穗花杉双黄酮作为唯一活性成分在制备治疗乙肝病毒药物中的应用

1.穗花杉双黄酮作为唯一活性成分在制备治疗乙肝病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述穗花杉双黄酮和药学上可以接受的载体或赋形剂混合制备临床上可接受的药物制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物制剂为口服给药制剂；阴道、肛门、鼻腔给药制剂；肌肉或静脉给药制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、缓释制剂、滴丸。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的穗花杉双黄酮，是从含有该成分的植物、中药材及中药饮片中提取出来的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的中药材为：卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring 或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook. etGrev.)Maxim.的干燥全草。

穗花杉双黄酮作为唯一活性成分在制备治疗乙肝病毒药物\n中的应用\n技术领域：\n[0001] 本发明涉及医药技术领域，涉及穗花杉双黄酮(amentoflavone)在制药领域的新用途，具体涉及穗花杉双黄酮在治疗病毒性疾病方面的新用途。 \n背景技术：\n[0002] 乙肝病毒等各种肝炎病毒、以及各种呼吸道病毒所引起的病毒感染性疾病是一组常见病，其发病率在全球呈逐步上升趋势，而且不断出现新的致病病毒。如2003年初在我国部分省市流行的非典型肺炎(SARS)就是由冠状病毒的变异病毒所引起的一种严重的病毒性传染病。还有前年出现的H5N1病毒及目前出现的H1N1病毒感染的疾病，都属于病毒感染性疾病。 \n[0003] 病毒感染性疾病的危害不仅仅在于所引起的各种感染，更主要是其大多继发或合并细菌感染，故致使临床症状较重，病程较长，表现多样化，一直是危害人类健康的主要疾病之一。 \n[0004] 目前临床治疗病毒性疾病以化学合成和半合成的药物为主。但是，由于半个多世纪以来化学合成和半合成抗菌、抗病毒药物的广泛使用，已诱发病菌产生了耐药性菌株，且日渐增多条件性致病菌。加之其毒副作用较大等缺点，致使该类药物尽管作为一线治疗药、但已存在诸多不足。因此，抗病毒中药具有副作用小而具有广阔的应用前景，此新药的开发成功将产生重大的社会效益。 \n[0005] 穗花杉双黄酮是一种由天然植物、中药材或中药饮片中提取出来的具有显著抗病毒作用的化学成分。该天然产物的英文名为：amentoflavone；分子式为C30H18O10；\n分子量为538.47，化学结构名称为4H-1-苯并吡喃-4-酮，8-[5-(5，7-二羟基-4-氧代-4H-1-苯并吡喃)-2-羟苯基]-5，7-二羟基-2-(4-羟苯基)-，英文化学结构名(4H-l-Benzopyran-4-one，8-[5-(5，7-dihydroxy-4-oxo-4H-l-benzopyran-2-yl)-2-hydroxyphenyl]-5，7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-)，结构式如下： \n[0006] \n[0007] 中 国 药 典 2005 年 版 中 规 定 卷 柏 为 卷 柏 科 植 物 卷 柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草。全年均可采收，除去须根及泥沙，晒干。辛，平。归肝、心经。具有活血通经。用于经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤。卷柏炭化瘀止血。用于吐血，崩漏，便血，脱肛。卷柏中含有多种化学成分，如黄酮类，现已发现卷柏中含有芹菜素(apigenin)、穗花杉双黄酮(amentoflavone)、扁柏双黄酮(hinokiflavone)、异柳杉素(isocryptomerin)及阿曼托黄色(amentoflavone)等；苯丙素类、生物碱类、酚类、有机酸类等化合物。药理作用显示具有：免疫及抗肿瘤作用、对血液系统的作用、抗病毒、抑菌与抗炎作用、镇痛镇静等 作用。而穗花杉双黄酮用于治疗乙肝病毒、流感病毒等病毒性疾病的作用却未见相关报道。 \n发明内容：\n[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种天然化合物穗花杉双黄酮用于治疗病毒性疾病的新用途。在临床上可以制备成用于治疗病毒性疾病的药物制剂。所述的天然化合物穗花杉双黄酮，是从含有该成分的植物、中药材或中药饮片中提取出来的，如中药卷柏或其中药饮片，优选的中药材为：卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草。用该化合物做为药效成分来制备用于治疗病毒性疾病的药物制剂，可单独或与制药工艺中可接受的赋形剂结合，按照常规方法制成口服给药、腔道给药、肌肉或静脉给药的药物剂型。所述穗花杉双黄酮的含量在90％以上。本发明发现了中药卷柏治疗病毒性疾病的药效成分，为其临床应用提供了科学依据，使穗花杉双黄酮可做为一个天然的抗病毒剂，具有无成瘾性、用量小的特点。 \n[0009] 穗花杉双黄酮采用体外培养法筛选实验，结果表明：穗花杉双黄酮对乙肝病毒的HBsAg和HBeAg有抑制作用，穗花杉双黄酮在12.5ug/ml的浓度时对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为75.7％、63.6％；穗花杉双黄酮在25ug/ml的浓度时对HSV-I的抑制率分别为55.9％；穗花杉双黄酮在12.5ug/ml的浓度时对流感病毒A型(H1N1)的抑制率分别为\n61.1％；穗花杉双黄酮在25ug/ml的浓度时对CVB3的抑制率分别为39.8％。 [0010] 因此，穗花杉双黄酮为一种从天然植物中分离得到的抗病毒成分，成分含量在\n90％以上，是一种具有开发前景的抗病毒中药新药制剂。 \n[0011] 目前临床治疗病毒性疾病以化学合成和半合成的药物为主。但是，由于半个多世纪以来化学合成和半合成抗菌、抗病毒药物的广泛使用，已诱发病菌产生了耐药性菌株，且日渐增多条件性致病菌。加之其毒副作用较大等缺点，致使该类药物尽管作为一线治疗药、但已存在诸多不足。因此，抗病毒中药具有副作用小而具有广阔的应用前景，此新药的开发成功将产生重大的社会效益。 \n具体实施方式：\n[0012] 实施例1：穗花杉双黄酮(amentoflavone)对乙肝病毒的抑制作用。 [0013] 材料与方法 \n[0014] 1.体外细胞模型：乙型肝炎病毒(HBV)转染的HepG2细胞，即HepG2 2.215细胞。 [0015] 2.MTT法检测样品对细胞的毒性。 \n[0016] 3.酶联免疫法(EIA)检测样品对HBsAg和HBeAg的抑制作用。 \n[0017] 试验过程 \n[0018] 1.药物的细胞毒性检测 \n[0019] HepG2 2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养48小时后，加入不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，用MTT法检测细胞存活率，确定药物对HepG2 2.2.15细胞的毒性浓度。 \n[0020] 2.药物对HBV病毒抗原抑制作用检测 \n[0021] HepG2 2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养48小时后，加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用HBsAg和HBeAg诊断试剂盒(ELISA法)检测HBsAg和HBeAg。 \n[0022] 实验结果： \n[0023] 实验结果表明穗花杉双黄酮(amentoflavone)对HBsAg、HBeAg抗原的分泌有抑制作用，对2215细胞的无毒浓度为12.5ug/ml，即(TC0＝12.5ug/ml)，穗花杉双黄酮在\n12.5ug/ml的浓度时对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为75.7％、63.6％。 \n[0024] 实施例2：穗花杉双黄酮(amentoflavone)体外对疱疹病毒抑制活性检测材料与方法 \n[0025] 1.体外宿主细胞：Vero细胞。 \n[0026] 2.病毒株：单纯疱疹病毒I型(HSV-I)。 \n[0027] 3.CPE法检测药物对细胞的毒性。 \n[0028] 4.CPE法(细胞病变)检测药物对疱疹病毒的抑制作用。 \n[0029] 抗病毒试验过程 \n[0030] 1.药物的细胞毒性检测 \n[0031] Vero细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养\n3天，用CPE法检测药物对Vero细胞的毒性。 \n[0032] 2.药物抗疱疹病毒作用检测 \n[0033] Vero细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用10TCID50的HSV-I感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对疱疹病毒的抑制作用。 \n[0034] 实验结果： \n[0035] 实验结果表明穗花杉双黄酮(amentoflavone)对Vero细胞的无毒浓度为25ug/ml，即(TC0＝25ug/ml)，穗花杉双黄酮在25ug/ml的浓度时对HSV-I的抑制率分别为\n55.9％。 \n[0036] 实施例3：穗花杉双黄酮(amentoflavone)体外对流感病毒抑制活性检测材料与方法 \n[0037] 1.体外宿主细胞：MDCK细胞。 \n[0038] 2.病毒株：流感病毒A型(H1N1)(A3/京科/30/95)。 \n[0039] 3.CPE法检测药物对细胞的毒性。 \n[0040] 4.CPE法(细胞病变)检测药物对流感病毒的抑制作用。 \n[0041] 试验过程 \n[0042] 1.药物的细胞毒性检测 \n[0043] MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养\n3天，用CPE法检测药物对MDCK细胞的毒性。 \n[0044] 2.药物抗流感病毒作用检测 \n[0045] MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的流感病毒感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对流感病毒的抑制作用。 \n[0046] 实验结果： \n[0047] 实验结果表明穗花杉双黄酮(amentoflavone)对MDCK细胞的无毒浓度为12.5ug/ml，即(TC0＝12.5ug/ml)，穗花杉双黄酮在12.5ug/ml的浓度时对流感病毒A型(H1N1)的抑制率分别为61.1％。 \n[0048] 实施例4：穗花杉双黄酮(amentoflavone)体外对柯萨奇病毒抑制活性检测、材料与方法 \n[0049] 1.体外宿主细胞：Vero细胞。 \n[0050] 2.病毒株：抗柯萨奇B3病毒(CVB3)Nancy毒株。 \n[0051] 3.CPE法检测药物对细胞的毒性。 \n[0052] 4.CPE法(细胞病变)检测药物对柯萨奇B3病毒的抑制作用。 \n[0053] 试验过程 \n[0054] 1.药物的细胞毒性检测 \n[0055] Vero细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养\n3天，用MTT法检测药物对Vero细胞的毒性。 \n[0056] 2.药物抗柯萨奇B3病毒作用检测 \n[0057] Vero细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的柯萨奇B3病毒感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对柯萨奇B3病毒的抑制作用。 \n[0058] 实验结果： \n[0059] 实验结果表明穗花杉双黄酮(amentoflavone)对Vero细胞的无毒浓度为25ug/ml，即(TC0＝25ug/ml)，穗花杉双黄酮在25ug/ml的浓度时对CVB3的抑制率分别为\n39.8％。 \n[0060] 实施例5： \n[0061] 取穗花杉双黄酮(amentoflavone)25g，加入淀粉细粉200g，用等量递增法混匀，加入滑石粉5g，硬脂酸镁2g，混匀，用85％乙醇制粒，干燥，整粒，压制成1000片，每日3次，每次2片。 \n[0062] 实施例6： \n[0063] 取穗花杉双黄酮(amentoflavone)25g，加入淀粉细粉150g，滑石粉10g，硬脂酸镁\n5g，混匀，制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，每日3次，每次2片。 \n[0064] 实施例7： \n[0065] 取穗花杉双黄酮(amentoflavone)50g，加入微晶纤维素250g，交联聚乙烯吡咯烷酮50g，混匀，加入90乙醇制粒，干燥，整粒，加入羧甲基淀粉钠10g，硬脂酸镁5g，混匀，压制成1000片，每日服用3次，每次1片。 \n[0066] 实施例8： \n[0067] 取穗花杉双黄酮(amentoflavone)50g，甘露醇150g，加注射用水2000ml，搅拌使溶解，用1M NaOH溶液调pH至9.60～10.0，搅拌使溶解，滤过，滤液按1％溶液体积量加入活性炭，在70～80℃下加热30分钟，粗滤过，管道及容器用400mL注射用水洗涤，加水到