含从位置454到位置2902的核苷酸，pMV2含从位置 2897(包括该位置)下游的核苷酸。参考图12和13，为了连接编 码序列，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV2，然后将有关片段 插入用限制性酶EcoRI和BamHI消化的pMV1中。\n因此本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL编 码序列的表达获得的GL酶，该质粒是保藏物NCIMB 40689或保藏物 NCIMB 40688和保藏物NCIMB 40689的主体。\n根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月11日被认可的 保藏单位(The Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP) at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll， Scotland.United Kingdom，PA34 4AD)作为保藏物接受：\n真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/2)- [参考GLSC-1(California)]。\n因此本发明高度优选的实施方案包括可从作为保藏品CCAP 1373 /2主体的藻类获得的GL酶。\n本发明将仅以实施例的方式进行描述。\n                        附图说明\n在下面实施例中，以附图作参考，其中：\n图1显示了染色的真菌感染的藻类；\n图2显示了染色的真菌感染的藻类；\n图3显示了真菌菌丝切片；\n图4显示了真菌感染的藻类切片；\n图5显示了真菌感染的藻类切片；\n图6显示了pGL1的质粒图谱；\n图7显示了pGL2的质粒图谱；\n图8显示了SEQ.I.D.No.3的氨基酸序列，表明了测 序的肽片段的位置；\n图9显示了SEQ.I.D.No.1与SEQ.I.D.No.2的序列比较；\n图10是显微照片；\n图11显示了pMC的质粒图谱；\n图12显示了pMV1的质粒图谱；\n图13显示了pMV2的质粒图谱；\n图14显示了从Morchella costata获得的基因组DNA的GL编 码序列和部分5′和3′非翻译区；\n图15显示了从普通羊肚菌获得的基因组DNA的GL编码序列和 部分5′和3′非翻译区；\n图16显示了来自Morchella costata和普通羊肚菌的GL编码 序列和非翻译区的比较；\n图17列出了SEQ.I.D.No.5的氨基酸序列，显示测序的肽 片段的位置；\n图18列出了SEQ.I.D.No.6的氨基酸序列，显示了测序的 肽片段的位置；\n图19显示了存在和缺乏AF时的耗氧图；\n图20显示了TLC板。\n更详细地说，图1显示了钙粉白染色，显示了Gracilariopsis lemaneiformis上部和下部的真菌(108×和294×)。\n图2显示了带有真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/ 苯胺蓝黑染色。真菌具有明显更高含量的碳水化合物。\n图3显示了显微照片，显示了生长于藻类细胞原壁(w)之间的 含两薄壁的真菌菌丝(f)的纵切和横切切片。注意在藻类叶绿体中 的类囊体膜(箭头)。\n图4显示了用克隆2探针的反义检测(上排)，似乎局限于以钙 粉白染色的连续切片所示的真菌(下排)处(46×和108×)。\n图5显示了发现用克隆2探针的强烈反义检测信号在 Gracilariopsis lemaneiformis的真菌上(294×)。\n图6显示了质粒pGL1的图谱，它是含有从真菌感染的 Gracilariopsis lemaneiformis构建的基因组文库中分离的3.8kb 片段的pBluescript IIKS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶 的基因。\n图7显示了质粒pGL2的图谱，它是含有从真菌感染的 Gracilariopsis lemaneiformis构建的基因组文库中分离的3.6kb 片段的pBluescript IIKS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的 基因。\n图9显示了SEQ.I.D.No.1(GL1)与SEQ.I.D.No.2 (GL2)的序列比较。GL1的残基总数是1088，GL2的残基总数是 1091。在所做的比较中，使用结构-遗传模型(打开缺口花费：10； 连接缺口花费：2)。在图9中显示两个对比的残基相同的符号是 “·：”；显示两个对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相似” 的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M， V；F，Y，W。总的来说有845个氨基酸相同(即77.67％)；60 个氨基酸相似(5.51％)。GL1中插入的缺口数为3，GL2中插入的 缺口数是2。\n图10是显示在藻类细胞壁(w)之间生长的真菌菌丝(f)的显 微照片。注意藻类细胞中的红藻淀粉粒(s)和类囊体(箭头)。 线段＝2μm。\n在图14中，碱基总数是4726，DNA序列组成是：1336A； 1070C；1051G；1269T。ATG起始密码子以黑体字表示。内含子下 面划线。终止密码子以斜体字表示。\n在图15中，碱基总数是4670，DNA序列组成是：1253A； 1072C；1080G；1265T。ATG起始密码子以黑体字表示。内含子下 面划线。终止密码子以斜体字表示。\n在图16中，两个对比的序列是从MC(残基总数：1066)和MV (残基总数1070)获得的序列。使用的比较模型是结构-遗传模型 (打开缺口花费：10；连接缺口花费：2)。在本图中，表示两对比 的残基相同的符号是“：”。表示两对比的残基相似的符号是“.”。 说成是“相似”的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K； I，L，M，V：F，Y，W。总的来说，相同：920(86.30％)； 相似51(4.78％)。在MC中插入的缺口数为1，在MV中插入的缺口 数是1。\n在所述的序列表中：SEQ.I.D.No.5是从Morchella costata 获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.6是从普通羊肚菌获得的 GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.7是从Norchella costata获得 的GL的核苷酸编码序列；SEQ.I.D.No.8是从普通羊肚菌获得的 GL的核苷酸编码序列。\n在SEQ.I.D.No.5中，残基总数是1066。GL酶的氨基酸组成 为：\n46Ala  13Cys  25His  18Met  73Thr\n50Arg  37Gln  54Ile  43Phe  23Trp\n56Asn  55Glu  70Leu  56Pro  71Tyr\n75Asp  89Gly  71Lys  63Ser  78Val\n在SEQ.I.D.No.6中，残基总数是1070。GL酶的氨基酸组成 为：\n51Ala  13Cys  22His  17Met  71Thr\n50Arg  40Gln  57Ile  45Phe  24Trp\n62Asn  58Glu  74Leu  62Pro  69Tyr\n74Asp  87Gly  61Lys  55Ser  78Val\n                    具体实施方式\n实验\n1.可溶性酶系统：\n1.1.pH对从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分离 的裂解酶的稳定性和活性的影响。\n在37℃试验了两种缓冲系统，命名为浓度为5mM的HOAc-NaOAc和柠檬酸钠-柠檬酸。试验的pH范围为从pH3到pH5.2。裂解酶在 3.6到4.2的pH范围内显示最大活性。在pH3时，酶的稳定性和活 性减少大约90％。在pH5.2时，活性减少大约64％。然而在此pH下 酶比在pH3下更稳定，而在pH5.2下获得的AF产量是pH3.8下获 得的AF产量的75％。在HOAc-NaOAc缓冲液中获得的AF产量比在柠 檬酸缓冲液中略高。这不是由于在AF试验方法中两种缓冲液(在AF 试验混合物中终浓度是125μM)的任何偏差影响。\n1.2.温度对裂解酶的活性和稳定性的影响：\n本实验在最适pH范围内进行。在25℃下AF生产线型增长到至少 9天。这表明在9天内裂解酶无活性和稳定性损失。随着温度的升高， 酶稳定性减小。\n在下列温度下酶活性的半寿期为：\n30℃         5天\n37℃         2.5天\n40℃         不超过1天\n50℃         不超过1天\n1.3.底物浓度对裂解酶稳定性和AF产量的影响：\n观察到支链淀粉和糊精对裂解酶具有稳定效应，而最小的底物麦 芽糖没有。这一点以可溶性酶系统和固相酶系统来证实。\n随着支链淀粉浓度增加到高达25％，AF产量也增加。至于糊精， 当浓度超过30％(试验了30％，40％和50％)时AF产量减少。\n1.4.裂解酶的活化和灭活\n未发现金属离子为活性所必需，令人惊奇的是该酶催化的反应可 在纯水中进行。向反应混合物中加入高达20mM的EDTA对活性很少有 影响的事实清楚地证实对于根据本发明的裂解酶的活性来说，金属离 子是不必要的。\n这意味着在AF纯化步骤中，从反应系统中去掉盐的离子交换色 谱步骤可省去，如果水用作反应介质的话。然而，反应混合物包含浓 度为0.85％(0.145M)的NaCl时可将AF产量增加1倍。\n1.5.底物特异性\n当淀粉浓度变高时，溶解后冷却的淀粉倾向于形成坚硬的凝体。 因此，使用部分降解的淀粉作为1，4-葡聚糖裂解酶的底物具有优势。\n试验了从M.costata分离的α-1，4-葡聚糖裂解酶对不同寡 聚糖的特异性。这些寡聚糖是麦芽糖(G2)，麦芽三糖(G3)，麦 芽四糖(G4)，麦芽五糖(G5)，麦芽六糖(G6)和麦芽七糖 (G7)。寡聚糖以8mg/ml的浓度溶于水。酶试验含150μl底物 G2/G3/G4/G5/G6/G7，120μl 0.1M MES pH6.3和30μl 纯化的酶。反应混合物在30C培养60分钟。随后经煮沸3分钟终止 反应并加入900μl无水乙醇进行沉淀。4℃以20,000×g离心5分 钟后将上清液转移到新的eppendorf管中并冻干。\n冷冻干燥的样品溶于1000μ1 H2O中并通过0.22μm Millipore 滤膜过滤，随后加样25μl到Dranex HPLC上。\n1.7 HPLC\n分析程序\n在由GPM-2泵和用于脉冲安培计检测方式的PED检测器组成的 Dionex 4500i色谱系统中进行分析。\n阴离子交换柱是Dionex的CarboPac PA-100(4×250mm)和 CarboPac PA-100保护柱。\n洗脱液是200mM氢氧化钠(A)，500mM乙酸钠(B)和18M欧姆 去离子水(C)。泵以2种不同的方式(方法1和方法2)运行：\n方法1：   时间，分   0.0   3.0   3.1   26.9   29.0   ％A   10   10   50   50   10   ％B   0   0   0   32   0   ％C   90   90   50   18   90\n方法2：   时间，分   0.0   30   ％A   10   10   ％B   0   0   ％C   90   90\n标准品：\n葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和 麦芽七糖(都来自Sigma)和1，5-脱水果糖用作标准品。所有化合 物均溶于18M欧姆的去离子水中，用前通过0.22μm Millipore滤膜 过滤。\n1.7. 结果：\n分析表明从M.costata分离的纯化酶确实能使用麦芽寡聚糖作 底物形成1，5-脱水果糖。\n当使用麦芽糖作底物时，几乎不形成1，5-脱水果糖，但当使用 其它麦芽寡聚糖(G3-G7)时，产生高产量的该化合物。\n很清楚当使用更长的麦芽寡聚糖时可获得更高产量的1，5-脱水 果糖。\n这一观察结果与裂解酶从底物非还原端形成1，5-脱水果糖而葡 萄糖分子末端未变化的理论非常吻合。\n1.8. AF的形成\nM.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶将淀粉水解成终产物1， 5-脱水果糖。终产物经HPLC，方法2显示。酶试验含500μl支链淀 粉(20mg/ml，溶于H2O)、400μl 0.1M MES pH6.3和100μl纯 化酶。在30C保温反应混合物，保温30或120分钟后经煮沸终止反 应。加入3体积的无水乙醇沉淀高分子寡聚糖类，按上面所述离心和 冻干样品。样品溶于125μl H2O中并取25μl上样到HPLC柱上。\nHPLC洗脱图清楚地表明M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶 经水解淀粉产生1，5-脱水果糖。保温30和120分钟后发现相当量 的1，5-脱水果糖，表明酶活性不受终产物1，5-脱水果糖的抑制。\n以这种方式制备的AF 13C NMR光谱(水)表明它采取产生下列 信号的一个主要形式：δ93.5(夸脱，C-2)，81.5(CH，C-5)，77.7 (CH，C-3)，72.6(CH2，C-1)，69.8(CH，C-4)，62.0(CH2，C-6)。 根据H-H C-H和C-H 2D相关光谱进行排列。\n1.6.裂解酶与支链淀粉酶和异淀粉酶的协同效应。\n从表1可见，在反应混合物中包含支链淀粉酶的是增加AF的产 量大约15-23％，这一增加值取决于使用的底物是可溶性淀粉还是支 链淀粉。\n表1在AF生产中支链淀粉酶和裂解酶的协同作用：   底物   裂解酶   支链淀粉酶   AF产率(％)   Glc产率(％   )   可溶性   淀粉     +   -       -     +     51   0     0   0.37   +     +   66.0   3.9   支链淀粉   +     -   48.0   0   -     -   0   0.33   +     +   71.3   3.7\n+，加入的酶，-，省去的酶。\n反应混合物合0.3ml 2％马铃薯支链淀粉(Sigma)/水或 0.3ml 2％可溶性淀粉(Merch)，2μl裂解酶和0.36单位的所示 支链淀粉酶(BM)。\n在30℃反应进行1天。在反应终止时，取样进行AF和GLc分析。\n至于异淀粉酶，其优势在于裂解酶的最适pH与假单胞菌属异淀 粉酶的最适pH(pH3.0-4.5)重叠。然而问题是异淀粉酶产生的过 量的长链直链淀粉会从溶液中沉淀出来而不再适合于作为裂解酶的底 物。如果直链淀粉的链不太长，可期望裂解酶与异淀粉酶会产生有效 的协同作用。\n2.固相酶系统\n经过使用琥珀酰胺活化的Sepharose(Affigel 15凝胶，Bio- Rad)和戊二醛活化的Silica凝胶(BM)完成裂解酶的固相化。在 Affigel 15凝胶上固相化后酶活性的恢复率在40％到50％之间。固 相化后可能仍有一些酶较活跃，但由于位阻底物不能进入，特别是对 于象淀粉一样的大分子。工业上使用的固相酶通常活性恢复率为大约 50％。\n对于Affigel 15凝胶固相化的裂解酶，最令人感兴趣的事是在 pH5.5下其稳定性有很大的改进。当柱在这一pH下进行操作时，稳 定性至少有16天长。考虑到支链淀粉酶的最适pH为大约pH5.5， pH改变在稳定性中非常重要。这是裂解酶和支链淀粉酶在具有相同 物理一化学环境的相同反应器中发生有效的协同作用的前提条件。可 溶性裂解酶的最适pH在3.6和4.2之间，在该pH范围内，支链淀粉 酶表现出很小的活性或无活性。\n使用硅胶固相裂解酶的活性恢复率非常高，大约80-100％。然 而当柱不在pH3.8和pH5.5下操作时硅胶固相酶不稳定。可能有些 裂解酶吸附到硅胶珠表面并在每次洗柱后缓慢从硅胶上释放。因此可 能是吸附的裂解酶造成了高恢复率和柱活性的减少。\n3.AF的纯化\n3.1.裂解酶-支链淀粉/可溶淀粉系统\n在该系统中，反应终止时反应系统含AF，极限糊精，裂解酶和缓 冲盐。经乙醇(终浓度50％)沉淀从大分子(极限糊精和裂解酶)中 分离AF。使用Amicon YM3膜(截下3,000D的分子量)经超滤分离未 沉淀的低分子量支链淀粉。在旋转蒸发器中经在40℃蒸发去掉乙醇。 经过混合的离子交换剂从AF中去掉缓冲盐。经冷冻干燥获得纯化的 固体AF。\n3.2.裂解酶一支链淀粉酶/支链淀粉/可溶性淀粉系统\n在该系统中终产物是AF和葡萄糖。如果制备至少基本上纯的AF 样品，必须去掉副产物葡萄糖。这可经过酶方法完成。首先经葡萄糖 氧化酶将葡萄糖转变成葡萄糖酸和过氧化氢。\n需要过氧化氢酶消除形成的H2O2。H2O2可将AF氧化成目前 结构未知的2种新化合物。在AF制品中的其它杂质是AF的氧化产物。 观察到经空气水平的氧，特别是在高温，高AF浓度和长时间暴露下 AF可被缓慢氧化。\n葡萄糖酸可与缓冲盐一起经离子交换色谱去掉。\n在该系统中，作为选择可用淀粉转葡萄糖苷酶水解低分子量的支 链淀粉分子来代替使用超滤法。\n3.3.AF的纯度检查。\n经TLC，Dionex和NMR证实AF制品的纯度。\n3.4.脱水果糖抗氧化活性分析。\n电化学氧消耗：\n方法\n在Jorgensen和Skibsted(Z.Lebensm.Unters.Forsch. (1993)196：423-429)描述的甲基亚油酸乳剂中研究AF的活性， 对该乳剂作了轻微的修改：向作为乳化剂的5.00ml溶于具有pH＝5.8 且含0.2w/w％Tween 20的5.0mM磷酸盐缓冲水溶液的1.33mM甲基 亚油酸乳剂中加入下列浓度的AF：0，15，146和680μM。经过加入 50μl 0.26M甲基肌红蛋白(MMb)至终浓度为0.26mM起动该系统的 氧化。起动反应后立即将样品注射到恒温(25.0±0.1℃)的70μl 密封电池中，有效地排除氧向系统的扩散。经Clark电级(与PC资 料收集程序相连)测量氧的消费。每30秒登记相对氧浓度(％)。\n结果\n与不同样品的氧消耗相对应的曲线如图19所示。对于未加AF 的样品，在样品注射后立即可见氧浓度的相对减少。对于含AF的样 品，在曲线结束前观察到对数期且氧浓度减少。与未加AF的样品相 比在对数期后仅观察到氧消耗率的微量减少。对具有最高量AF的样 品，观察到最长的对数期。对这些样品还观察到耗氧率更低，这经过 与对照(0μM)斜率相比这些曲线斜率更小来观察。\nESR分析：\n方法：\n经过与H2O2(0.17mM)和FeSO4(4.8μM)的Fenton反应产 生羟基。产生的基团以5，5-二甲基-1-二氢吡咯N-氧化物 (DMPO，9.7mM)捕获。以1.3mM和6.3mM的浓度加入AF。以浓度为 0.25mg/ml(克数相当于1.26mM AF)分析迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)的水溶性提取物。120秒后在室温(20±1℃)下 进行测量并在300秒后对相同的反应混合物重复测量，使用下面分光 计装置：中心场3475.60G；清除宽度55G；微波功率20mW：调节频 率100KHz；调节距离1.01G；接受器放大1.00·105；转变时间 81.92毫秒，恒定时间163.84毫秒，清除时间83.89秒。\n结果\n以DMPO捕获产生的羟基。自旋加合物产生特征性的1∶2∶2∶1 ESR光谱。光谱峰高与产生的自旋加合物量成比例。DMPO和AF的加 入在自旋陷阱和AF之间形成竞争。峰高的降低表明AF较好的清除活 性。\n表：ESR-光谱的峰高。H2O2＝0.17mM，Fe2+＝4.8μM。   脱水果糖[mM]   迷迭香提取物[mg/ml]   峰高   [120s]   峰高   [300s]   0   0   2475   2780   1.3   0   2634   2545   6.3   0   1781   1900\n可见在1.3mM AF浓度时无羟基清除活性，在6.3mM AF时峰高减 小，表明产生的部分羟基被AF清除。\n4.AF作为抗氧化剂的应用\n实施例4.1\nAF作抗氧化剂在50％蛋黄酱中的应用\n在饮食供应和零售交易中，50％蛋黄酱用于色拉，打开的夹心面 包片等。50％蛋黄酱油含量低使其适于低热量应用。\n典型的蛋黄酱组合物如下：\n大豆油                        50.0％\n龙蒿醋(10％)                  4.0％\n蛋黄                          3.5％\n糖                            3.0％\n盐                            1.0％\n山梨酸钾                      0.1％\n水                            35.2％\nMAYODAN 602                   3.0％\n柠檬调味品10251               0.2％\nMAYODAN 602可保证良好的稳定的油分散和所需的粘度，从而使 50％蛋黄酱具有较长的货架寿命。\n调味品10251是天然柠檬调味品，它使蛋黄酱具有新鲜的柠檬口 味。\n典型的蛋黄酱以下列方法制备：\n1)干燥混合MAYODAN 602，糖和盐。以1份粉末2份油的比例 分散于油中。\n2)向水中加入调味品和山梨酸钾并注入Koruma混合器中。加 入1)。\n3)加入蛋黄酱。\n4)在真空中连续加油。\n5)已(缓慢)加入2/3的油后。将剩下的1/3的油与龙蒿醋 混合并加入。\n下面资料表明，当将AF作为抗氧化剂加入蛋黄酱中时，结果可 比得上已知的食品抗氧化剂GRINDOX 142和GRINDOX 1029。\nGRINDOX 142：\n抗坏血酸棕榈酸酯                  10％\n丙基没食子酸                      20％\n柠檬酸                            10％\n食品级乳化剂                      60％\n25℃的形态                        膏状\n颜色                              灰色至浅棕色\n密度                              1.1g/ml\n(所有百分数均是重量百分数)。\nGRINDOX 1029：\n抗坏血酸棕榈酸酯                  20％\n天然生肓酚                        20％\n食品级乳化剂                      60％\n在25℃的形态                      膏状\n颜色                              亮棕色\n在25℃的密度                      1.0g/ml\n(所有百分数均是重量百分比)。\n在试验程序中，向蛋黄酱中加入抗氧化剂使抗氧化剂浓度大约为 500ppm。然后将蛋黄酱放入80℃含纯O2的弹型量热计中。再测量产 品发生大量氧化的潜伏期。\n结果如下：\n样品                        IP(小时)\n1.空白                      28,0\n2.+500ppm GRINDOX 142       35,0\n3.+500ppm GRINDOX 1029      33,3\n4.+550ppm GRINDOX 1029      34,3\n5.+500ppm 1，5脱水果糖-D-   32,0\n(IP小时＝潜伏期)\n这些结果表明AF是优良的食品抗氧化剂并可比得上已知的食品 抗氧化剂GRINDOX 142或GRINDOX 1029。\n实施例4.2\nAF作为抗氧化剂在色拉调味汁中的应用\n含50％油的酸乳酪色拉调味汁\n含50％油的酸乳酪色拉调味汁用于色拉，马铃薯，生蔬菜色拉， 肉，鱼和煮过的蔬菜。\n组成：\n大豆油                               50.0％\n酸乳酪(普通)                         39.0％\n醋(10％)                             3.5％\n糖                                   3.0％\n蛋黄                                 2.0％\n盐                                   1.0％\n山梨酸钾                             0.1％\nMAYODAN 525                          1.4％\n掩盖酸味的调味2072                   0.02％\nMAYODAN 525提供了极好的乳剂稳定性，防止凝固，确保均匀的 油分散和粘度，改善了生产过程的耐受性并保证其货架寿命长。\n调味品2072是特性相同，掩盖了酸味的调味品，它减小了酸味 而不影响其pH值。\n加工过程：\n1.将干燥的MAYODAN 525，糖和盐混合。以1份粉末比2份油的比 例分散于油中。\n2.将调味品，山梨酸钾和酸乳酪加入Koruma混合器中。加入1)。\n3.加入蛋黄。\n4.在真空中连续加油。\n5.加入2/3的油(缓慢)后，将醋与剩余的1/3的油混合并加入。\n6.如果需要就加入香料。\n试验结果：\n样品：                        IP小时     PF\n1.空白                        37.2       1.00\n2.500ppm脱水果糖              39.5       1.06\n3.800ppm GRINDOX 1032         43.3       1.07\n(IP-潜伏期)；(PF-保护系数)\n保护系数(PF)：\n对于每个温度下的AF定义为：\nPF＝加入了抗氧化剂的油的IP/未加入抗氧化剂的相同油的IP。\n寿命延长(LE)％：\nLE＝(PF-1.0)×100\n6. α-1，4-葡聚糖裂解酶的制备\n前言：\n至于本发明进一步的实施方案，用于制备AF的α-1，4-葡聚 糖裂解酶可从真菌感染的藻类中分离，优选真菌感染的 Gracilariopsis lemaneiformis，更优选来自青岛(中国)的真菌感 染的Gracilariopsis lemaneiformis。\n作为选择，可从真菌中获得该酶。例如，真菌可以是Discina perlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula， Mitrophora hybrida，尖顶羊肚菌，Morchella costata弹丝羊肚菌， Morchella hortensis，Morchella rotunda普通羊肚菌，疣孢褐盘 菌，Sarcosphaera eximia，Disciotis venosa，可食鹿花菌，卷曲 马鞍菌，空隙马鞍菌，Leptopodia elastica，指状钟菌和羊肚菌属 的其它种类中任意一种。优选该真菌是Morchella costata或普通羊 肚菌。\n至于本发明进一步的实施方案，用于制备AF的α-1，4-葡聚 糖裂解酶可仅从藻类中分离，优选Gracilariopsis lemaneiformis， 更优选来自Santa Cruz(加利福利亚)的Gracilariopsis lemaneiformis。\n最初的酶纯化可按Yu等(出处同上)描述的方法进行。然而， 优选的是最初的酶纯化包括一种最优化的程序，其中所用的固相支持 物在纯化步骤中不分解。该凝胶支持物还具有的优势是它与标准实验 室蛋白质纯化装置相配伍。这种最优化的纯化方法的细节在下文描述。 用已知的蛋白质纯化的标准技术终止纯化。\n使用互补电泳技术易于确定酶的纯度。\nA.来源＝真菌感染的藻类：\n下面序列资料用于产生下述PCR反应的引物并用于检查以各自的 核苷酸序列产生的氨基酸序列。\n来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的肽集合的氨基酸 序列：\nTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala\nAla Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn\nAsp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly\nGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu\nAsn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp\nTyr Lys Pne Gly Pro Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala\n用于产生引物A和B的氨基酸序列(27-34)(Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val)\n引物A：\nATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) TC(GATC) AA(CT) GT 128种混合\n引物B\nATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) AG(CT) AA(CT) GT 64种混合\n用于生产引物C的氨基酸序列(40-50)(Gly Gly His Asp Gly Tyr)：\n引物C：\nTA(GATC)CC (GA)TC (GA)TG (GATC)CC (GATC)CC 256种混合\n[该序列与互补链相对应]。\n用于生产引物E的氨基酸序列(74-79)(Gln Trp Tyr Lys Phe Gly)：\n引物E：\nGG(GATC) CC(GA) AA(CT) TT(GA) TAC CA(CT) TG 64种混合\n[该序列与互补链相对应]。\n用于产生引物F1和F2的氨基酸序列(1-6)(Tyr Arg Trp Gln Glu Val)：\n引物F1\nTA(TC) CG(GATC) TGG CA(GA) GA(GA) GT 32种混合\n引物F2\nTA(TC) AG(GA) TGG CA(GA) GA(GA) GT 16种混合\n首次PCR扩增获得的序列(克隆1)：\nATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT\nTCTTGGCGGC CACGACGGTT A\nMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly\nGly His Asp Gly\n第二次PCR扩增获得的序列(克隆1)：\nATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT\nTCTTGGTGGA CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG\nAGAATTCGAC CGAACGNGAA TTGTACTTGC CCGTGCTGAC CCAATGGTAC\nAAATTCGGCC C\nMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly\nGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu\nArg Giu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Giy Pro\n第三次PCR扩增获得的序列(克隆2)：\nTACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA\nATGCGGCTTT CGGGAAACCG ATTATCAAGG CAGCTTCCAT\nGTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC\nCACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT\nGTGCACCTGT TGTGTGGGAG AATACAACCA GTCGCGATCT\nGTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC\nTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Gly Lys\nPro Ile Lys Ala AIa Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp\nAsp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val\nTrp Glu Asn Thr Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys\nPhe Gly\nA.1.Gracilariopsis lemaneiformis的细胞学研究：\nA.1.1.1.Gracilariopsis lemaneiformis中真菌感染的检测：\n对在中国收集的Gracilariopsis lemaneiformis进行徒手切片 或石蜡包埋材料切片。以光学显微镜检术仔细研究切片材料。在 Gracilariopsis lemaneiformis中清楚地检测到真菌菌丝。\nGracilariopsis lemaneiformis的叶状体由以高度有序且几乎 以对称方式存在的细胞组成。G.lemaneiformis的管状叶状体由大 型无色中央细胞被延长的、纤细的椭圆形细和小而圆的带红色色素的 外周细胞包围组成。所有藻类细胞类型的特征在于有厚的细胞壁。大 多数真菌菌丝发现在大型细胞的中央层和外周层之间的界面上。这些 细胞可清楚地从藻类细胞中区分，因为它们是长圆柱形。观察到菌丝 的生长是在高度有序的藻类细胞之间无规则生长。菌丝最通常的方向 是沿藻类叶状体的主轴方向。偶尔也检测到向中央和外周的侧向分枝。 菌丝不会与藻类内生/附生的第二世代混淆。\n已知钙粉白染色含几丁质和纤维素的组织。与几丁质的反应需要 4个共价连接的末端N-2酰葡糖胺残基。普遍接受纤维素几乎局限 于高等植物，尽管在有些藻类中可能存在微量纤维素。还已知在江蓠 属中不存在几丁质。\n发现钙粉白染色区与切片的Gracilariopsis lemaneiformis材 料中的真菌菌丝细胞壁相对应。\n当在紫外灯下观察时，相对于江蓠属组织淡蓝色的背景菌丝呈现 清楚的白色(见图1)。几丁质是大多数真菌的主要细胞壁成份，但 在江蓠属中缺失。根据这些观察结果，我们得出结论，所研究的藻类 被真菌感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中40％ 的下部被真菌菌丝感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis 切片中25％的藻类顶端被感染。\n用过碘酸希夫氏(PAS)染料和苯胺兰黑染色切片的 Gracilariopsis lemaneiformis揭示了与藻类细胞相比真菌细胞内 的碳水化合物含量明显更高(见图2)。番红O和孔雀绿染色表现出 与在真菌感染的高等植物中所发现的真菌细胞相同的颜色反应。\n吖啶橙与切片的Gracilariopsis lemaneiformis的反应显示出 真菌清楚的无规则生长。\nA.1.1.2.电子显微镜检术\n用钙粉白检测到真菌的带有15μm厚切片的载玻片在2％OsO4 中固定，用水洗涤并在二甲氧基丙烷和无水乙醇中脱水。在玻璃片的 每个切片上加一滴丙酮与Sparr树脂1∶1的混合物，1小时后用1 滴纯树脂代替。树脂填充的明胶包埋胶囊面朝下放在切片上并4℃放 置过夜。在55℃聚合8小时后，经过浸入液氮可从载玻片上分离附着 于树脂块上的厚切片。\n修块并用切片机上的钻石刀片切成100nM厚的切片。切片在醋酸 铀水溶液和在柠檬酸铅中染色。在电子显微镜下以80KV检查切片。\n研究证实了光学显微镜的观察结果并提供了产生裂解酶的G. 1amneiformis中国品种被真菌性寄生物或共生物感染的进一步证据。\n真菌菌丝由50至100μm长，直径仅几微米的管状细胞构成。细 胞依次排列，相邻细胞之间有隔膜壁。偶尔也见分枝。菌丝在藻类叶 状体厚细胞壁之间生长而不穿透细胞壁或损伤细胞。已知这种称为真 菌藻类共生体的共生关系也发生于一些丝状海洋真菌和大型海洋藻类 之间(DonK and Bruning，1992-Eeology of aquatic fungi in and on algae。In Reisser，W.(ed)：Algae and Symbioses： Plants，Animals，Fungi，Viruses，Interactions Explored. Biopress Ltd.，Bristol.)。\n检查图10的显微照片，可注意到藻类和真菌细胞之间的一些区 别。与藻类几个μm厚的细胞壁相反，真菌细胞壁仅100-200nm厚。 在藻类细胞中可见植物典型的细胞器，如具有类囊体膜的叶绿体以及 红藻淀粉粒，但在真菌中未发现。\n红藻细胞间连接的特征在于称为纹孔栓或纹孔连接的特殊结构。 该结构是凸出的电子致密核心且它们是藻类分类学中的重要特征 (Pueschel，C.M.：An expanded survey of the Ultrastructure of Red algal pit plugs，J.Phycot.25，625，(1989))。在我 们的材料中，在藻类叶状体中常观察到这种连接，但在真菌细胞间从 未发现。\nA.1.2.原位杂交实验：\n原位杂交技术是根据对mRNA的反义核糖核苷酸序列的杂交的原 理进行的。该技术用于显示显微切片中存在所说的mRNA的区域。在 本发明的特定情况下，该技术用于定位Gracilariopsis lemaneiformis切片中的α-1，4-葡聚糖裂解酶。\nA.1.2.1.用于原位杂交的35S标记的探针的制备：\n将第三次PCR扩增的2386p的PCR片段(称为克隆2(见上面)) 克隆进pGEM-32f(+)载体(Promega)。以SP6启动子趋动反义 RNA的转录，以T7启动子趋动有意义RNA的转录。使用具有下列修 改的核糖核酸酶保护试验试剂盒(Ambion)。将转录子通过6％测序 凝胶以去掉未掺入的核苷酸并用含有体外转录试剂盒(Ambion)中的 T7RNA聚合酶的洗脱缓冲液洗脱。反义转录子含23个非编码的核苷 酸，而有意义转录子含39个核苷酸。为进行杂交，使用107cpm/ml 的35S标记的探针。\n基本上按照Langedale等(1988)所述进行原位杂交。发现最适 的杂交温度为45℃。45℃洗涤后用Kodak K-5照相乳胶覆盖切片并 在5℃黑暗中放置3天(参考文献：Langedale，J.A.，Rothermel， B.A.and Nelson，7，(1988)。Genes and development 2：106- 115，Cold Spring Harbour Laboratory)。\n在使用针对α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA的核糖核苷酸探针的 原位杂交实验中，在Gracilariopsis lemaneiformis中检测到的真 菌菌丝上和周围显示出强烈的杂交信号(见图4和5)。认为这有力 地表明产生了α-1，4-葡聚糖裂解酶。在两种Gracilariopsis lemaneiformis藻类组织中检测到微弱的随机背景反应。用有意义和 反义探针都观察到这种反应。仅用反义探针获得了对真菌菌丝的强烈 染色。\n以在45℃杂交的标准杂交条件和洗涤步骤获得这些结果。在50℃ 观察不到对真菌的染色，而背景染色仍相同。对于有意义和反义探针 而言，将温度升高到55℃明显地且同等地减小了背景染色。\n根据使用互补染色程序的细胞学研究，可得出结论 Gracilariopsis lemaneiformis被真空感染。在藻类组织的下部感 染最显著。\n在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料上原位杂交结果 清楚地表明：杂交局限于发现真菌感染的区域(见图4)。结果表明： α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA似乎局限于Gracilariopsis lemaneiformis上真菌感染的区域。根据这些观察结果，我们得出结 论：在真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis上检测到α-1，4 -葡聚糖裂解酶活性。\nA.2.酶的纯化和表征：\n按下面方法进行从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis 材料中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。\nA.2.1.材料和方法\n经过滤收获藻类并用0.9％NaCl洗涤。经匀浆破碎细胞，接着 在50mM柠檬酸-NaOH pH6.2(缓冲液A)中在冰上超声处理6×3 分钟。以25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的 上清液认为是无细胞提取物并在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性 染色和Western印迹。\nA.2.2.以β-环糊精Sepharose凝胶分离\n无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精 Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2 体积合1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α -1，4-葡聚糖裂解酶。汇集活性馏分并将缓冲液换成20mM双- tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。\n将活性组分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。 用缓冲液B以0.3M线性梯度洗脱真菌裂解酶。\n作为选择可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制备浓 缩到150μl并上样到Superose 12柱上，在FPLC条件下操作。\nA.2.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性和测定底物特异性，pH和 温度最适值的条件。\n试验α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支 链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。反应在30℃下进行30分钟并 经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。室温静置10分钟后在 550nm下测光密度。\nA.3. 来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis α-1，4- 葡聚糖裂解酶的氨基酸测序：\nA.3.1.裂解酶的氨基酸测序\n用来自溶组织梭状芽孢杆菌的内切蛋白酶Arg-C或来自 Lysobacter enzymogenes的内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级， 购自Boehringer Mannheim，德国)消化裂解酶。为了用内切酶Arg- C消化，将冷冻干燥的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM 甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6中。用N2覆盖后将加入10μ1 50mM DTT和5mM EDTA的蛋白质变性并在N2中50℃下还原10分钟。随 后加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0中的内切蛋白酶 Arg-C，用N2覆盖并在37℃进行消化6小时。为了进行随后的半胱 氨酸诱导，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在室温黑暗中及 N2存在的条件下保温15分钟。\n为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于 50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。用N2覆盖并加入 5μl 45mM DTT后，将蛋白质变性并在50℃和N2存在的条件下还原 15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在黑暗中 N2存在的条件下室温诱导半胱氨酸15分钟。\n随后，加入90μl水和5μg溶于50μl 50mM麦黄酮和10mM EDTA，pH8.0的内切蛋白酶Lys-C并在N2存在的条件下37℃消化 24小时。\n使用溶剂A：0.1％TFA的水溶液和溶剂B：溶于乙腈的0.1％ TFA经过在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Group：California)上进行反相HPLC分离所得的多肽。在使用脉冲 液体快速循环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前使用相同 的溶剂系统在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μM；Dr.Ole Schou，Novo Nordisk，Denmark)上对选择的肽进行再次色谱。\n来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的酶的氨基酸 序列资料在下面，特别是以SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2显示。\nSEQ.ID.No.1具有：\n残基数：1088\n氨基酸组成(包括信号序列)\n＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝\n61Ala  15Cys   19His  34Met  78Thr\n51Arg  42Gln   43Ile  53Phe  24Trp\n88Asn  53Glu   63Leu  51Pro  58Tyr\n79Asp  100Gly  37Lys  62Ser  77Val\nSEQ.ID.No.2具有：\n残基数：1091\n氨基酸组成(包括信号序列)\n＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝\n58Ala  16Cys   14His  34Met  68Thr\n57Arg  40Gln   44Ile  56Phe  23Trp\n84Asn  47Glu   69Leu  51Pro  61Tyr\n81Asp  102Gly  50Lys  60Ser  76Val\nA.3.2.N-末端分析：\n研究表明天然葡聚糖裂解酶1的N端序列被封闭。基本上按 LeGendre等(1993)[Purification of proteins and peptides by SDS-PAGE；In：Matsudaira，P.(ed.)A.practical guide to protein and peptide purification for microsequencing，2nd edition：Academic Press Inc.，San Diego；pp.74-101]所述用 无水TFA在40℃处理印迹到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶30分钟完成 去封闭。得到的序列是TALSDKQTA，它与来自葡聚糖裂解酶1的克隆 的序列(SEQ.ID.No.1上从51到59位置的序列)相匹配且表明 葡聚糖裂解酶1的N-端残基是N-乙酰苏氨酸。SEQ.ID.No.1 的序列位置1到50代表信号序列。\nA.4. 编码真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4 -葡聚糖裂解酶的基因之DNA测序\nA.4.1.分子生物学方法\n按Saunders(1993)所述并进行下列修改来分离DNA：经ELUTIP -d(Schleicher & Schuell)纯化代替凝胶纯化从DNA中去掉多糖 (参考文献：Saunders，G.W.(1993)，Gel purification of red algal genomic DNA：An inexpensive and rapid method for the isolation of PCR-friendly DNA。Journal of Phycology 29(2)： 251-254and Scheleicher & Schuell：ELUTIP-d.Rapid Method for Purification and Concentration of DNA.)\nA.4.2PCR\n有关DNA分子的制备经过使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，USA)并根据厂家说明书进行，除了Taq聚合酶在后来 加入(见PCR循环)且温度循环变成如下：\nPCR循环：\n循环次数                  ℃            时间(分)\n1                         98            5\n                          60            5\n加入Taq聚合酶和油：\n35                        94            1\n                          47            2\n                          72            3\n1                         72           20\nA.4.3 PCR片段的克隆：\n按供应者的说明书将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。\nA.4.4 DNA测序：\n使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L. F.DNA测序仪，基本上根据Sanger等(1979)的双脱氧方法测序双 链DNA。(参考文献：Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R. (1979)。DNA sequencing with chain-determihating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467.)。\n序列如SEQ.ID.No.s1和2所示。简单地说：\nSEQ.ID.No.3具有：\n碱基总数：3267\nDNA序列组成：850A；761C；871G；785T。\nSEQ.ID.No.4具有：\n碱基总数：3276\nDNA序列组成：889A；702C；856G；829T。\nA.4.5文库的筛选：\n按照厂家说明书对从Stratagene获得的λZap文库进行筛选， 除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg /ml变性鱼精DNA中进行。向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。 在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次并在1× SSC，0.1％SDS中洗两次。\nA.4.6探针\n经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离克隆的PCR 片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并以Agarase(Boehringer Mannheim)从琼脂糖中纯化该片段。由于该片段仅90-240bp长，在 使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to Go DNA 标记试剂盒(Pharmacia)以32P-dCTP标记前，对分离的片段进行 连接反应。\nA.4.7结果\nA.4.7.1编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生：\n来自α-1，4一葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶肽氨基酸序列用 于产生混合的寡核苷酸，它可用作PCR 引物(见上面给出的序列)。\n在第一次PCR扩增中，引物A/B(见上面)用作上游引物，引物 C(见上面)用作下游引物。预期PCR产物的大小为71个碱基对。\n在第二次PCR扩增中，引物A/B用作上游引物，E用作下游引 物。预期PCR产物的大小是161个碱基对。\n在第三次PCR扩增中，引物F1(见上面)和F2(见上面)用作 上游引物，E用作下游引物。预期PCR产物的大小为238个碱基对。\n在2％LNT琼脂糖凝胶上分析PCR产物并从凝胶上切下预期大 小的片段，用Agarase(Boehringer Mannheim)处理，克隆进pT7 blue载体(Novagen)中并测序。\n从第一次和第二次PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽相对应的 氨基酸(见上面)。第三次扩增的克隆(见上面)与测序的肽仅具有 大约87％的同源性。\nA.4.7.2用克隆的PCR片段对基因组文库的筛选\n用上述克隆进行的文库筛选产生2个克隆。一个克隆含SEQ.ID. No.4的核苷酸序列(基因2)。另一克隆含SEQ.ID.No.3的一 些序列(从碱基对1065下游)(基因1)。\n以RACE(cDNA末端的迅速扩增)程序(Michael，A.F.， Michael，K.D. & Martin，G.R.(1988).Rroc.Natl.Acad. Sci.USA 85：8998-99002)使用Gibco BRL的5′race系统获得 SEQ.ID.No.3的5′端。根据Collinge等(Collinge，D.B.， Milligan D.E.，Dow，J.M.，Scofield，G.& Daniels，M.J. (1987).Plant Mol Biol 8：405-414)的方法分离总RNA。根据 厂商方案，使用1μg总RNA进行5′race。根据厂商方案将第二次 扩增的PCR产物克隆进pT7 blue载体。测序3个独立的PCR克隆以 弥补PCR错误。\n使用下面的寡核苷酸作为上游引物： GCTCTAGAGC ATGTTTTCAACCCTTGCG，含序列GL1(即SEQ.ID.No.3) bp 1573-1593的互补序列之引物用作下游引物再进行PCR以便在上 述克隆紧接ATG起始密码子之前加入XbaI和NdeI限制性位点。\n基因1(即SEQ.ID.No.3)的完整序列的产生经过将该基因 的3′端以来自基因组克隆的BamHI-HindIII片段克隆进Stratagene pBluescript IIKS+载体中并将PCR产生的该基因的5′端以XbaI- BamHI片段克隆到3′端前来完成。\n将基因2以HindIII钝端片段克隆进Stratagene pBluescript IISK+载体EcoRV位点。经SacI消化，接着重新连接去掉部分3′ 非翻译序列。经过用HindIII和NarI消化并在下面退火寡核苷酸存在 的条件下重新连接在紧靠起始ATG之前导入HindIII和HpaI限制性位 点：\nAGCTTGTTAAC ATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGG\n    ACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC\n在测序的克隆中发现没有内含子。\n将克隆1型(SEQ.ID.No.3)与所有10个肽序列进行序列 对比显示出1Q0％的相同性。从真菌感染的藻类Gracilariopsis lemaneiformis分离的基因编码的两个蛋白质序列的序列对比表现出 大约78％的相同性，表明两个基因都编码α-1，4-葡聚糖裂解酶。\nA.5GL基因在微生物中的表达\n(例如：毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子 的分析)\n将编码GL的DNA序列导入微生物以生产高比活及高产量的酶。\n关于这点，将基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII钝 端片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用 EcoRI消化且钝端化(使用Amersham International DNA钝端试剂 盒)的毕赤氏酵母表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在巴 斯德毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母表达试 剂盒中记载的方案)。\n在另一实施方案中，将基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI- HindIII钝端片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒) 克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40Pages.59-62)。 根据Daboussi等(Curr Genet(1989)Vol 15 pp453-456)的方法 使用融胞酶Sigma L-2773和融胞酶Sigma L-8012制备原生质体。 原生质体的转化按照Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214) 记载的方案进行，除了在涂布转化的原生质体时按照Punt等 (Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)阐述的方 案但使用0.6％渗压稳定的顶级琼脂糖。\n结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到了裂解 酶活性。\nA.5.1.一般方法：\n无细胞提取物的制备：\n以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于 破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，含1mM EDTA，和5％甘油)中。 使用玻璃珠和Vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白 酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟后再以20,000×g离心5分钟获 得裂解酶提取物(上清液)。\n以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶的活性。\n将1体积的裂解酶提取物与等体积的4％支链淀粉溶液混合。然 后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF。\n还使用放射活性方法分析了裂解酶活性。\n反应混合物含10μl 14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma Chemicals Co.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃静置过夜，然后在 通常的TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard Instrument Co.，Inc，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。\n电泳和Western印迹。\n使用8-25％梯度凝胶和PhastSystem(Pharmacia)进行SDS- PAGE。还在PhastSystem半干燥转移单位上进行Western印迹。\n产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗 体以1∶100稀释使用。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S， Glostrup，Denmark)用作第二抗体并1∶1000稀释使用。\nI部分：含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析\n结果：\n1.培养5天后测定裂解酶活性(根据手册)并证明B系列的所有样 品中的活性在细胞内。\nB系列样品： 11   12   13   15   26   27   28   29   30\n比活性：    139  81   122  192  151  253  199  198  150\n*比活定义为在含2％(w/v)糖原，1％(w/v)甘油，溶于10mM 磷酸钾缓冲液(pH7.5)的反应混合物中每mg蛋白质每分钟释放的 AF nmol值。反应温度为45℃；反应时间为60分钟。\n样品B27的时间过程如下。图1中也提供了该数据。\n时间(分) 0    10    20    30    40    50    60\n比活     0    18    54    90    147   179   253\n试验条件同上，除了时间进行变动。\n2.Western-印迹分析。\n全部样品的CFE显示出具有与天然裂解酶相对应的分子量的带型。 在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶   培养物名称   比活性*   A18   10   A20   32   A21   8   A22   8   A24   6\nII部分，曲霉属转化子\n结果：\nI.培养5天后测定裂解酶活性(基础培养基合0.2％酪蛋白酶促水 解产物)，以碱基3，5-二硝基水杨酸试剂分析。\n1)培养基的裂解酶活性分析\n在生长于含0.2％支链淀粉的培养基中的35个培养物中。5.4+ 和5.9+的培养基中分别含0.13g AF/升和0.44g/升。结果表明从细 胞中分泌了活性裂解酶。在无细胞提取物中也可测量出裂解酶活性。\n2)无细胞提取物中的裂解酶活性分析。   培养物名称   比活性*   5.4+   51   5.9+   148   5.13   99   5.15   25   5.19   37\n*比活性定义为在25℃时每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol数。\n+表示加入0.2％的支链淀粉。\n结果表明GL的基因1在黑色曲霉细胞内表达。\n用转化的E.coli进行实验(使用Qiagen的Qia表达载体试剂 盒中的克隆载体pQE30)显示了酶的表达，该酶可被抗从真菌感染的 Gracilariopsis lemaneiformis纯化的酶的抗体识别。\nB.来源＝真菌\nB.1. 来自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的 酶纯化和表征\nB.1.1.材料和方法：\n真菌Morchella costata从美国典型培养物收集中心(ATCC)获 得。使用ATCC推荐的培养基在摇床中25℃生长真菌。经过滤收获菌 丝并用0.9％NaCl洗涤。\n经过匀浆并随后在50mM柠檬酸-NaOH pH6.2(缓冲液A)中在 冰上声处理6×3分钟破碎真菌细胞。经过以25,000×g离心40分 钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液当作无细胞提取物，在8 -25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹。\nB.1.2.在β-环糊精Sepharose凝胶分离\n将无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精 Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2 体积含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α -1，4-葡聚糖裂解酶。汇集活性组分并将缓冲液换成20mM双- tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。\n将活性馏分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。 用缓冲液B以0.3M NaCl的线型梯度洗脱真菌裂解酶。作为选择，可 将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并 上样到Sepharose 12柱上，在FPLC条件下操作。\nB.1.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性试验和测定底物特异性， pH和温度最适值的条件\n试验α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支 链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。\n反应在30℃进行30分钟并经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终 止反应。室温静置10分钟后在550nm处测定密度。当使用无细胞提 取物时向试验混合物中加入10mM EDTA。\n试验混合物中的底物支链淀粉可用其它底物取代，反应温度可按 说明书中的限定进行变动。\n在pH最适值研究中，反应混合物含以10mg/ml溶于40mM缓冲 液中的支链淀粉或麦芽四糖。所用的缓冲液是甘氨酸-NaOH(pH2.0 -3.5)，HoAc-NaoAc(pH3.5-5.5)，Mes-NaOH(pH5.5-6.7)， Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(7.6- 9.0)。反应在30℃进行30分钟。在温度最适值研究中，反应条件 与上面相同，除了在所有实验中均使用缓冲液Mops-NaOH(pH6.0)。 反应温度如说明书所示进行变动。\n分别使用8-25％梯度凝胶和pH梯度为3-9的凝胶在 PhastSystem(Pharmacia，Sweden)上进行SDS-PAGE，天然-PAGE 和等电聚焦。电泳后，根据厂家(Pharmacia)推荐的程序以银染染 色凝胶。糖蛋白被适于PhastSystem的PAS染色。为进行活性染色， 在自然条件下6℃进行电泳。\n电泳后，在1％可溶性淀粉存在的条件下30℃将凝胶保温过夜。 经过用I2/KI溶液染色显示真菌裂解酶的活性带。\nB.1.4.结果：\nB.1.4.1.α-1，4-葡聚糖裂解酶的纯化，分子量和等电点。\n发现真菌裂解酶吸附到用β-环糊精Sepharose，淀粉和Red Sepharose填充的柱子上。以β-环糊精Sepharose 4B凝胶和淀粉 填充的柱用于纯化目的。\n以该步骤获得的裂解酶制品仅含微量分子量高于真菌裂解酶的污 染蛋白质。可经过在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱或更高效 地经过在Superose 12上凝胶过滤去掉杂质。\n纯化酶表现为无色且在可见光区不显示光吸收。在SDS-PAGE上 估测时测定的分子量是110kDa。\n经过在具有pH梯度为3-9的凝胶上等电聚焦测定时纯化的真 菌裂解酶显示出等电点为pI5.4。在自然凝胶电泳中，酶表现为一条 单一的带。经活性染色检测时，该带表现为淀粉降解活性。根据从中 提取酶的培养物的时间，该酶在自然和等电聚焦凝胶中显示出要么是 一条清晰的带，要么是具有相同迁移率和pI的更分散的带。\nB.1.4.2.真菌裂解酶催化反应的pH和温度最适值\n发现真菌裂解酶催化反应的pH最适值的pH范围在pH5到pH7之 间。\nB.1.4.3.底物特异性：\n纯化的真菌裂解酶降解从麦芽糖到第七糖的麦芽糖类。然而，降 解率不同。对麦芽四糖具有最高活性(活性为100％)，接着是麦芽 六糖(97％)，麦芽七糖(76％)，麦芽三糖(56％)，对麦芽糖观 察到最低活性(2％)。\n真菌裂解酶也降解支链淀粉，直链淀粉和糖原(将测定基％)。 真菌裂解酶是外切裂解酶而不是内切裂解酶，因为它降解对硝基苯基 α-D-麦芽七糖但不降低还原端封闭的对硝基苯基α-D-麦芽七糖。\nB.1.5.普通羊肚菌\n用于普通羊肚菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和鉴定的方案 与上面用于Morchella costata的方案相同(结果相似)。\nB.2. 真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序：\nB.2.1.裂解酶的氨基酸测序：\n用溶组织梭状芽孢杆菌内切蛋白酶Arg-C或Lysobacter enzymogenes内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级，购自Boehringer Mannheim，德国)消化裂解酶。为了用内切蛋白酶Arg-C进行消化， 将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH 7.6中。用N2覆盖并加入10μl 50mM DTT和5mM EDTA后，变性蛋白质并在N2条件下50℃还原10分钟。随后加入 溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0中的1μg内切蛋白酶Arg-C 并在37℃进行消化6小时。为了随后的半胱氨酸诱导，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺并将溶液在N2条件下黑暗中室温保温15分钟。\n为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于 50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。用N2覆盖并加入 5μl 45mM DTT后，变性蛋白质并在N2条件下50℃还原15分钟。 冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在N2条件下黑暗中 室温诱导半胱氨酸15分钟。随后加入90μl水和溶于50μl 50mM 麦黄酮和10mM EDTA，pH8.0中的5μg内切蛋白酶Lys-C并在N2 条件下37℃消化24小时。\n使用溶剂A：0.1％ TFA水溶液和溶剂B：0.1％ TFA的乙腈溶 液在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Group； California)上以反相HPLC分离所得的肽。在使用脉冲液体快速循 环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前使用相同的溶剂系统 在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schou，Novo Nordisk，Denmark)上对选择的肽进行再次色谱。\n来自真菌Morchella costata的酶的氨基酸序列资料如图17所 示。\n来自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列资料如图18所示。\nB.3.编码真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因之DNA测序\nB.3.1.分子生物学方法：\n按Dellaporte等(1983-Plant Mol Biol Rep Vol 1 pp19- 21)所述分离DNA。\nB.3.2.PCR\n经过使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，USA) 并根据厂家说明书进行有关DNA分子的制备，除了Taq聚合酶在后来 加入(见PCR循环)且将温度循环改成如下：\nPCR循环：\n循环次数             C    时间(分)\n1                    98   5\n                     60   5\n加入Taq聚合酶和油：\n35                   94   1\n                     47   2\n                     72   3\n1                    72  20\nB.3.3PCR片段的克隆：\n按照提供者的说明将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。\nB.3.4DNA测序：\n基本上按照Sanger等(1977)的双脱氧方法，使用自动阅读测 序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪测序 双链DNA。(参考文献：Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A. R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinating inhibitors。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467)。\nB.3.5文库的筛选：\n根据厂家说明书对从Stratagene获得的λZap文库进行筛选， 除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg /ml变性鱼精DNA中进行。\n向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。 滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次，在1×SSC，0.1％SDS中洗 两次。\nB.3.6探针\n经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离克隆的PCR 片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并以Agarase(Boehringer Mannheim)从琼脂糖中纯化该片段。由于该片段仅90-240bp长，在 使用32P-dCTP，使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或 Ready to Go DNA标记试剂盒(Pharmacia)标记前，对分离的片段 进行连接反应。\nB.3.7.结果\nB.3.7.1.编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生。\nα-1，4-葡聚糖裂解酶的3个重迭的胰酶肽的氨基酸序列(如 下面所示)用于产生混合的寡核苷酸，它用作从MC和MV分离的DNA 之扩增的PCR引物。\nLys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Tnr Val Leu Asp Ile Val Lys\nPro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys\nGlu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr\nAla Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr\n在第一次PCR扩增中，引物A1/A2(见下面)用作上游引物， 引物B1/B2(见下面)用作下游引物。\n引物A1：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGCT(GATC)AA(GA)GA(CT)AC\n引物A2：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGTT(GA)AA(GA)GA(CT)AC\n引物B1：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GA)CT(GA)TG(GA)TA\n引物B2：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GATC)GA(GA)TG(GA)TA\n在2％LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物，从凝胶上切下预期大 小的片段并用Agarase(Boehringer Mannheim)处理，克隆进 pT7 blue载体(Novagen)中并测序。\n从PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽(见上面)相对应的氨基 酸并在每个例子中增加了2个内含子序列。对于MC，PCR扩增的DNA 序列与参照图14从位置1202到位置1522所示的序列相对应。对于 MV，PCR扩增的DNA序列与参照图15中从位置1218到位置1535所 示的序列相对应。\nB.3.7.2用克隆的PCR片段对基因组文库进行筛选。\n对于每种来源，用上述克隆对文库的筛选产生2个克隆。对于MC， 两个克隆接合形成图14所示的序列(见下面)。对于MV，以上面描 述的方式可结合两个克隆形成图15所示的序列。\n为了在MC克隆中紧接ATG起始密码子之前加入PstI，PvuII， AscI和NcoI限制性位点，使用下面的寡核苷酸作为上游引物： AAACTGCAGCTGGCGCGCC ATGGCAGGATTTTCTGAT 含图4 bp1297-1318的互补序列的引物作为下游引物再进行一次 PCR。\n经过将基因5′端以来自基因组克隆之一(第一克隆)的BglII -EcoRI片段克隆进Stratagene pBluescript II KS+载体的BamHI -EcoRI位点产生MC的完整序列。用EcoRI和EcoRV消化修饰的 pBluescript II KS+载体后经过连接来自另一基因组克隆(第二克 隆)的NspV(已钝端化，使用Amersham International DNA钝端试 剂盒)-EcoRI片段将该基因的3′端克隆进修饰的pBluescript II KS+载体中。然后，将该基因的中间部分片段以来自第一克隆的 EcoRI片段的形式克隆进进一步修饰的pBluescript II KS+载体中， 这经过将该片段连接到用EcoRI消化的进一步修饰的pBluescript II KS+载体中实现。\nB.4.GL基因在微生物中的表达\n可将编码GL的DNA序列导入微生物中以便生产高比活和高产量 的该酶。\n关于这点，将MC基因(图14)以XbaI-XhoI钝端化(使用 Amersham International DNA钝端试剂盒)片段克隆进用EcoRI消 化且钝端化(使用Amersham International的DNA钝端试剂盒)的 毕赤氏酵母属表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在巴斯 德毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母属表达 试剂盒中记载的方案)。\n在另一实施方案中，将MC基因1(与图14相同，除了按上述 经PCR导入限制性位点进行修饰)以PvuII-XhoI钝端化片段(使用 Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲 霉属表达载体pBARMTE1(含来自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗 性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40pages 59-62)。根据Daboussi等(Curr Genet(1989)Vol 15 pp453-456)使用溶胞酶Sigma L-2773和 溶胞酶Sigma L-8012制备原生质体。接着根据Buxton等(Gene (1985)Vol 37 pp207-214)记载的方案进行原生质体的转化，除 了涂布转化的原生质体按照Punt等(Methods in Enzymology(1992) Vol 216 pp447-457)阐述的方案进行但使用0.6％等渗稳定的顶级琼 脂糖。\n结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到裂解酶 活性。\n               毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属\n                     裂解酶转化子的分析\n一般方法：\n无细胞提取物的制备：\n以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于 破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。 使用玻璃珠和vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白 酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟，接着以20,000×离心5分钟 获得裂解酶提取物(上清液)。\n以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶活性。\n将1体积的裂解酶提取物与等体积4％支链淀粉溶液混合。然后 在控制的温度下保温反应混合物，以限定的时间间隔取样并分析AF。\n也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。\n反应混合物含10μl 14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma Chemicals Co.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃静置过夜，然后在 通常的TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard Instrument Co.，Inc.，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。\n电泳和Western印迹\n使用8-25％梯度凝胶和PhastSystem(Pharmacia)进行SDS- PAGE。也在PhastSystem的半干燥转移单位上进行了Western印迹。 产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗体以 1∶100稀释使用。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S， Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000稀释使用。\nI部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析 在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶   培养物名称   比活性*   A18   10   A20   32   A21   8   A22   8   A24   6\n*比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。\nII部分：曲霉属转化子\n结果：\nI.培养5天后(含0.2％酪蛋白酶促水解产物的基础培养基)以碱 性3，5-二硝基水杨酸试剂分析来测定裂解酶活性：\n无细胞提取物中的裂解酶活性分析：\n  培养物名称   比活性*   8.13   11   8.16   538   8.19   37\n*比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。\n结果表明：在黑色曲霉细胞内表达MC-裂解酶。\nII，以放射活性方法试验裂解酶活性\n下列培养物的无细胞提取物含14C标记的AF。\n51+，54+，55+，59+，512，513，514，515，516，518，519。\n使用14C-淀粉作底物的α-1，4-葡聚糖裂解酶反应之降解产 物的TLC如图20所示。将反应混合物上样到TLC上。泳道号与培养 物名称相对应：1，512；2，513；3，514；4，515；5，516： 6，517；7，518；8，519；9，520。快速移动点是AF。\nC.来源＝藻类本身\n用于酶纯化和从Gracilariopsis lemaneiformis(从Santa Cruz 获得)获得的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鉴定之方案基本上与上面所 述的方案(例如，用于Morchella costata的方案)相同(结果相 似)。\n1.从加利福利亚收集的无寄生物的红海藻Gracilariopsis\nlemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鉴定\n裂解酶的氨基酸组成在下表中给出：\n氨基酸残基               每种残基的mol％\nAsx                       15.42\nThr                       5.24\nSer                       6.85\nGLx                       9.46\nPro                       5.46\nGly                       9.08\nAla                       5.38\n1/2Cys                    1.57\nVal                       6.60\nMet                       2.90\nIle                       3.66\nLeu                       6.00\nTyr                       6.00\nPhe                       4.37\nHis                       1.65\nLys                       4.44\nArg                       4.17\nTrp                       1.75\n总计：                    100.00\n2.序列分析：\n比较来自加利福利亚藻类的肽序列与来自中国真菌感染的藻类的 氨基酸序列表明两蛋白质序列之间显示出高度同源性(从PCR片段产 生的氨基酸序列与中国藻类GL的相应序列之间有78％到80％的相同 性)。\n从加利福利亚藻类的两个序列产生了3个寡核苷酸以产生大约 970bp的PCR片段。\n引物1：ATGAC(GATC)AA(CT)TA(CT)AA(CT)TA(CT)GA(CT)AA\n引物2：(AG)TG(GATC)GGCATCAT(GATC)GC(GATC)GG(GATC)AC\n引物3：GTCAT(GA)TC(CT)TGCCA(GATC)AC(GA)AA(GA)TC\n在第一次PCR扩增中引物1用作上游引物，引物2用作下游引物。 在第二次PCR扩增中，引物1用作上游引物，引物3用作下游引物。 产生了一个预期大小的PCR片段并将它克隆进Novagen pT 7blue载 体中。测序了含PCR片段的3个独立的质粒，可见这三个克隆的PCR 片段含来自3个不同蛋白质的肽序列的密码子。这表明在加利福利亚 藻类中至少有3种不同的编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。\n3.在达到最大速度一半时的底浓度对支链淀粉是3.76mg/ml，对糖 原是3.37mg/ml。\n4.下面给出了裂解酶对各种底物的降解率：   底物   释放的AF(nmol)   麦芽糖   657   麦芽三糖   654   麦芽四糖   670   麦芽五糖   674   麦芽六糖   826   麦芽七糖   865   糊精20   775   糊精15   775   糊精10   844   支链淀粉   732   糖原   592\n反应条件：反应混合物含10mM HOAc-NaOAc(pH3.8)。底物浓 度是10mg/ml。加入裂解酶和水后的终体积是100μl。在45℃下的反 应时间为40分钟。\n裂解酶不能降解出芽短梗孢糖，黑曲霉四糖，海藻糖，异麦芽糖， 葡萄糖，α-，β-和γ-环糊精。裂解酶降解6-α-葡糖基麦芽 糖和nigerose，尽管其降解速率缓慢。\n5.当使用支链淀粉作底物时裂解酶的温度最适值为48℃，当使用糖 原作底物时为50℃。在50℃时，糖原反应性与支链淀粉相似；在50℃ 以下，支链淀粉是比糖原更好的底物。\n6.裂解酶的pH最适值范围在pH3.5和pH7.0之间；最适pH为 3.8。在pH试验中所用的缓冲液是甘氨酸-HCl(pH2.2-3.6)； NaOAc-HOAc(pH3.5-5.5)：Mes-NaOH(pH5.5-6.7)； Mops-NaOH(pH6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH7.6- 9.0)。所用的全部缓冲液是40mM。\n7.终浓度为2mM时，对氯汞苯甲酸(PCMB)抑制96％的裂解酶活 性，表明-SH基团对酶活性是必需的。\n7.进一步的研究\n7.1醇类在增加从真菌感染的藻类中纯化的裂解酶活性和稳定性中 的影响。\n以下面浓度(0％，1％，5％和10％)试验了1-丙醇，2- 丙醇和1-丁醇。1-丙醇的最佳浓度为5％，保温6天后可增加 34％的AF产率：2-丙醇的最佳浓度1％，保温10天后可增加 20％的AF产率；1-丁醇的最佳浓度5％，保温3天后增加52％的 AF产率。\n以下列浓度(0，1，3，5，7，9，11，13，15％)试验了 乙醇。保温7天后的最佳浓度为5％，它能增加12％的AF产率。对 于10天保温，最佳浓度为3％，它能增加16％的AF产率。\n1-丙醇的影响：\n1-丙醇浓度                  反应时间(天)\n(v/v)          0      1     3        6            10\n                      AF产量(μmol)\n0％            0      84    261      451          689\n1％            0      80    280      530          803\n5％            0     115    367      605          853\n10％           0     107    307      456          583\n7.2.不同反应介质对真菌感染的藻类纯化的裂解酶和M.costata 及普通羊肚菌的真菌裂解酶产生AF的影响。\n2.1.来自真菌感染的藻类的裂解酶\n结果(见下表)表明：最佳反应介质是5mM的HOAc-NaOAc(pH 3.9)(BACE for short)和含mM浓度的Na2-EDTA。使用纯 水或0.85％NaCl作反应介质的AF生产减小了产率。在BACE中含有 0.85％NaCl时也减少AF产率。\n反应介质         反应时间(天)\n                 0       1        3         8\n                         AF产量(μmol)\nBACE             0       229      498       575\n水               0       46       128       217\nNaCl(0.85％)     0       123      239       249\nBACE+NaCl(0.85％)0       153      281       303\n2.2.下列缓冲液：Mes-NaOH，Mops-NaOH，Hepes-NaOH，和N- 二(羟乙基)甘氨酸-NaOH是M.costata和普通羊肚菌裂解酶的最 适反应介质。在HOAc-NaOAc缓冲液中，裂解酶不稳定，因此使用该 缓冲系统引起AF产率减少。\n7.3.内切淀粉酶和脱支酶对AF生产的影响\n3.1.内切淀粉酶的影响\n用于AF生产的淀粉可首先经内切淀粉酶或经酸水解液化。\n与天然淀粉相比，内切淀粉酶降解的淀粉更适于作裂解酶的底物。 在用于裂解酶催化的反应的温度下，淀粉具有有限的溶解力。用内切 淀粉酶处理淀粉导致葡萄糖产量增加。关于AF生产，发现还原物质 为大约10-15％(根据干物质)时最适于作为裂解酶底物，而用内切 淀粉酶进一步处理成19％的还原物质时不再适合于裂解酶。\n3.2.支链淀粉酶和异淀粉酶的影响。\n从下面结果可见，在pH4.5和5.0时异淀粉酶和支链淀粉酶都 增加AF产率达50％。反应系统由加入或不加异淀粉酶或支链淀粉酶 (MegaZyme Ltd.)的真菌感染的红藻裂解酶组成。支链淀粉用作底 物。在仅有裂解酶存在的条件下产生的AF表达为100％\n                       反应介质的pH\n加入的酶           3.5       4.5         5.0\n仅有裂解酶         100       100         100\n裂解酶+异淀粉酶    136       152         150\n裂解酶+支链淀粉酶  132       158         155\n4.真菌裂解酶对各种底物的有关降解率\n4.1.M.costata裂解酶\n用麦芽四糖观察到的活性表达为100％。 底物浓度 麦芽糖 麦芽三糖 麦芽四糖 麦芽五糖 麦芽六糖 麦芽七糖 糊精10* 糊精15* 糊精20* 可溶性淀粉 支链淀粉 糖原 2mg/ml 0.5 40.6 100 107.1 86.6 82.2 -** - - - - -   4mg/ml   1.6   58.6   100   100.1   98.2   81.5   -   -   -   -   -   -   10mg/ml   2.2   56.0   100   99.7   95.9   75.7   68.3   61.1   46.6   92.9   106.5   128.5\n*数字表示还原物质的干重含量。\n**，未检测到。\n4.2.普通羊肚菌裂解酶\n用麦芽四糖观察到的活性处理为100％。全部底物的终浓度为 1Omg ml-1。   底物   活性(％)   麦芽糖   10.1   麦芽三糖   49.8   麦芽四糖   100.0   麦芽五糖   79.3   麦芽六糖   92.4   麦芽七糖   73.9   糊精10   62   糊精15   45   糊精20   37   可溶淀粉   100.5   支链淀粉   139.9   糖原   183.3\n来自M.costata和普通羊肚菌的裂解酶不能降解下列糖类。\n对于海藻糖，6-α-葡糖基麦芽糖，nigerose，黑曲霉四糖， 葡萄糖，异麦芽糖，α-，β-和γ-环糊精，出芽短梗孢糖和非还 原端封闭的对硝基苯基α-D-麦芽七糖，将这些底物与真菌裂解酶 保温48小时后，在TLC板上检测不到AF。\n7.5.裂解酶催化反应的pH和温度最适值：   GL来源   最适pH   最适pH范围   最适温度   M.costata   6.5   5.5-7.5   37℃；40℃a   普通羊肚菌   6.4   5.9-7.6   43℃；48℃a   真菌感染的Gracilariopsis   lemaneiformis     3.8     3.7-4.1     40℃；45℃a\na使用糖原作底物测定的参数；使用支链淀粉作底物测定其它参数。\n7.6.糖原对真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的裂解酶 的稳定影响。\n结果表明当使用糖原作底物代替支链淀粉时，温度越高，反应率 越高。\n                          反应温度\n底物           25℃          30℃            45℃\n支链淀粉       0.818a       1.133a        1.171a\n糖原           0.592a       0.904a        1.861a\n糖原和支链淀粉之间相对反应率的比率(％)\n               72.4          79.8            158.9\na，相对反应率\n7.7.裂解酶的分子量和pI值：\n使用SDS-PAGE在梯度凝胶(8-25％)上估测真菌感染的G. lemaneiformis裂解酶，明显无真菌的G.lemaneiformis裂解酶的 两种形式，M.costata和普通羊肚菌裂解酶的分子量为110,000± 10,000道尔顿。\n真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶的pI为大约3.9。对于普 通羊肚菌裂解酶，pI为大约pH4.6，M.costata裂解酶的pI为大 约5.0。这些值经过在具有pH梯度从3到9的凝胶上等电聚焦获得。\n从氨基酸组成推断的pI值：真菌感染的G.lemaneiformis裂解 酶为4.58，M.costata裂解酶为6.30。\n7.8.经Western印迹对裂解酶进行免疫学试验。\n结果表明：以Western印迹揭示了抗藻类裂解酶的抗体可识别无 细胞提取物中和纯化形式的真菌裂解酶。抗从中国收集的藻类的藻类 裂解酶纯化形式的抗体也识别从加利福利亚Sant Cruz收集的藻类的 裂解酶。\nGL来源                        与抗真菌感染的G.lemaneiformis\n                              GL抗体的反应性\n真菌感染的G.lemaneiformis            强烈\n加利福利亚G.lemaneiformis\n的GL两种形式                         强烈\nM.costata                            中等\n普通羊肚菌                           中等\n7.9.真菌裂解酶的可逆的和不可逆的抑制剂\n9.1.可逆的抑制剂，葡萄糖和麦芽糖。\n当使用支链淀粉作底物时，在10mg/ml的底物浓度下，当存在 0.1M葡萄糖时，M.costata裂解酶活性减小19.3％；当使用糖原作 底物时，活性不受影响。在0.1M麦芽糖存在的条件下对糖原和支链 淀粉基活性分别减小48.8％和73.4％。\n底物浓度                      抑制剂\n                      葡萄糖           麦芽糖 \n支链淀粉  1％(2％)    19.3％(7％)      73.4％(67.2％)\n糖原      1％(2％)    0.000(-)         48.8％(49.7％)\n似乎0.1M葡萄糖的抑制是竞争性的，因为随着底物从1％增加 到2％，抑制从19.3％减小到7％，而0.1M麦芽糖的抑制是非竞争 性的，因为底物的增加不明显影响抑制程度。\n对于普通羊肚菌裂解酶，当使用支链淀粉或糖原作底物时，0.1M 葡萄糖和麦芽糖不抑制反应。 底物   葡萄糖   麦芽糖 支链淀粉(1％)   28％   80％ 糖原(1％)   5％   57％\n9.2.可逆的抑制剂deoxyjirimycin\n使用支链淀粉作底物，在最终底物浓度为2％时，25μM deoxyjirimycin的存在使藻类裂解酶和M.costata裂解酶活性减小 10.4％。在100μM时，两种裂解酶的活性完全丧失。\n9.3.不可逆抑制剂：PCMB\n在相同的试验条件下，当存在2mM PCMB时，M.costata裂解 酶活性减小60％，真菌感染的红藻裂解酶减小98％。这意味着真菌裂 解酶对重金属抑制的敏感性小得多。\n7.10.实验室规模生产AF的实施例\n反应器含1000g糊精(经过用Termamyl将淀粉处理成最终还原 物为10％获得)，终体积为4.6升(HOAC-NaOAc，pH3.9，含5mM Na2-EDTA)。经过加入3mg从真菌感染的藻类纯化的裂解酶。反 应在室温下进行。在第19天，加入另一批裂解酶(4mg)。\n反应时间(天)\n     0     1       7        13       19       24       31\n产生的AF(克)\n     0     18      116      195      264      500      668\n10.2.使用14C-淀粉产生14C-AF\n将不均匀标记的14C-淀粉(340μCi，从Sigma获得)真空干 燥以去掉其包含的乙醇，然后溶于2ml水中。经过加入20μl从真 菌感染的藻类纯化的裂解酶和20μl支链淀粉酶(MegaZyme Ltd.) 起动反应。反应在30℃下进行过夜。在反应中止时，使用截留分子量 为10,000的滤膜过滤反应混合物以去掉酶和未反应的淀粉分子。\n使用Waters HPLC在Ca2碳水化合物柱(Chrompack)上进行过 滤。使用水作洗脱液。流速为0.5ml/分。AF可有效地从葡萄糖和麦 芽糖中分离出来。合并的AF馏分冻干，获得总共140μCi 14C-AF。\n这些发现涉及本发明更进一步的方面，称为可增加反应介质(优 选醇类)疏水性的试剂在增强根据本发明的裂解酶的稳定性和活性中 的应用。这种增强的稳定性导致AF产率增加。\n对于本领域的技术人员而言，不偏离本发明的范围而对本发明进 行的其它修改将是显而易见的。\n本申请是1994年10月15日提交的，申请号为94194430.1，发明 名称为“α-1，4-葡聚糖裂解酶在制备1，5-D-脱水果糖中的应用”的发明 专利申请的分案申请。\n序列描述\n(1)一般资料：\n(i)申请人：\n(A)名称：DANISCO A/S\n(B)街道：Langebrogade 1\n(C)城市：哥本哈根\n(D)州：哥本哈根K\n(E)国家：丹麦\n(F)邮编(编码)：DK-1001\n(ii)发明题目：酶的应用\n(iii)序列数：39\n(iv)计算机可读形式：\n(A)媒体类型：Floppy盘\n(B)计算机：IBM PC兼容机\n(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS\n(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)\n(v)当前申请资料：\n申请号：WO PCT/EP94/03397\n(2)SEQ ID NO：1资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：1088个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：蛋白质\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：\nMet Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser\n1               5                   10                  15 \nThr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala\n            20                  25                  30\nPhe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val\n        35                  40                  45\nSer Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr\n    50                  55                  60\nAsp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val\n65                  70                  75                  80\nTrp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser\n                85                  90                  95\nSer Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn\n            100                 105                 110\nPhe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln\n        115                 120                 125\nVal Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn\n    130                 135                 140\nPro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln\n145                 150                 155                 160\nGln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp Pro\n                165                 170                 175\nGly Met Thr Phe Thr Ser Glu Gly Phe Leu Thr Phe Glu Thr Lys Asp\n            180                 185                 190\nLeu Ser Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg Lys\n        195                 200                 205\nSer Asp Gly Lys Val Ile Met Glu Asn Asp Glu Val Gly Thr Ala Ser\n    210                 215                 220\nSer Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr Gly\n225                 230                 235                 240\nAsn Ala Ile Ala Ser Val Asn Lys Asn Phe Arg Asn Asp Ala Val Lys\n                245                 250                 255\nGln Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Lys Tyr Gln Asp\n            260                 265                 270\nThr Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr\n        275                 280                 285\nAsp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Leu Arg Pro Pro His His Asp\n    290                 295                 300\nGly Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr Tyr Ala Ala Pro\n305                 310                 315                 320\nTrp Leu Ile Val Asn Gly Cys Ala Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Tyr\n                325                 330                 335\nGly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met Asn Thr Gly Asp\n            340                 345                 350\nThr Thr Trp Asn Ser Gly Gln Glu Asp Leu Ala Tyr Met Gly Ala Gln\n        355                 360                 365\nTyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Ala Gly Gly Gly Met\n    370                 375                 380\nGlu Cys Val Val Thr Ala Phe Ser Leu Leu Gln Gly Lys Glu Phe Glu\n385                 390                 395                 400\nAsn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro Lys Tyr Val Phe\n                405                 410                 415\nGly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Thr Ser Ser Leu Leu Arg Ala His\n            420                 425                 430\nMet Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Glu Glu Ile Val Glu Gly\n        435                 440                 445\nTyr Gln Asn Asn Asn Phe Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val Asp Val Asp\n    450                 455                 460\nMet Gln Asp Asn Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Gly Glu Phe Trp Thr\n465                 470                 475                 480\nAla Asn Arg Val Gly Thr Gly Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ser Val Phe\n                485                 490                 495\nGlu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn Ile Thr Cys\n            500                 505                 510\nPhe Leu Arg Asn Asp Asn Glu Gly Gln Asp Tyr Glu Val Asn Gln Thr\n        515                 520                 525\nLeu Arg Glu Arg Gln Leu Tyr Thr Lys Asn Asp Ser Leu Thr Gly Thr\n    530                 535                 540\nAsp Phe Gly Met Thr Asp Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly His\n545                 550                 555                 560\nLeu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp Trp\n                565                 570                 575\nGly Arg Pro Asp Val Ala Glu Trp Trp Gly Asn Asn Tyr Lys Lys Leu\n            580                 585                 590\nPhe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met Thr Val Pro Ala\n        595                 600                 605\nMet Met Pro His Lys Ile Gly Asp Asp Ile Asn Val Lys Pro Asp Gly\n    610                 615                 620\nAsn Trp Pro Asn Ala Asp Asp Pro Ser Asn Gly Gln Tyr Asn Trp Lys\n625                 630                 635                 640\nThr Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp Met Arg Tyr Glu Asn His\n                645                 650                 655\nGly Arg Glu Pro Met Val Thr Gln Arg Asn Ile His Ala Tyr Thr Leu\n            660                 665                 670\nCys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val Glu Asn Ala Asp Thr Leu\n        675                 680                 685\nThr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Gly\n    690                 695                 700\nAsn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly Asp Asn Ser Thr Thr Ser\n705                 710                 715                 720\nAsn Tyr Ile Gln Met Met Ile Ala Asn Asn Ile Asn Met Asn Met Ser\n                725                 730                 735\nCys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Asp\n            740                 745                 750\nAsn Glu Asn Gln Arg Thr Pro Cys Thr Gly Asp Leu Met Val Arg Tyr\n        755                 760                 765\nVal Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His Tyr Asp Arg\n    770                 775                 780\nTrp Ile Glu Ser Lys Asp His Gly Lys Asp Tyr Gln Glu Leu Tyr Met\n785                 790                 795                 800\nTyr Pro Asn Glu Met Asp Thr Leu Arg Lys Phe Val Glu Phe Arg Tyr\n                805                 810                 815\nArg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe\n            820                 825                 830\nGly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn\n        835                 840                 845\nVal Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly\n    850                 855                 860\nTyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg\n865                 870                 875                 880\nGlu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro Asp\n                885                 890                 895\nPhe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala Net Asn Gly Gly Asp Arg Ile\n            900                 905                 910\nTyr Asn Tyr Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Pro Ile Phe Val Arg Glu\n        915                 920                 925\nGly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asn Gly Glu Asn Lys Ser\n    930                 935                 940\nLeu Asn Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro\n945                 950                 955                 960\nLeu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp Asp Gly Gly\n                965                 970                 975\nVal Thr Thr Asn Ala Glu Asp Asn Gly Lys Phe Ser Val Val Lys Val\n            980                 985                 990\nAla Ala Glu Gln Asp Gly Gly Thr Glu Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asp\n        995                 1000                1005\nCys Tyr Glu Tyr Val Phe Gly Gly Pro Phe Tyr Val Arg Val Arg Gly\n    1010                1015                1020\nAla Gln Ser Pro Ser Asn Ile His Val Ser Ser Gly Ala Gly Ser Gln\n1025                1030                1035                1040\nAsp Met Lys Val Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ala Leu Phe Asn Asp\n                1045                1050                1055\nGly Glu Asn Gly Asp Phe Trp Val Asp Gln Glu Thr Asp Ser Leu Trp\n            1060                1065                1070\nLeu Lys Leu Pro Asn Val Val Leu Pro Asp Ala Val Ile Thr Ile Thr\n        1075                1080                1085\n(2)SEQ ID NO：2资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：1091个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：蛋白质\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：\nMet Tyr Pro Thr Leu Thr Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Arg\n1               5                   10                  15\nThr Phe Thr Cys Val Gly Ile Phe Arg Ser His Ile Leu Ile His Ser\n            20                  25                  30\nVal Val Pro Ala Val Arg Leu Ala Val Arg Lys Ser Asn Arg Leu Asn\n        35                  40                  45\nVal Ser Met Ser Ala Leu Phe Asp Lys Pro Thr Ala Val Thr Gly Gly\n    50                  55                  60\nLys Asp Asn Pro Asp Asn Ile Asn Tyr Thr Thr Tyr Asp Tyr Val Pro\n65                  70                  75                  80\nVal Trp Arg Phe Asp Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly\n                85                  90                  95\nSer Ser Thr Pro Gly Asp Ile Asp Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val\n            100                 105                 110\nAsn Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Phe Thr Leu Glu Lys Pro Val\n        115                 120                 125\nGln Val Gln Val Thr Ser Tyr Lys Asn Asn Cys Phe Arg Val Arg Phe\n    130                 135                 140\nAsn Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Asp Arg Gly Pro Ile Leu Gln\n145                 150                 155                 160\nGln Gln Leu Asn Trp Ile Arg Lys Gln Glu Gln Ser Lys Gly Phe Asp\n                165                 170                 175\nPro Lys Met Gly Phe Thr Lys Glu Gly Phe Leu Lys Phe Glu Thr Lys\n            180                 185                 190\nAsp Leu Asn Val I1e Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg\n        195                 200                 205\nLys Arg Asp Gly Lys Gly Ile Met Glu Asn Asn Glu Val Pro Ala Gly\n    210                 215                 220\nSer Leu Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr\n225                 230                 235                 240\nGly Thr Ala Ile Ala Ser Val Asn Glu Asn Tyr Arg Asn Asp Pro Asp\n                245                 250                 255\nArg Lys Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Glu Phe Trp\n            260                 265                 270\nAsp Ser Glu Gln Asn Arg Asn Lys Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile\n        275                 280                 285\nAla Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp\n    290                 295                 300\nLeu Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr Ile Pro Met\n305                 310                 315                 320\nTyr Phe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser\n                325                 330                 335\nAsp Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr\n            340                 345                 350\nTyr Met Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu\n        353                 360                 365\nAla Tyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr\n    370                 375                 380\nGly Asp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu\n385                 390                 395                 400\nGln Gly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met\n                405                 410                 415\nPro Pro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala\n            420                 425                 430\nSer Leu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val\n        435                 440                 445\nGln Glu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly\n    450                 455                 460\nLeu Ala Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr\n465                 470                 475                 480\nLys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser\n                485                 490                 495\nAsn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys\n            500                 505                 510\nGln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp\n        515                 520                 525\nTyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn\n    530                 535                 540\nAsp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Ser\n545                 550                  555                560\nAsp Ala Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp\n                565                 570                 575\nAla Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly\n            580                 585                 590\nAsp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln\n        595                 600                 605\nAsp Met Thr Val Pro Ala Met Met Pro His Lys Val Gly Asp Ala Val\n    610                 615                 620\nAsp Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Trp Pro Asn Glu Asn Asp Pro Ser Asn\n625                 630                 635                 640\nGly Arg Tyr Asn Trp Lys Ser Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp\n                645                 650                 655\nMet Arg Tyr Glu Asn His Gly Arg Glu Pro Met Phe Thr Gln Arg Asn\n            660                 665                 670\nMet His Ala Tyr Thr Leu Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val\n        675                 680                 685\nAla Asn Ala Asp Thr Leu Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser\n    690                 695                 700\nArg Gly Gly Tyr Ile Gly Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly\n705                 710                 715                 720\nAsp Asn Ser Ser Ser Gln Arg Tyr Leu Gln Met Met Ile Ala Asn Ile\n                725                 730                 735\nVal Asn Met Asn Met Ser Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly\n            740                 745                 750\nGly Phe Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Val Cys Pro Gly Asp Leu Met\n        755                 760                 765\nVal Arg Phe Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His\n    770                 775                 780\nTyr Gly Arg Leu Val Glu Gly Lys Gln Glu Gly Lys Tyr Tyr Gln Glu\n785                 790                 795                 800\nLeu Tyr Met Tyr Lys Asp Glu Met Ala Thr Leu Arg Lys Phe Ile Glu\n                805                 810                 815\nPhe Arg Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn\n            820                 825                 830\nAla Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn\n        835                 840                 845\nAsp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly\n    850                 855                 860\nHis Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr\n865                 870                 875                 880\nThr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe\n                885                 890                 895\nGly Pro Asp Tyr Asp Thr Lys Arg Leu Asp Ser Ala Leu Asp Gly Gly\n            900                 905                 910\nGln Met Ile Lys Asn Tyr Ser Val Pro Gln Ser Asp Ser Pro Ile Phe\n        915                 920                 925\nVal Arg Glu Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Gly Ser\n    930                 935                 940\nAsn Lys Ser Met Asn Thr Tyr Thr Asp Lys Asp Pro Leu Val Phe Glu\n945                 950                 955                 960\nVal Phe Pro Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp\n                965                 970                 975\nAsp Gly Gly Ile Thr Thr Asp Ala Glu Asp His Gly Lys Phe Ser Val\n            980                 985                 990\nIle Asn Val Glu Ala Leu Arg Lys Gly Val Thr Thr Thr Ile Lys Phe\n        995                 1000                1005\nAla Tyr Asp Thr Tyr Gln Tyr Val Phe Asp Gly Pro Phe Tyr Val Arg\n    1010                1015                1020\nIle Arg Asn Leu Thr Thr Ala Ser Lys Ile Asn Val Ser Ser Gly Ala\n1025                1030                1035                1040\nGly Glu Glu Asp Met Thr Pro Thr Ser Ala Asn Ser Arg Ala Ala Leu\n                1045                1050                1055\nPhe Ser Asp Gly Gly Val Gly Glu Tyr Trp Ala Asp Asn Asp Thr Ser\n            1060                1065                1070\nSer Leu Trp Met Lys Leu Pro Asn Leu Val Leu Gln Asp Ala Val Ile\n        1075                1080                1085\nThr Ile Thr\n    1090\n(2)SEQ ID NO：3资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：3267个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：\nATGTTTTCAA CCCTTGCGTT TGTCGCACCT AGTGCGCTGG GAGCCAGTAC CTTCGTAGGG    60\nGCGGAGGTCA GGTCAAATGT TCGTATCCAT TCCGCTTTTC CAGCTGTGCA CACAGCTACT    120\nCGCAAAACCA ATCGCCTCAA TGTATCCATG ACCGCATTGT CCGACAAACA AACGGCTACT    180\nGCGGGTAGTA CAGACAATCC GGACGGTATC GACTACAAGA CCTACGATTA CGTCGGAGTA    240\nTGGGGTTTCA GCCCCCTCTC CAACACGAAC TGGTTTGCTG CCGGCTCTTC TACCCCGGGT    300\nGGCATCACTG ATTGGACGGC TACAATGAAT GTCAACTTCG ACCGTATCGA CAATCCGTCC    360\nATCACTGTCC AGCATCCCGT TCAGGTTCAG GTCACGTCAT ACAACAACAA CAGCTACAGG    420\nGTTCGCTTCA ACCCTGATGG CCCTATTCGT GATGTGACTC GTGGGCCTAT CCTCAAGCAG    480\nCAACTAGATT GGATTCGAAC GCAGGAGCTG TCAGAGGGAT GTGATCCCGG AATGACTTTC    540\nACATCAGAAG GTTTCTTGAC TTTTGAGACC AAGGATCTAA GCGTCATCAT CTACGGAAAT    600\nTTCAAGACCA GAGTTACGAG AAAGTCTGAC GGCAAGGTCA TCATGGAAAA TGATGAAGTT    660\nGGAACTGCAT CGTCCGGGAA CAAGTGCCGG GGATTGATGT TCGTTGATAG ATTATACGGT    720\nAACGCTATCG CTTCCGTCAA CAAGAACTTC CGCAACGACG CGGTCAAGCA GGAGGGATTC    780\nTATGGTGCAG GTGAAGTCAA CTGTAAGTAC CAGGACACCT ACATCTTAGA ACGCACTGGA    840     \nATCGCCATGA CAAATTACAA CTACGATAAC TTGAACTATA ACCAGTGGGA CCTTAGACCT    900\nCCGCATCATG ATGGTGCCCT CAACCCAGAC TATTATATTC CAATGTACTA CGCAGCACCT    960\nTGGTTGATCG TTAATGGATG CGCCGGTACT TCGGAGCAGT ACTCGTATGG ATGGTTCATG    1020\nGACAATGTCT CTCAATCTTA CATGAATACT GGAGATACTA CCTGGAATTC TGGACAAGAG    1080\nGACCTGGCAT ACATGGGCGC GCAGTATGGA CCATTTGACC AACATTTTGT TTACGGTGCT    1140\nGGGGGTGGGA TGGAATGTGT GGTCACAGCG TTCTCTCTTC TACAAGGCAA GGAGTTCGAG    1200\nAACCAAGTTC TCAACAAACG TTCAGTAATG CCTCCGAAAT ACGTCTTTGG TTTCTTCCAG    1260\nGGTGTTTTCG GGACTTCTTC CTTGTTGAGA GCGCATATGC CAGCAGGTGA GAACAACATC    1320\nTCAGTCGAAG AAATTGTAGA AGGTTATCAA AACAACAATT TCCCTTTCGA GGGGCTCGCT    1380\nGTGGACGTGG ATATGCAAGA CAACTTGCGG GTGTTCACCA CGAAGGGCGA ATTTTGGACC    1440\nGCAAACAGGG TGGGTACTGG CGGGGATCCA AACAACCGAT CGGTTTTTGA ATGGGCACAT    1500\nGACAAAGGCC TTGTTTGTCA GACAAATATA ACTTGCTTCC TGAGGAATGA TAACGAGGGG    1560\nCAAGACTACG AGGTCAATCA GACGTTAAGG GAGAGGCAGT TGTACACGAA GAACGACTCC    1620\nCTGACGGGTA CGGATTTTGG AATGACCGAC GACGGCCCCA GCGATGCGTA CATCGGTCAT    1680\nCTGGACTATG GGGGTGGAGT AGAATGTGAT GCACTTTTCC CAGACTGGGG ACGGCCTGAC    1740\nGTGGCCGAAT GGTGGGGAAA TAACTATAAG AAACTGTTCA GCATTGGTCT CGACTTCGTC    1800\nTGGCAAGACA TGACTGTTCC AGCAATGATG CCGCACAAAA TTGGCGATGA CATCAATGTG    1860\nAAACCGGATG GGAATTGGCC GAATGCGGAC GATCCGTCCA ATGGACAATA CAACTGGAAG    1920\nACGTACCATC CCCAAGTGCT TGTAACTGAT ATGCGTTATG AGAATCATGG TCGGGAACCG    1980\nATGGTCACTC AACGCAACAT TCATGCGTAT ACACTGTGCG AGTCTACTAG GAAGGAAGGG    2040\nATCGTGGAAA ACGCAGACAC TCTAACGAAG TTCCGCCGTA GCTACATTAT CAGTCGTGGT    2100 \nGGTTACATTG GTAACCAGCA TTTCGGGGGT ATGTGGGTGG GAGACAACTC TACTACATCA    2160\nAACTACATCC AAATGATGAT TGCCAACAAT ATTAACATGA ATATGTCTTG CTTGCCTCTC    2220\nGTCGGCTCCG ACATTGGAGG ATTCACCTCA TACGACAATG AGAATCAGCG AACGCCGTGT    2280\nACCGGGGACT TGATGGTGAG GTATGTGCAG GCGGGCTGCC TGTTGCCGTG GTTCAGGAAC    2340\nCACTATGATA GGTGGATCGA GTCCAAGGAC CACGGAAAGG ACTACCAGGA GCTGTACATG    2400\nTATCCGAATG AAATGGATAC GTTGAGGAAG TTCGTTGAAT TCCGTTATCG CTGGCAGGAA    2460\nGTGTTGTACA CGGCCATGTA CCAGAATGCG GCTTTCGGAA AGCCGATTAT CAAGGCTGCT    2520\nTCGATGTACA ATAACGACTC AAACGTTCGC AGGGCGCAGA ACGATCATTT CCTTCTTGGT    2580\nGGACATGATG GATATCGCAT TCTGTGCGCG CCTGTTGTGT GGGAGAATTC GACCGAACGC    2640\nGAATTGTACT TGCCCGTGCT GACCCAATGG TACAAATTCG GTCCCGACTT TGACACCAAG    2700\nCCTCTGGAAG GAGCGATGAA CGGAGGGGAC CGAATTTACA ACTACCCTGT ACCGCAAAGT    2760\nGAATCACCAA TCTTCGTGAG AGAAGGTGCG ATTCTCCCTA CCCGCTACAC GTTGAACGGT    2820\nGAAAACAAAT CATTGAACAC GTACACGGAC GAAGATCCGT TGGTGTTTGA AGTATTCCCC    2880\nCTCGGAAACA ACCGTGCCGA CGGTATGTGT TATCTTGATG ATGGCGGTGT GACCACCAAT    2940\nGCTGAAGACA ATGGCAAGTT CTCTGTCGTC AAGGTGGCAG CGGAGCAGGA TGGTGGTACG    3000\nGAGACGATAA CGTTTACGAA TGATTGCTAT GAGTACGTTT TCGGTGGACC GTTCTACGTT    3060\nCGAGTGCGCG GCGCTCAGTC GCCGTCGAAC ATCCACGTGT CTTCTGGAGC GGGTTCTCAG    3120\nGACATGAAGG TGAGCTCTGC CACTTCCAGG GCTGCGCTGT TCAATGACGG GGAGAACGGT    3180\nGATTTCTGGG TTGACCAGGA GACAGATTCT CTGTGGCTGA AGTTGCCCAA CGTTGTTCTC    3240\nCCGGACGCTG TGATCACAAT TACCTAA                                        3267\n(2)SEQ ID NO：4资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：3276个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：\nATGTATCCAA CCCTCACCTT CGTGGCGCCT AGTGCGCTAG GGGCCAGAAC TTTCACGTGT    60\nGTGGGCATTT TTAGGTCACA CATTCTTATT CATTCGGTTG TTCCAGCGGT GCGTCTAGCT    120\nGTGCGCAAAA GCAACCGCCT CAATGTATCC ATGTCCGCTT TGTTCGACAA ACCGACTGCT    180\nGTTACTGGAG GGAAGGACAA CCCGGACAAT ATCAATTACA CCACTTATGA CTACGTCCCT    240\nGTGTGGCGCT TCGACCCCCT CAGCAATACG AACTGGTTTG CTGCCGGATC TTCCACTCCC    300\nGGCGATATTG ACGACTGGAC GGCGACAATG AATGTGAACT TCGACCGTAT CGACAATCCA    360\nTCCTTCACTC TCGAGAAACC GGTTCAGGTT CAGGTCACGT CATACAAGAA CAATTGTTTC    420\nAGGGTTCGCT TCAACCCTGA TGGTCCTATT CGCGATGTGG ATCGTGGGCC TATCCTCCAG    480\nCAGCAACTAA ATTGGATCCG GAAGCAGGAG CAGTCGAAGG GGTTTGATCC TAAGATGGGC    540\nTTCACAAAAG AAGGTTTCTT GAAATTTGAG ACCAAGGATC TGAACGTTAT CATATATGGC    600\nAATTTTAAGA CTAGAGTTAC GAGGAAGAGG GATGGAAAAG GGATCATGGA GAATAATGAA    660\nGTGCCGGCAG GATCGTTAGG GAACAAGTGC CGGGGATTGA TGTTTGTCGA CAGGTTGTAC    720\nGGCACTGCCA TCGCTTCCGT TAATGAAAAT TACCGCAACG ATCCCGACAG GAAAGAGGGG    780\nTTCTATGGTG CAGGAGAAGT AAACTGCGAG TTTTGGGACT CCGAACAAAA CAGGAACAAG    840\nTACATCTTAG AACGAACTGG AATCGCCATG ACAAATTACA ATTATGACAA CTATAACTAC    900\nAACCAGTCAG ATCTTATTGC TCCAGGATAT CCTTCCGACC CGAACTTCTA CATTCCCATG    960\nTATTTTGCAG CACCTTGGGT AGTTGTTAAG GGATGCAGTG GCAACAGCGA TGAACAGTAC    1020\nTCGTACGGAT GGTTTATGGA TAATGTCTCC CAAACTTACA TGAATACTGG TGGTACTTCC    1080\nTGGAACTGTG GAGAGGAGAA CTTGGCATAC ATGGGAGCAC AGTGCGGTCC ATTTGACCAA    1140\nCATTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGTCTT GAGGATGTTG TCCAAGCGTT CTCTCTTCTG    1200\nCAAGGCAAAG AGTTTGAGAA CCAAGTTCTG AACAAACGTG CCGTAATGCC TCCGAAATAT    1260\nGTGTTTGGTT ACTTTCAGGG AGTCTTTGGG ATTGCTTCCT TGTTGAGAGA GCAAAGACCA    1320\nGAGGGTGGTA ATAACATCTC TGTTCAAGAG ATTGTCGAAG GTTACCAAAG CAATAACTTC    1380\nCCTTTAGACG GGTTAGCCGT AGATGTGGAT ATGCAACAAG ATTTGCGCGT GTTCACCACG    1440\nAAGATTGAAT TTTGGACGGC AAATAAGGTA GGCACCGGGG GAGACTCGAA TAACAAGTCG    1500\nGTGTTTGAAT GGGCACATGA CAAAGGCCTT GTATGTCAGA CGAATGTTAC TTGCTTCTTG    1560\nAGAAACGACA ACGGCGGGGC AGATTACGAA GTCAATCAGA CATTGAGGGA GAAGGGTTTG    1620\nTACACGAAGA ATGACTCACT GACGAACACT AACTTCGGAA CTACCAACGA CGGGCCGAGC    1680\nGATGCGTACA TTGGACATCT GGACTATGGT GGCGGAGGGA ATTGTGATGC ACTTTTCCCA    1740\nGACTGGGGTC GACCGGGTGT GGCTGAATGG TGGGGTGATA ACTACAGCAA GCTCTTCAAA    1800\nATTGGTCTGG ATTTCGTCTG GCAAGACATG ACAGTTCCAG CTATGATGCC ACACAAAGTT    1860\nGGCGACGCAG TCGATACGAG ATCACCTTAC GGCTGGCCGA ATGAGAATGA TCCTTCGAAC    1920\nGGACGATACA ATTGGAAATC TTACCATCCA CAAGTTCTCG TAACTGATAT GCGATATGAG    1980\nAATCATGGAA GGGAACCGAT GTTCACTCAA CGCAATATGC ATGCGTACAC ACTCTGTGAA    2040\nTCTACGAGGA AGGAAGGGAT TGTTGCAAAT GCAGACACTC TAACGAAGTT CCGCCGCAGT    2100\nTATATTATCA GTCGTGGAGG TTACATTGGC AACCAGCATT TTGGAGGAAT GTGGGTTGGA    2160\nGACAACTCTT CCTCCCAAAG ATACCTCCAA ATGATGATCG CGAACATCGT CAACATGAAC    2220\nATGTCTTGCC TTCCACTAGT TGGGTCCGAC ATTGGAGGTT TTACTTCGTA TGATGGACGA    2280\nAACGTGTGTC CCGGGGATCT AATGGTAAGA TTCGTGCAGG CGGGTTGCTT ACTACCGTGG    2340\nTTCAGAAACC ACTATGGTAG GTTGGTCGAG GGCAAGCAAG AGGGAAAATA CTATCAAGAA    2400\nCTGTACATGT ACAAGGACGA GATGGCTACA TTGAGAAAAT TCATTGAATT CCGTTACCGC    2460\nTGGCAGGAGG TGTTGTACAC TGCTATGTAC CAGAATGCGG CTTTCGGGAA ACCGATTATC    2520\nAAGGCAGCTT CCATGTACGA CAACGACAGA AACGTTCGCG GCGCACAGGA TGACCACTTC    2580\nCTTCTCGGCG GACACGATGG ATATCGTATT TTGTGTGCAC CTGTTGTGTG GGAGAATACA    2640\nACCAGTCGCG ATCTGTACTT GCCTGTGCTG ACCAAATGGT ACAAATTCGG CCCTGACTAT    2700\nGACACCAAGC GCCTGGATTC TGCGTTGGAT GGAGGGCAGA TGATTAAGAA CTATTCTGTG    2760\nCCACAAAGCG ACTCTCCGAT ATTTGTGAGG GAAGGAGCTA TTCTCCCTAC CCGCTACACG    2820\nTTGGACGGTT CGAACAAGTC AATGAACACG TACACAGACA AAGACCCGTT GGTGTTTGAG    2880\nGTATTCCCTC TTGGAAACAA CCGTGCCGAC GGTATGTGTT ATCTTGATGA TGGCGGTATT    2940\nACTACAGATG CTGAGGACCA TGGCAAATTC TCTGTTATCA ATGTCGAAGC CTTACGGAAA    3000\nGGTGTTACGA CGACGATCAA GTTTGCGTAT GACACTTATC AATACGTATT TGATGGTCCA    3060\nTTCTACGTTC GAATCCGTAA TCTTACGACT GCATCAAAAA TTAACGTGTC TTCTGGAGCG    3120\nGGTGAAGAGG ACATGACACC GACCTCTGCG AACTCGAGGG CAGCTTTGTT CAGTGATGGA    3180\nGGTGTTGGAG AATACTGGGC TGACAATGAT ACGTCTTCTC TGTGGATGAA GTTGCCAAAC    3240\nCTGGTTCTGC AAGACGCTGT GATTACCATT ACGTAG                              3276\n(2)SEQ ID N0：5资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：1066个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：蛋白质\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：\nMet Ala Gly Phe Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr\n1               5                   10                  15\nTyr Ser Val Ala Leu Asp Trp Lys Gly Pro Gln Lys Ile Ile Gly Val\n            20                  25                  30\nAsp Thr Thr Pro Pro Lys Ser Thr Lys Phe Pro Lys Asn Trp His Gly\n        35                  40                  45\nVal Asn Leu Arg Phe Asp Asp Gly Thr Leu Gly Val Val Gln Phe Ile\n    50                  55                  60\nArg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Gly Phe Lys Thr Ser\n65                  70                  75                  80\nAsp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met\n                85                  90                  95\nSer Thr Leu Ser Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Arg Gly Leu Thr Trp Glu\n            100                 105                 110\nThr Lys Cys Glu Asp Ser Gly Asp Phe Phe Thr Phe Ser Ser Lys Val\n        115                 120                 125\nThr Ala Val Glu Lys Ser Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly\n   130                  135                 140\nLeu Arg Ile His Leu Trp Lys Ser Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg\n145                 150                 155                 160\nThr Leu Thr Pro Leu Lys Asp Pro Tyr Pro Ile Pro Asn Val Ala Ala\n                165                 170                 175\nAla Glu Ala Arg Val Ser Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys\n            180                 185                 190\nThr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr\n        195                 200                 205\nVal Leu Asp Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly\n    210                 215                 220\nGlu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr\n225                 230                 235                 240\nPhe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala\n                245                 250                 255\nLeu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr Leu Asp\n            260                 265                 270\nVal Asn Ser Asn Pro Glu His Lys Asn Ile Thr Ala Thr Phe Ile Asp\n        275                 280                 285\nAsn Tyr Ser Gln Ile Ala Ile Asp Phe Gly Lys Thr Asn Ser Gly Tyr\n    290                 295                 300\nIle Lys Leu Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ile Asp Cys Tyr Gly Ile Ser\n305                 310                 315                 320\nAla Asp Thr Val Pro Glu Ile Val Arg Leu Tyr Thr Gly Leu Val Gly\n                325                 330                 335\nArg Ser Lys Leu Lys Pro Arg Tyr Ile Leu Gly Ala His Gln Ala Cys\n            340                 345                 350\nTyr Gly Tyr Gln Gln Glu Ser Asp Leu Tyr Ser Val Val Gln Gln Tyr\n        355                 360                 365\nArg Asp Cys Lys Phe Pro Leu Asp Gly Ile His Val Asp Val Asp Val\n    370                 375                 380\nGln Asp Gly Phe Arg Thr Phe Thr Thr Asn Pro His Thr Phe Pro Asn\n385                 390                 395                 400\nPro Lys Glu Met Phe Thr Asn Leu Arg Asn Asn Gly Ile Lys Cys Ser\n                405                 410                 415\nThr Asn Ile Thr Pro Val Ile Ser Ile Asn Asn Arg Glu Gly Gly Tyr\n            420                 425                 430\nSer Thr Leu Leu Glu Gly Val Asp Lys Lys Tyr Phe Ile Met Asp Asp\n        435                 440                 445\nArg Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asn Ala Lys Asp Val Arg Tyr Met\n    450                 455                 460\nTyr Tyr Gly Gly Gly Asn Lys Val Glu Val Asp Pro Asn Asp Val Asn\n465                 470                 475                 480\nGly Arg Pro Asp Phe Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Pro Ala Asn Phe Asn\n                485                 490                 495\nSer Lys Gln Tyr Pro Tyr His Gly Gly Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Asn\n            500                 505                 510\nGly Ser Ala Gly Phe Tyr Pro Asp Leu Asn Arg Lys Glu Val Arg Ile\n        515                 520                 525\nTrp Trp Gly Met Gln Tyr Lys Tyr Leu Phe Asp Met Gly Leu Glu Phe\n    530                 535                 540\nVal Trp Gln Asp Mer Thr Thr Pro Ala Ile His Thr Ser Tyr Gly Asp\n545                 550                 555                 560\nMet Lys Gly Leu Pro Thr Arg Leu Leu Val Thr Ser Asp Ser Val Thr\n                565                 570                 575\nAsn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Thr Trp Ala Leu Tyr Ser\n            580                 585                 590\nTyr Asn Leu His Lys Ala Thr Trp His Gly Leu Ser Arg Leu Glu Ser\n        595                 600                 605\nArg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly\n    610                 615                 620\nAla Tyr Arg Phe Ala Gly Leu Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ser Asn Trp\n625                 630                 635                 640\nGlu Phe Trp Lys Ile Ser Val Ser Gln Val Leu Ser Leu Gly Leu Asn\n                645                 650                 655\nGly Val Cys Ile Ala Gly Ser Asp Thr Gly Gly Phe Glu Pro Tyr Arg\n            660                 665                 670\nAsp Ala Asn Gly Val Glu Glu Lys Tyr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Ile\n        675                 680                 685\nArg Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr\n    690                 695                 700\nVal Lys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ser Tyr Pro Lys\n705                 710                 715                 720\nHis Leu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys\n                725                 730                 735\nSer Val Leu Glu Ile Cys Arg Tyr Tyr Val Glu Leu Arg Tyr Ser Leu\n            740                 745                 750\nIle Gln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met\n        755                 760                 765\nPro Ile Thr Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe\n    770                 775                 780\nPhe Asn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp\n785                 790                 795                 800\nAsp Ile Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Lys Glu Ile Pro Gly\n                805                 810                 815\nGlu Asn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Tyr His Thr Trp Tyr Pro Ser\n            820                 825                 830\nAsn Leu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Vai\n        835                 840                 845\nGlu Gly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu\n    850                 855                 860\nAsp Tyr Asn Leu Phe His Ser Val Val Pro Val Tyr Val Arg Glu Gly\n865                 870                 875                 880\nAla Ile Ile Pro Gln Ile Glu Val Arg Gln Trp Thr Gly Gln Gly Gly\n                885                 890                 895\nAla Asn Arg Ile Lys Phe Asn Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Lys Glu Tyr\n            900                 905                 910\nCys Thr Tyr Leu Asp Asp Gly Val Ser Arg Asp Ser Ala Pro Glu Asp\n        915                 920                 925\nLeu Pro Gln Tyr Lys Glu Thr His Glu Gln Ser Lys Val Glu Gly Ala\n    930                 935                 940\nGlu Ile Ala Lys Gln Ile Gly Lys Lys Thr Gly Tyr Asn Ile Ser Gly\n945                 950                 955                 960\nThr Asp Pro Glu Ala Lys Gly Tyr His Arg Lys Val Ala Val Thr Gln\n                965                 970                 975\nThr Ser Lys Asp Lys Thr Arg Thr Val Thr Ile Glu Pro Lys His Asn\n            980                 985                 990\nGly Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Val Gly Asp Tyr Tyr Thr Ile Ile Leu\n        995                 1000                1005\nTrp Tyr Ala Pro Gly Phe Asp Gly Ser Ile Val Asp Val Ser Lys Thr\n    1010                1015                1020\nThr Val Asn Val Glu Gly Gly Val Glu His Gln Val Tyr Lys Asn Ser\n1025                1030                1035                1040\nAsp Leu His Thr Val Val Ile Asp Val Lys Glu Val Ile Gly Thr Thr\n                1045                1050                1055\nLys Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Ala Ala\n            1060                1065\n(2)SEQ ID NO：6资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：1070个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：蛋白质\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：\nMet Ala Gly Leu Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr\n1               5                   10                  15\nTyr Ala Ala Ala Lys Gly Trp Ser Gly Pro Gln Lys Ile Ile Arg Tyr\n            20                  25                  30\nAsp Gln Thr Pro Pro Gln Gly Thr Lys Asp Pro Lys Ser Trp His Ala\n        35                  40                  45\nVal Asn Leu Pro Phe Asp Asp Gly Thr Met Cys Val Val Gln Phe Val\n    50                  55                  60\nArg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Ser Val Lys Thr Ser\n65                  70                  75                  80\nAsp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met\n                85                  90                  95\nThr Thr Leu Val Gly Asn Leu Asp Ile Phe Arg Gly Leu Thr Trp Val\n            100                 105                 110\nSer Thr Leu Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Tyr Thr Phe Lys Ser Glu Val\n        115                 120                 125 \nThr Ala Val Asp Glu Thr Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly\n    130                 135                 140\nLeu Lys Ile Tyr Leu Trp Lys Asn Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg\n145                 150                 155                 160\nLeu Leu Thr Pro Leu Val Asp Pro Phe Pro Ile Pro Asn Val Ala Asn\n                165                 170                 175\nAla Thr Ala Arg Val Ala Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys\n            180                 185                 190\nThr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr\n        195                 200                 205\nVal Leu Asp Ile Ile Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly\n    210                 215                 220\nGlu Met Gly Gly Ile Glu Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr\n225                 230                 235                 240\nPhe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala\n                245                 250                 255\nLeu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr Leu Asp\n            260                 265                 270\nVal Asn Ser Asn Pro Glu His Lys Asn Ile Thr Ala Thr Phe Ile Asp\n        275                 280                 285\nAsn Tyr Ser Gln Ile Ala Ile Asp Phe Gly Lys Thr Asn Ser Gly Tyr\n    290                 295                 300\nIle Lys Leu Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ile Asp Cys Tyr Gly Ile Ser\n305                 310                 315                 320\nAla Asp Thr Val Pro Glu Ile Val Arg Leu Tyr Thr Gly Leu Val Gly\n                325                 330                 335\nArg Ser Lys Leu Lys Pro Arg Tyr Ile Leu Gly Ala His Gln Ala Cys\n            340                 345                 350\nTyr Gly Tyr Gln Gln Glu Ser Asp Leu His Ala Val Val Gln Gln Tyr\n        355                 360                 365\nArg Asp Thr Lys Phe Pro Leu Asp Gly Leu His Val Asp Val Asp Phe\n    370                 375                 380\nGln Asp Asn Phe Arg Thr Phe Thr Thr Asn Pro Ile Thr Phe Pro Asn\n385                 390                 395                 400\nPro Lys Glu Met Phe Thr Asn Leu Arg Asn Asn Gly Ile Lys Cys Ser\n                405                 410                 415\nThr Asn Ile Thr Pro Val Ile Ser Ile Arg Asp Arg Pro Asn Gly Tyr\n            420                 425                 430\nSer Thr Leu Asn Glu Gly Tyr Asp Lys Lys Tyr Phe Ile Met Asp Asp\n        435                 440                 445\nArg Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asp Pro Gln Asn Val Arg Tyr Ser\n    450                 455                 460\nPhe Tyr Gly Gly Gly Asn Pro Val Glu Val Asn Pro Asn Asp Val Trp\n465                 470                 475                 480\nAla Arg Pro Asp Phe Gly Asp Asn Tyr Asp Phe Pro Thr Asn Phe Asn\n                485                 490                 495\nCys Lys Asp Tyr Pro Tyr His Gly Gly Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Asn\n            500                 505                 510\nGly Thr Pro Gly Tyr Tyr Pro Asp Leu Asn Arg Glu Glu Val Arg Ile\n        515                 520                 525\nTrp Trp Gly Leu Gln Tyr Glu Tyr Leu Phe Asn Met Gly Leu Glu Phe\n    530                 535                 540\nVal Trp Gln Asp Met Thr Thr Pro Ala Ile His Ser Ser Tyr Gly Asp\n545                 550                 555                 560\nMet Lys Gly Leu Pro Thr Arg Leu Leu Val Thr Ala Asp Ser Val Thr\n                565                 570                 575\nAsn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Ser Trp Ala Leu Tyr Ser\n            580                 585                 590\nTyr Asn Leu His Lys Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu Glu Ser\n        595                 600                 605\nArg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly\n    610                 615                 620\nAla Tyr Arg Phe Ala Gly Leu Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ser Thr Trp\n625                 630                 635                 640\nGlu Phe Trp Lys Ile Ser Val Ser Gln Val Leu Ser Leu Gly Leu Asn\n                645                 650                 655\nGly Val Cys Ile Ala Gly Ser Asp Thr Gly Gly Phe Glu Pro Ala Arg\n            660                 665                 670\nThr Glu Ile Gly Glu Glu Lys Tyr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Ile Arg\n        675                 680                 685\nTrp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr Val\n    690                 695                 700\nLys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ala Tyr Pro Lys His\n705                 710                 715                 720\nLeu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys Ser\n                725                 730                 735\nVal Leu Glu Ile Cys Arg Tyr Trp Val Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Ile\n            740                 745                 750\nGln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met Pro\n        755                 760                 765\nLeu Ala Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe Phe\n    770                 775                 780\nAsn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp Asp\n785                 790                 795                 800\nIle Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Asn Glu Val Pro Gly Glu\n                805                 810                 815\nAsn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Phe His Thr Trp Tyr Pro Ser Asn\n            820                 825                 830\nLeu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Val Glu\n        835                 840                 845\nGly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu Asp\n    850                 855                 860\nTyr Asn Leu Phe His Asn Val Val Pro Val Tyr Ile Arg Glu Gly Ala\n865                 870                 875                 880\nIle Ile Pro Gln Ile Gln Val Arg Gln Trp Ile Gly Glu Gly Gly Pro\n                885                 890                 895\nAsn Pro Ile Lys Phe Asn Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Lys Glu Tyr Val\n            900                 905                 910\nThr Tyr Leu Asp Asp Gly Val Ser Arg Asp Ser Ala Pro Asp Asp Leu\n        915                 920                 925\nPro Gln Tyr Arg Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Lys Val Glu Gly Lys Asp\n    930                 935                 940\nVal Gln Lys Gln Leu Ala Val Ile Gln Gly Asn Lys Thr Asn Asp Phe\n945                 950                 955                 960\nSer Ala Ser Gly Ile Asp Lys Glu Ala Lys Gly Tyr His Arg Lys Val\n                965                 970                 975\nSer Ile Lys Gln Glu Ser Lys Asp Lys Thr Arg Thr Val Thr Ile Glu\n            980                 985                 990\nPro Lys His Asn Gly Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Val Gly Asn Tyr Tyr\n        995                 1000                1005\nThr Ile Ile Leu Trp Tyr Ala Pro Gly Phe Asp Gly Ser Ile Val Asp\n    1010                1015                1020\nVal Ser Gln Ala Thr Val Asn Ile Glu Gly Gly Val Glu Cys Glu Ile\n1025                1030                1035                1040\nPhe Lys Asn Thr Gly Leu His Thr Val Val Val Asn Val Lys Glu Val\n                1045                1050                1055\nIle Gly Thr Thr Lys Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Thr Ala\n            1060                1065                1070\n(2)SEQ ID N0：7资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：3201个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：\nATGGCAGGAT TTTCTGATCC TCTCAACTTT TGCAAAGCAG AAGACTACTA CAGTGTTGCG    60\nCTAGACTGGA AGGGCCCTCA AAAAATCATT GGAGTAGACA CTACTCCTCC AAAGAGCACC    120\nAAGTTCCCCA AAAACTGGCA TGGAGTGAAC TTGAGATTCG ATGATGGGAC TTTAGGTGTG    180\nGTTCAGTTCA TTAGGCCGTG CGTTTGGAGG GTTAGATACG ACCCTGGTTT CAAGACCTCT    240\nGACGAGTATG GTGATGAGAA TACGAGGACA ATTGTGCAAG ATTATATGAG TACTCTGAGT    300\nAATAAATTGG ATACTTATAG AGGTCTTACG TGGGAAACCA AGTGTGAGGA TTCGGGAGAT    360\nTTCTTTACCT TCTCATCCAA GGTCACCGCC GTTGAAAAAT CCGAGCGGAC CCGCAACAAG    420\nGTCGGCGATG GCCTCAGAAT TCACCTATGG AAAAGCCCTT TCCGCATCCA AGTAGTGCGC    480\nACCTTGACCC CTTTGAAGGA TCCTTACCCC ATTCCAAATG TAGCCGCAGC CGAAGCCCGT    540\nGTGTCCGACA AGGTCGTTTG GCAAACGTCT CCCAAGACAT TCAGAAAGAA CCTGCATCCG    600\nCAACACAAGA TGCTAAAGGA TACAGTTCTT GACATTGTCA AACCTGGACA TGGCGAGTAT    660\nGTGGGGTGGG GAGAGATGGG AGGTATCCAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAACTAT    720\nTTTAACTTCG ACAATATGCA ATACCAGCAA GTCTATGCCC AAGGTGCTCT CGATTCTCGC    780\nGAGCCACTGT ACCACTCGGA TCCCTTCTAT CTTGATGTGA ACTCCAACCC GGAGCACAAG    840\nAATATCACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAAATTG CCATCGACTT TGGAAAGACC    900\nAACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGAACCAGG TATGGTGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGT    960\nGCGGATACGG TCCCGGAAAT TGTACGACTT TATACAGGTC TTGTTGGACG TTCAAAGTTG    1020\nAAGCCCAGAT ATATTCTCGG GGCCCATCAA GCCTGTTATG GATACCAACA GGAAAGTGAC    1080\nTTGTATTCTG TGGTCCAGCA GTACCGTGAC TGTAAATTTC CACTTGACGG GATTCACGTC    1140\nGATGTCGATG TTCAGGACGG CTTCAGAACT TTCACCACCA ACCCACACAC TTTCCCTAAC    1200\nCCCAAAGAGA TGTTTACTAA CTTGAGGAAT AATGGAATCA AGTGCTCCAC CAATATCACT    1260\nCCTGTTATCA GCATTAACAA CAGAGAGGGT GGATACAGTA CCCTCCTTGA GGGAGTTGAC    1320\nAAAAAATACT TTATCATGGA CGACAGATAT ACCGAGGGAA CAAGTGGGAA TGCGAAGGAT    1380\nGTTCGGTACA TGTACTACGG TGGTGGTAAT AAGGTTGAGG TCGATCCTAA TGATGTTAAT    1440\nGGTCGGCCAG ACTTTAAAGA CAACTATGAC TTCCCCGCGA ACTTCAACAG CAAACAATAC    1500\nCCCTATCATG GTGGTGTGAG CTACGGTTAT GGGAACGGTA GTGCAGGTTT TTACCCGGAC    1560\nCTCAACAGAA AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGAATGCAGT ACAAGTATCT CTTCGATATG    1620\nGGACTGGAAT TTGTGTGGCA AGACATGACT ACCCCAGCAA TCCACACATC ATATGGAGAC    1680\nATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTACTCGTC ACCTCAGACT CCGTCACCAA TGCCTCTGAG    1740\nAAAAAGCTCG CAATTGAAAC TTGGGCTCTC TACTCCTACA ATCTCCACAA AGCAACTTGG    1800\nCATGGTCTTA GTCGTCTCGA ATCTCGTAAG AACAAACGAA ACTTCATCCT CGGGCGTGGA    1860\nAGTTATGCCG GAGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GGGATAATGC AAGTAACTGG   1920\nGAATTCTGGA AGATATCGGT CTCTCAAGTT CTTTCTCTGG GCCTCAATGG TGTGTGCATC    1980\nGCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAACCC TACCGTGATG CAAATGGGGT CGAGGAGAAA    2040\nTACTGTAGCC CAGAGCTACT CATCAGGTGG TATACTGGTT CATTCCTCTT GCCGTGGCTC    2100\nAGGAACCATT ATGTCAAAAA GGACAGGAAA TGGTTCCAGG AACCATACTC GTACCCCAAG    2160\nCATCTTGAAA CCCATCCAGA ACTCGCAGAC CAAGCATGGC TCTATAAATC CGTTTTGGAG    2220\nATCTGTAGGT ACTATGTGGA GCTTAGATAC TCCCTCATCC AACTACTTTA CGACTGCATG    2280\nTTTCAAAACG TAGTCGACGG TATGCCAATC ACCAGATCTA TGCTCTTGAC CGATACTGAG    2340\nGATACCACCT TCTTCAACGA GAGCCAAAAG TTCCTCGACA ACCAATATAT GGCTGGTGAC    2400\nGACATTCTTG TTGCACCCAT CCTCCACAGT CGCAAAGAAA TTCCAGGCGA AAACAGAGAT    2460\nGTCTATCTCC CTCTTTACCA CACCTGGTAC CCCTCAAATT TGAGACCATG GGACGATCAA    2520\nGGAGTCGCTT TGGGGAATCC TGTCGAAGGT GGTAGTGTCA TCAATTATAC TGCTAGGATT    2580\nGTTGCACCCG AGGATTATAA TCTCTTCCAC AGCGTGGTAC CAGTCTACGT TAGAGAGGGT    2640\nGCCATCATCC CGCAAATCGA AGTACGCCAA TGGACTGGCC AGGGGGGAGC CAACCGCATC    2700\nAAGTTCAACA TCTACCCTGG AAAGGATAAG GAGTACTGTA CCTATCTTGA TGATGGTGTT    2760\nAGCCGTGATA GTGCGCCGGA AGACCTCCCA CAGTACAAAG AGACCCACGA ACAGTCGAAG    2820\nGTTGAAGGCG CGGAAATCGC AAAGCAGATT GGAAAGAAGA CGGGTTACAA CATCTCAGGA    2880\nACCGACCCAG AAGCAAAGGG TTATCACCGC AAAGTTGCTG TCACACAAAC GTCAAAAGAC    2940\nAAGACGCGTA CTGTCACTAT TGAGCCAAAA CACAATGGAT ACGACCCTTC CAAAGAGGTG    3000\nGGTGATTATT ATACCATCAT TCTTTGGTAC GCACCAGGTT TCGATGGCAG CATCGTCGAT    3060\nGTGAGCAAGA CGACTGTGAA TGTTGAGGGT GGGGTGGAGC ACCAAGTTTA TAAGAACTCC    3120\nGATTTACATA CGGTTGTTAT CGACGTGAAG GAGGTGATCG GTACCACAAA GAGCGTCAAG    3180\nATCACATGTA CTGCCGCTTA A                                              3201\n(2)SEQ ID NO：8资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：3213个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：\nATGGCAGGAT TATCCGACCC TCTCAATTTC TGCAAAGCAG AGGACTACTA CGCTGCTGCC    60\nAAAGGCTGGA GTGGCCCTCA GAAGATCATT CGCTATGACC AGACCCCTCC TCAGGGTACA    120\nAAAGATCCGA AAAGCTGGCA TGCGGTAAAC CTTCCTTTCG ATGACGGGAC TATGTGTGTA    180\nGTGCAATTCG TCAGACCCTG TGTTTGGAGG GTTAGATATG ACCCCAGTGT CAAGACTTCT    240\nGATGAGTACG GCGATGAGAA TACGAGGACT ATTGTACAAG ACTACATGAC TACTCTGGTT    300\nGGAAACTTGG ACATTTTCAG AGGTCTTACG TGGGTTTCTA CGTTGGAGGA TTCGGGCGAG    360\nTACTACACCT TCAAGTCCGA AGTCACTGCC GTGGACGAAA CCGAACGGAC TCGAAACAAG    420\nGTCGGCGACG GCCTCAAGAT TTACCTATGG AAAAATCCCT TTCGCATCCA GGTAGTGCGT    480\nCTCTTGACCC CCCTGGTGGA CCCTTTCCCC ATTCCCAACG TAGCCAATGC CACAGCCCGT    540\nGTGGCCGACA AGGTTGTTTG GCAGACGTCC CCGAAGACGT TCAGGAAAAA CTTGCATCCG    600\nCAGCATAAGA TGTTGAAGGA TACAGTTCTT GATATTATCA AGCCGGGGCA CGGAGAGTAT    660\nGTGGGTTGGG GAGAGATGGG AGGCATCGAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAATTAT    720\nTTCAACTTTG ACAATATGCA ATATCAGCAG GTCTATGCAC AAGGCGCTCT TGATAGTCGT    780\nGAGCCGTTGT ATCACTCTGA TCCCTTCTAT CTCGACGTGA ACTCCAACCC AGAGCACAAG    84O\nAACATTACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAGATTG CCATCGACTT TGGGAAGACC    900\nAACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGTACCAGG TATGGCGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGC    960\nGCGGATACGG TCCCGGAGAT TGTGCGACTT TATACTGGAC TTGTTGGGCG TTCGAAGTTG    1020\nAAGCCCAGGT ATATTCTCGG AGCCCACCAA GCTTGTTATG GATACCAGCA GGAAAGTGAC    1080   \nTTGCATGCTG TTGTTCAGCA GTACCGTGAC ACCAAGTTTC CGCTTGATGG GTTGCATGTC    1140\nGATGTCGACT TTCAGGACAA TTTCAGAACG TTTACCACTA ACCCGATTAC GTTCCCTAAT    1200\nCCCAAAGAAA TGTTTACCAA TCTAAGGAAC AATGGAATCA AGTGTTCCAC CAACATCACC    1260\nCCTGTTATCA GTATCAGAGA TCGCCCGAAT GGGTACAGTA CCCTCAATGA GGGATATGAT    1320\nAAAAAGTACT TCATCATGGA TGACAGATAT ACCGAGGGGA CAAGTGGGGA CCCGCAAAAT    1380\nGTTCGATACT CTTTTTACGG CGGTGGGAAC CCGGTTGAGG TTAACCCTAA TGATGTTTGG    1440\nGCTCGGCCAG ACTTTGGAGA CAATTATGAC TTCCCTACGA ACTTCAACTG CAAAGACTAC    1500\nCCCTATCATG GTGGTGTGAG TTACGGATAT GGGAATGGCA CTCCAGGTTA CTACCCTGAC    1560\nCTTAACAGAG AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGATTGCAGT ACGAGTATCT CTTCAATATG    1620\nGGACTAGAGT TTGTATGGCA AGATATGACA ACCCCAGCGA TCCATTCATC ATATGGAGAC    1680\nATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTGCTCGTC ACCGCCGACT CAGTTACCAA TGCCTCTGAG    1740\nAAAAAGCTCG CAATTGAAAG TTGGGCTCTT TACTCCTACA ACCTCCATAA AGCAACCTTC    1800\nCACGGTCTTG GTCGTCTTGA GTCTCGTAAG AACAAACGTA ACTTCATCCT CGGACGTGGT    1860\nAGTTACGCCG GTGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GAGATAACGC AAGTACGTGG    1920\nGAATTCTGGA AGATTTCGGT CTCCCAAGTT CTTTCTCTAG GTCTCAATGG TGTGTGTATA    1980\nGCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAGCCC GCACGTACTG AGATTGGGGA GGAGAAATAT    2040\nTGCAGTCCGG AGCTACTCAT CAGGTGGTAT ACTGGATCAT TCCTTTTGCC ATGGCTTAGA    2100\nAACCACTACG TCAAGAAGGA CAGGAAATGG TTCCAGGAAC CATACGCGTA CCCCAAGCAT    2160\nCTTGAAACCC ATCCAGAGCT CGCAGATCAA GCATGGCTTT ACAAATCTGT TCTAGAAATT    2220\nTGCAGATACT GGGTAGAGCT AAGATATTCC CTCATCCAGC TCCTTTACGA CTGCATGTTC    2280\nCAAAACGTGG TCGATGGTAT GCCACTTGCC AGATCTATGC TCTTGACCGA TACTGAGGAT    2340\nACGACCTTCT TCAATGAGAG CCAAAAGTTC CTCGATAACC AATATATGGC TGGTGACGAC    2400\nATCCTTGTAG CACCCATCCT CCACAGCCGT AACGAGGTTC CGGGAGAGAA CAGAGATGTC    2460\nTATCTCCCTC TATTCCACAC CTGGTACCCC TCAAACTTGA GACCGTGGGA CGATCAGGGA    2520\nGTCGCTTTAG GGAATCCTGT CGAAGGTGGC AGCGTTATCA ACTACACTGC CAGGATTGTT    2580\nGCCCCAGAGG ATTATAATCT CTTCCACAAC GTGGTGCCGG TCTACATCAG AGAGGGTGCC    2640\nATCATTCCGC AAATTCAGGT ACGCCAGTGG ATTGGCGAAG GAGGGCCTAA TCCCATCAAG    2700\nTTCAATATCT ACCCTGGAAA GGACAAGGAG TATGTGACGT ACCTTGATGA TGGTGTTAGC    2760\nCGCGATAGTG CACCAGATGA CCTCCCGCAG TACCGCGAGG CCTATGAGCA AGCGAAGGTC    2820\nGAAGGCAAAG ACGTCCAGAA GCAACTTGCG GTCATTCAAG GGAATAAGAC TAATGACTTC    2880\nTCCGCCTCCG GGATTGATAA GGAGGCAAAG GGTTATCACC GCAAAGTTTC TATCAAACAG    2940\nGAGTCAAAAG ACAAGACCCG TACTGTCACC ATTGAGCCAA AACACAACGG ATACGACCCC    3000\nTCTAAGGAAG TTGGTAATTA TTATACCATC ATTCTTTGGT ACGCACCGGG CTTTGACGGC    3060\nAGCATCGTCG ATGTGAGCCA GGCGACCGTG AACATCGAGG GCGGGGTGGA ATGCGAAATT    3120\nTTCAAGAACA CCGGCTTGCA TACGGTTGTA GTCAACGTGA AAGAGGTGAT CGGTACCACA    3180\nAAGTCCGTCA AGATCACTTG CACTACCGCT TAG                                 3213\n(2)SEQ ID NO：9资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：317个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(ix)特征：\n(A)名称/键：修饰位点\n(B)位置：201\n(D)其它资料：/注＝“X指misc氨基酸”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：\nMet Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Leu\n1               5                   10                  15\nIle Pro Pro Gly His Asp Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr\n            20                  25                  30\nPhe Ala Ala Pro Trp Val Ile Ala His Gly Tyr Arg Gly Thr Ser Asp\n        35                  40                  45\nGln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Leu Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Thr\n    50                  55                  60\nAsn Thr Gly Asp Asp Ala Trp Ala Gly Gln Lys Asp Leu Ala Tyr Met\n65                  70                  75                  80\nGly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Glu Ala Gly\n                85                  90                  95\nAsp Gly Leu Glu Asp Val Val Thr Ala Phe Ser Tyr Leu Gln Gly Lys\n            100                 105                 110\nGlu Tyr Glu Asn Gln Gly Leu Asn Ile Arg Ser Ala Met Pro Pro Lys\n        115                 120                 125\nTyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Thr Ser Leu Leu\n    130                 135                 140\nArg Asp Ash Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Val Ser Leu Glu Glu Ile\n145                 150                 155                 160\nVal Glu Gly Tyr Gln Asn Gln Asn Val Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val\n                165                 170                 175\nAsp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr Arg Pro Ala\n            180                 185                 190\nPhe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Xaa Gly Gly Asp Pro Asn Asn Lys\n        195                 200                 205\nSer Val Phe Glu Trp Ala His Asp Arg Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn\n    210                 215                 220\nVal Thr Cys Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Pro Tyr Glu Val Asn Gln\n225                 230                 235                 240\nSer Leu Arg Glu Lys Gln Leu Tyr Thr Lys Ser Asp Ser Leu Asp Asn\n                245                 250                 255\nIle Asp Phe Gly Thr Thr Pro Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly\n            260                 265                 270\nHis Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp\n        275                 280                 285\nTrp Gly Arg Pro Asp Val Ala Gln Trp Trp Gly Asp Ash Tyr Lys Lys\n    290                 295                 300\nLeu Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met\n305                 310                 315\n(2)SEQ ID NO：10资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：323个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(ix)特征：\n(A)名称/键：修饰的位点\n(B)位置：272\n(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：修饰的位点\n(B)位置：273\n(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：修饰的位点\n(B)位置：274\n(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：\nMet Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp Leu\n1               5                   10                  15\nIle Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr Ile Pro Met Tyr\n            20                  25                  30\nPhe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser Asp\n        35                  40                  45\nGlu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr Tyr\n    50                  55                  60\nMet Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu Ala\n65                  70                  75                  80\nTyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly\n                85                  90                  95\nAsp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu Gln\n            100                 105                 110\nGly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met Pro\n        115                 120                 125\nPro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala Ser\n    130                 135                 140\nLeu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val Ser\n145                 150                 155                 160\nGlu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly Leu\n                165                 170                 175\nAla Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Cys Ser Ser Pro Leu\n            180                 185                 190\nLys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser\n        195                 200                 205\nAsn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys\n    210                 215                 220\nGln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp\n225                 230                 225                 240\nTyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn\n                245                 250                 255\nAsp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Xaa\n            260                 265                 270\nXaa Xaa Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp\n        275                 280                 285\nAla Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly\n    290                 295                 300\nAsp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln\n305                 310                 315                 320\nAsp Met Thr\n(2)SEQ ID NO：11资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：202个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(ix)特征：\n(A)名称/键：修饰位点\n(B)位置：43\n(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：修饰位点\n(B)位置：176\n(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：\nMet Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Val\n1               5                   10                  15\nVal Pro Pro Gly Tyr His Asp His Pro Asn Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr\n            20                  25                  30\nTyr Ala Ala Pro Trp Leu Val Val Gln Gly Xaa Ala Gly Thr Ser Lys\n        35                  40                  45\nGln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met\n    50                  55                  60\nAsn Thr Gly Asp Thr Ala Trp Asn Cys Gly Gln Glu Asn Leu Ala Tyr\n65                  70                  75                  80\nMet Gly Ala Gln Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Asp\n                85                  90                  95\nGly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Lys Ala Phe Ser Phe Leu Gln Gly\n            100                 105                 110\nLys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro\n        115                 120                 125\nLys Tyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu\n    130                 135                 140\nLeu Lys Gln Asn Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Gln Glu\n145                 150                 155                 160\nIle Val Glu Gly Tyr Gln Asp Asn Asp Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Xaa\n                165                 170                 175\nVal Asp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu ArG Val Phe Thr Thr Lys Pro\n            180                 185                 190\nGlu Tyr Trp Ser Ala Asn Met Val Gly Glu\n        195                 200\n(2)SEQ ID NO：12资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：953个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(573，″″)\n(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(601，″″)\n(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：\nATGACAAACT ATAATTATGA CAATTTGAAC TACAATCAAC CGGACCTCAT CCCACCTGGC    60\nCATGATTCAG ATCCTGACTA CTATATTCCG ATGTACTTTG CGGCACCATG GGTGATCGCA    120\nCATGGATATC GTGGCACCAG CGACCAGTAC TCTTATGGAT GGTTTTTGGA CAATGTATCC    180\nCAGTCCTACA CAAACACTGG CGATGATGCA TGGGCTGGTC AGAAGGATTT GGCGTACATG    240\nGGGGCACAAT GTGGGCCTTT CGATCAACAT TTTGTGTATG AGGCTGGAGA TGGACTTGAA    300\nGACGTTGTGA CCGCATTCTC TTATTTGCAA GGCAAGGAAT ATGAGAACCA GGGACTGAAT    360\nATACGTTCTG CAATGCCTCC GAAGTACGTT TTCGGATTTT TCCAAGGCGT ATTCGGAGCC    420\nACATCGCTGC TAAGGGACAA CTTACCTGCC GGCGAGAACA ACGTCTCTTT GGAAGAAATT    480\nGTTGAAGGAT ATCAAAATCA GAACGTGCCA TTTGAAGGTC TTGCTGTGGA TGTTGATATG    540\nCAAGATGACT TGAGAGTGTT CACTACGAGA CCGGCGTTTT GGACGGCAAA CAAGGTGGGG    600\nGAAGGCGGTG ATCCAAACAA CAAGTCAGTG TTTGAGTGGG CACATGACAG GGGCCTTGTC    660\nTGCCAGACGA ATGTAACTTG CTTCTTGAAG AACGAGAAAA ATCCTTACGA AGTGAATCAG    720\nTCATTGAGGG AGAAGCAGTT GTATACGAAG AGTGATTCCT TGGACAACAT TGATTTTGGA    780\nACTACTCCAG ATGGGCCTAG CGATGCGTAC ATTGGACACT TAGACTACGG TGGTGGTGTG    840\nGAGTGTGATG CACTATTCCC AGACTGGGGT CGACCAGACG TGGCTCAATG GTGGGGCGAT    900\nAACTACAAGA AACTATTCAG CATTGGTCTC GACTTCGTAT GGCAAGACAT GAC           953\n(2)SEQ ID NO：13资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：969个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(814..821，″″)\n(D)其它资料：/注＝“每个在(且包括)814和821之\n             间的g是misc核酸”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：\nATGACAAACT ACAACTACGA CAACTATAAC TACAACCAGT CAGATCTTAT TGCTCCAGGA    60\nTATCCTTCCG ACCCGAACTT CTACATTCCC ATGTATTTTG CAGCACCTTG GGTAGTTGTT    120\nAAGGGATGCA GTGGCAACAG CGATGAACAG TACTCGTACG GATGGTTTAT GGATAATGTC    180\nTCCCAAACTT ACATGAATAC TGGTGGTACT TCCTGGAACT GTGGAGAGGA GAACTTGGCA    240\nTACATGGGAG CACAGTGCGG TCCATTTGAC CAACATTTTG TGTATGGTGA TGGAGATGGT    300\nCTTGAGGATG TTGTCCAAGC GTTCTCTCTT CTGCAAGGCA AAGAGTTTGA GAACCAAGTT    360\nCTGAACAAAC GTGCCGTAAT GCCTCCGAAA TATGTGTTTG GTTACTTTCA GGGAGTCTTT    420\nGGGATTGCTT CCTTGTTGAG AGAGCAAAGA CCAGAGGGTG GTAATAACAT CTCTGTTTCA    480\nGAGATTGTCG AAGGTTACCA AAGCAATAAC TTCCCTTTAG AGGGGTTAGC CGTAGATGTG    540\nGATATGCAAC AAGATTTGCG GTGTAGTTCA CCACTGAAGA TTGAATTTTG GACGGCAAAT    600\nAAGGTAGGCA CCGGGGGAGA CTCGAATAAC AAGTCGGTGT TTGAATGGGC ACATGACAAA    660\nGGCCTTGTAT GTCAGACGAA TGTTACTTGC TTCTTGAGAA ACGACAACGG CGGGGCAGAT    720\nTACGAAGTCA ATCAGACATT GAGGGAGAAG GGTTTGTACA CGAAGAATGA CTCACTGACG    780\nAACACTAACT TCGGAACTAC CAACGACGGG CCGGGGGGGG GGTACATTGG ACATCTGGAC    840\nTATGGTGGCG GAGGGAATTG TGATGCACTT TTCCCAGATT GGGGTCGACC GGGTGTGGCT    900\nGAATGGTGGG GTGATAACTA CAGCAAGCTC TTCAAAATTG GTCTGGACTT CGTGTGGCAA    960\nGATATGACA                                                            969\n(2)SEQ ID NO：14资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：607个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(128，″″)\n(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(232，″″)\n(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(249，″/)\n(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(526，″″)\n(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：\nATGACAAACT ACAATTACGA CAACTTGAAC TACAACCAAC CAGACGTCGT TCCTCCAGGT    60\nTATCACGACC ATCCCAACTA CTACATTCCA ATGTACTACG CAGCACCGTG GTTGGTCGTT    120\nCAGGGATGCG CGGGGACATC GAAGCAATAC TCGTACGGTT GGTTTATGGA CAATGTCTCT    180\nCAGTCGTACA TGAACACTGG AGATACGGCG TGGAACTGCG GACAGGAAAA CGTGGCATAC    240\nATGGGCGCGC AATACGGGCC ATTTGATCAG CACTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGCCTT    300\nGAAGATGTCG TCAAAGCGTT CTCCTTTCTT CAAGGAAAGG AGTTCGAAGA CAAAAAACTC    360\nAACAAGCGTT CTGTAATGCC TCCGAAGTAC GTGTTTGGTT TCTTCCAGGG TGTTTTCGGT    420\nGCACTTTCAC TGTTGAAGCA GAATCTGCCT GCCGGAGAGA ACAACATCTC AGTGCAAGAG    480\nATTGTGGAGG GTTACCAGGA TAACGACTAC CCCTTTGAAG GGCTCGCGGT AGATGTTGAT    540\nATGCAAGATG ATCTGCGAGT GTTTACTACC AAACCAGAAT ATTGGTCGGC AAACATGGTA    600\nGGCGAAG                                                              607\n(2)SEQ ID NO：15资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：90个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：\nTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala\n1               5                   10                  15\nPhe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser\n            20                  25                  30\nAsn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp\n        35                  40                  45\nGly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu\n    50                  55                  60\nArg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro\n65                  70                  75                  80\nAsp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala\n                85                  90\n(2)SEQ ID NO：16资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(21，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(xi)序列描述：SEQ ID N0：16：\nATGTANAANA ANGANTCNAA NGT                                              23\n(2)SEQ ID NO：17资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(21，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：\nATGTANAANA ANGANAGNAA NGT                                              23\n(2)SEQ ID NO：18资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：17个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(xi)序列描述：SEQID NO：18：\nTANCCNTCNT GNCCNCC                                                     17\n(2)SEQ ID NO：19资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：20个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或R”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：\nGGNCCNAANT TNTACCANTG                                                  20\n(2)SEQ ID NO：20资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：17个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：\nTANCGNTGGC ANGANGT                                                     17\n(2)SEQ ID NO：21资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：17个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：\nTANAGNTGGC ANGANGT                                                     17\n(2)SEQ ID N0：22资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：71个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：\nATGTACAAGA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGCGGC    60\nCACGACGGTT A                                                         71\n(2)SEQ ID NO：23资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：\nMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Va1 Arg Arg A1a Gln Asn Asp His Phe\n1               5                   10                  15     \nLeu Leu Gly Gly His Asp Gly\n            20\n(2)SEQ ID NO：24资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：160个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：\nATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGTGGA    60\nCATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG AGAATTCGAC CGAACGGAAT    120\nTGTACTTGCC CGTGCTGACC CAATGGTACA AATTCGGCCC                          160\n(2)SEQ ID NO：25资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：54个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：\nMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe\n1               5                   10                  15\nLeu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val\n            20                  25                  30\nTrp Glu Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln\n        35                  40                  45\nTrp Tyr Lys Phe Gly Pro\n    50\n(2)SEQ ID NO：26资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：238个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：\nTACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA ATGCGGCTTT CGGGAAACCG    60\nATTATCAAGG CAGCTTCCAT GTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC    120\nCACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT GTGCACCTGT TGTGTGGGAG    180\nAATACAACCA GTCGCGATCT GTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC      238\n(2)SEQ ID NO：27资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：79个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：\nTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala\n1               5                   10                  15\nPhe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg\n            20                  25                  30\nAsn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp\n        35                  40                  45\nGly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr Thr Ser\n    50                  55                  60\nArg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe Gly\n65                  70                  75\n(2)SEQ ID NO：28资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：28个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：\nGCTCTAGAGC ATGTTTTCAA CCCTTGCG                                         28\n(2)SEQ ID NO：29资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：36个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：\nAGCTTGTTAA CATGTATCCA ACCCTCACCT TCGTGG                                36\n(2)SEQ ID NO：30资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：34个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：双链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：\nACAATTGTAC ATAGGTTGGG AGTGGAAGCA CCGC                                  34\n(2)SEQ ID NO：31资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：75个氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：\nLys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp\n1               5                   10                  15             \nIle Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly\n            20                  25                  30\nGly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe\n        35                  40                  45  \nAsp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser\n    50                  55                  60 \nArg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr\n65                  70                  75                                    \n(2)SEQ ID NO：32资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(21，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：\nCANCANAANA TGCTNAANGA NAC                                              23\n(2)SEQ ID NO：33资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(21，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：\nCANCANAANA TGTTNAANGA NAC                                              23\n(2)SEQ ID NO：34资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：20个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：\nTANAANGGNT CNCTNTGNTA                                                  20\n(2)SEQ ID NO：35资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：20个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(3，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：\nTANAANGGNT CNGANTGNTA                                                  20\n(2)SEQ ID NO：36资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：37个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：\nAAACTGCAGC TGGCGCGCCA TGGCAGGATT TTCTGAT                               37\n(2)SEQ ID NO：37资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(12，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(21，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：\nATGACNAANT ANAANTANGA NAA                                              23\n(2)SEQ ID NO：38资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：21个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(1，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是A或G”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(4，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(13，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(16，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(19，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：\nNTGNGGCATC ATNGCNGGNA C                                                21\n(2)SEQ ID NO：39资料：\n(i)序列特征：\n(A)长度：23个碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑：线型\n(ii)分子类型：cDNA\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(6，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(9，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是C或T”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(15，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(18，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(ix)特征：\n(A)名称/键：misc_区别\n(B)位置：置换(21，″″)\n(D)其它资料：/注＝“N是G或A”\n(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：\nGTCATNTCNT GCCANACNAA NTC                                              23