一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法

1.一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、材料的采集及处理：选择温室内培养的生长健壮、无病虫害的毛果杨植株，采集新萌生的枝条，剪去枝条上的叶片，将剩余枝条剪成长度为9～11cm且带有3～4个芽点的茎段，用自来水冲洗1～2h；
二、接种培养及无菌苗的扩繁：将自来水冲洗过的茎段经无菌处理后，接种到生根培养基WPM3中培养，繁殖无菌苗；
三、不定芽分化诱导：以步骤二培养得到的毛果杨无菌苗叶片做外植体，选取生长健壮的毛果杨无菌苗叶片，剪掉叶尖，仅保留长为0.8～1.1cm的叶基部分及0.2～0.3mm的叶柄，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基WPM1中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养，15～20d即可诱导出不定芽；
所述不定芽诱导培养基WPM1由400mg/L KNO3、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、22.4mg/L MnSO4、
6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8；
四、不定芽伸长诱导：将带有不定芽的愈伤组织切成块放入不定芽伸长培养基WPM2中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养15d；
所述不定芽伸长培养基WPM2由400mg/L KNO3、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、8.6mg/LZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、22.4mg/LMnSO4、
6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8；
五、不定芽生根培养：将茎长超过1.5cm的不定芽从基部剪下，分割成单株接种于生根培养基WPM3中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养7～10d生根；所述生根培养基WPM3由400mg/L KNO3、990mg/L K2SO4、370mg/LMgSO4、96mg/L CaCl2、8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、170mg/L KH2PO4、
22.4mg/L MnSO4、6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L蔗糖、
5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸和蒸馏水制成，pH值为5.8；
六、炼苗和移栽：将根长超过2cm的植株经炼苗2～3d后移栽到温室培养。

一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种毛果杨不定芽诱导及植株再生的方法。\n背景技术\n[0002] 毛果杨(Populus trichocarpa Torr.Gray)也叫做测序杨，是杨属(Populus L.)青杨派树种，原产地主要分布在北美洲西部地区。2006年毛果杨的全部基因组测序完成，研究成果在当年9月15日出版的《Science》期刊上发表(Tuskan et al.,2006)，近年来毛果杨已成为学术界备受重视的一个林木模式树种。但对于2006年已经基因组测序完成的木本模式植物毛果杨来说，成功建立组织培养体系及遗传转化的案例却很少，2009年张红梅等人发表的《毛果杨的组织培养与快速繁殖》中，利用节间茎段做外植体，将腋芽处萌发出的嫩芽进行增殖培养，此方法仅是应用组织培养进行毛果杨的快速繁殖，并不属于植株再生体系的范畴。在Plant Cell Physiol.47(11):1582–1589(2006)中，所用的外植体是温室内苗龄6个月的节间茎段，农杆菌侵染后，经过30-45d诱导愈伤组织(40％)，再经过20-30d芽分化诱导，再经40d芽的伸长培养，才能转到生根培养基上。该方法虽然利用茎段外植体诱导出毛果杨再生芽，但诱导效率低，耗时较长。在Plant Molecular Biology Reporter.22:1–\n9(2004)中，外植体仍为节间茎段，出芽率低且耗时，转基因植株的诱导率仅为4％。植株再生率低是限制遗传转化的关键条件之一。\n发明内容\n[0003] 本发明是要解决现有毛果杨组织培养器官发生困难、植株再生率低以及目前用毛果杨茎段做外植体不定芽诱导率低和周期长的问题，提供一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法。\n[0004] 本发明毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法，按以下步骤进行：\n[0005] 一、材料的采集及处理：选择温室内培养的生长健壮、无病虫害的毛果杨植株，采集新萌生的枝条，剪去枝条上的叶片，将剩余枝条剪成长度为9～11cm且带有3～4个芽点的茎段，用自来水冲洗1～2h；\n[0006] 二、接种培养及无菌苗的扩繁：将自来水冲洗过的茎段经无菌处理后，接种到生根培养基WPM3中培养，繁殖无菌苗；\n[0007] 三、不定芽分化诱导：以步骤二培养得到的毛果杨无菌苗叶片做外植体，选取生长健壮的毛果杨无菌苗叶片，剪掉叶尖，仅保留长为0.8～1.1cm的叶基部分及0.2～0.3mm的叶柄，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基WPM1中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养，15～20d即可诱导出不定芽；\n[0008] 四、不定芽伸长诱导：将带有不定芽的愈伤组织切成块放入不定芽伸长培养基WPM2中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养15d；\n[0009] 五、不定芽生根培养：将茎长超过1.5cm的不定芽从基部剪下，分割成单株接种于生根培养基WPM3中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养7～10d生根；\n[0010] 六、炼苗和移栽：将根长超过2cm的植株经炼苗2～3d后移栽到温室培养。\n[0011] 本发明以毛果杨无菌苗叶片做外植体，不定芽诱导率和成活率高达100％，从外植体培养至成苗仅用60d左右时间，操作步骤简便可行，不仅解决了毛果杨组织培养时器官发生困难及目前用毛果杨茎段做外植体不定芽诱导率低的难题，而且极大地缩短了植株再生时间，叶片不定芽分化仅需15-20d，小植株生根仅需7～10d。本发明对于毛果杨的组培快繁及基因工程育种研究具有重要意义，应用前景广阔。\n附图说明\n[0012] 图1为实验1步骤三中诱导出的毛果杨不定芽的照片；图2为实验1步骤四毛果杨不定芽伸长的照片；图3为实验1步骤五毛果杨不定芽生根的照片；图4为实验1步骤六中移栽后的毛果杨植株照片。\n具体实施方式\n[0013] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。\n[0014] 具体实施方式一：本实施方式毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法，按以下步骤进行：\n[0015] 一、材料的采集及处理：选择温室内培养的生长健壮、无病虫害的毛果杨植株，采集新萌生的枝条，剪去枝条上的叶片，将剩余枝条剪成长度为9～11cm且带有3～4个芽点的茎段，用自来水冲洗1～2h；\n[0016] 二、接种培养及无菌苗的扩繁：将自来水冲洗过的茎段经无菌处理后，接种到生根培养基WPM3中培养，繁殖无菌苗；\n[0017] 三、不定芽分化诱导：以步骤二培养得到的毛果杨无菌苗叶片做外植体，选取生长健壮的毛果杨无菌苗叶片，剪掉叶尖，仅保留长为0.8～1.1cm的叶基部分及0.2～0.3mm的叶柄，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基WPM1中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养，15～20d即可诱导出不定芽；\n[0018] 四、不定芽伸长诱导：将带有不定芽的愈伤组织切成块放入不定芽伸长培养基WPM2中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养15d；\n[0019] 五、不定芽生根培养：将茎长超过1.5cm的不定芽从基部剪下，分割成单株接种于-2 -1\n生根培养基WPM3中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m ·s的条件下培养7～10d生根；\n[0020] 六、炼苗和移栽：将根长超过2cm的植株经炼苗2～3d后移栽到温室培养。\n[0021] 本发明以毛果杨叶片为外植体进行不定芽分化诱导，诱导率达到100％，且每个外植体形成的不定芽数量都在8个以上，与已报导的用茎段作外植体的文献相比，不定芽诱导率提高10倍以上，且大大缩短了成苗时间，本研究对于毛果杨的大量扩繁和转基因育种研究具有广泛的应用价值。\n[0022] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述接种培养及无菌苗的扩繁的具体方法是：将自来水冲洗过的茎段用无菌水清洗1遍，再将茎段放入体积百分浓度为70％的酒精中消毒30sec，取出茎段用无菌水清洗3遍，然后用体积浓度为\n2％的次氯酸钠消毒7min，再次用无菌水清洗3遍，最后用无菌滤纸吸干茎段表面的水分，用无菌剪刀将茎段两端已被消毒液氧化的部分剪掉，再将剩余茎段剪成仅包含一个芽点的小段，接种到生根培养基WPM3上，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m-2·s-1的条件下培养15d，再将从腋芽处萌发的无菌绿芽剪下，插入新的生根培养基WPM3中继续扩繁，得到无菌苗。其它与具体实施方式一相同。\n[0023] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤三中不定芽诱导培养基WPM1由400mg/L KNO3、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、22.4mg/L MnSO4、6.2mg/L H3BO3、\n0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、\n0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为\n5.8。其它与具体实施方式一或二相同。\n[0024] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤四中不定芽伸长培养基WPM2由400mg/L KNO3、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、8.6mg/L ZnSO4、\n0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、22.4mg/L MnSO4、\n6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8。其它与具体实施方式一至三之一相同。\n[0025] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二和步骤五中的生根培养基WPM3由400mg/L KNO3、990mg/L K2SO4、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、\n8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、170mg/L KH2PO4、22.4mg/L MnSO4、\n6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸和蒸馏水制成，pH值为5.8。其它与具体实施方式一至四之一相同。\n[0026] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤六中炼苗移栽的具体方法是：将生根后的组培苗敞口放在温室中炼苗2～3天，然后将组培苗移栽到育苗盆中，完成瓶苗从人工控制条件给养到幼苗自养的过程，具体方法是：将瓶中的幼苗取出，用自来水清洗黏在根表面的培养基，移植到填满基质的育苗盆中，每盆一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，压紧基质，移植完成后浇透水，空气相对湿度控制在95％以上，基质相对湿度控制在60％～80％，培养温度控制在25～28℃，所述基质是由泥炭土和蛭石按体积比3:1的比例混合得到的。其它与具体实施方式一至五之一相同。\n[0027] 为验证本发明的效果，进行以下实验：\n[0028] 实验1：\n[0029] 本实验毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法，按以下步骤进行：\n[0030] 一、材料的采集及处理：选择温室内培养的生长健壮、无病虫害的毛果杨植株，采集新萌生的枝条，剪去枝条上的叶片，将剩余枝条剪成长度为10cm且带有4个芽点的茎段，用自来水冲洗1.5h；\n[0031] 二、接种培养及无菌苗的扩繁：将自来水冲洗过的茎段用无菌水清洗1遍，再将茎段放入体积百分浓度为70％的酒精中消毒30sec，其间充分震荡，使酒精与茎段表面充分接触，取出茎段用无菌水清洗3遍，然后用2％的次氯酸钠消毒7min，充分震荡使次氯酸钠与茎段表面充分接触，再次用无菌水清洗3遍，最后用无菌滤纸吸干茎段表面的水分，用无菌剪刀将茎段两端已被消毒液氧化的部分剪掉，再将剩余茎段剪成仅包含一个芽点的小段，接-2 -1\n种到生根培养基WPM3上，在温度为25℃，每日光照14h，光照强度35μmol·m ·s 的条件下培养15d，再将从腋芽处萌发的无菌绿芽剪下，插入新的生根培养基WPM3中继续扩繁，得到无菌苗。\n[0032] 三、不定芽分化诱导：以步骤二培养得到的毛果杨无菌苗叶片做外植体，选取生长健壮的毛果杨无菌苗叶片，剪掉叶尖，仅保留长为1cm的叶基部分及0.2mm的叶柄，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基WPM1中，在温度为25℃，每日光照16小时，光照强度40μmol·m-2·s-1的条件下培养，15天即诱导出不定芽；\n[0033] 四、不定芽伸长诱导：将带有不定芽的愈伤组织切成块放入不定芽伸长培养基-2 -1\nWPM2中，在温度为24℃，每日光照16小时，光照强度40μmol·m ·s 的条件下培养，诱导不定芽伸长，培养2周不定芽伸长1～1.5cm；\n[0034] 五、不定芽生根培养：将伸长超过1.5cm的不定芽从基部剪下，分割成单株接种于生根培养基WPM3中，在温度为25℃，每日光照16小时，光照强度40μmol·m-2·s-1的条件下培养6天，苗基部开始生根，培养15天，平均根数4～5根，平均根长2～3cm；\n[0035] 六、炼苗移栽：将生根后的组培苗敞口放在温室中炼苗3天，然后将组培苗移栽到育苗盆中，完成瓶苗从人工控制条件给养到幼苗自养的过程，具体方法是：将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满基质的育苗盆中，每盆一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，压紧基质，使苗根与基质紧密接触，移植完成后浇透水。空气相对湿度控制在95％以上，防止叶片失水，基质相对湿度控制在60％～80％，培养温度控制在25℃。所述基质是由泥炭土和蛭石按体积比3:1的比例混合得到的。\n[0036] 本实验步骤三中诱导出的不定芽的照片如图1所示，步骤四不定芽伸长的照片如图2所示，步骤五不定芽生根的照片如图3所示，步骤六中移栽后的毛果杨植株照片如图4所示。\n[0037] 本实验以毛果杨无菌苗叶片做外植体，不定芽诱导率和成活率高达100％，从外植体培养至成苗仅用60天左右时间，操作步骤简便可行，不仅解决了毛果杨组织培养时器官发生困难及目前用毛果杨茎段做外植体不定芽诱导率低的难题，而且极大地缩短了植株再生时间，叶片不定芽分化仅需15d，小植株生根仅需5～10d。\n[0038] 步骤三中不定芽诱导培养基WPM1由400mg/L KNO3、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、\n8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、\n22.4mg/L MnSO4、6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、\n5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8。\n[0039] 步骤四中不定芽伸长培养基WPM2由400mg/L KNO3、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、\n8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、\n22.4mg/L MnSO4、6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、\n5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8。\n[0040] 步骤二和步骤五中的生根培养基WPM3由400mg/L KNO3、990mg/L K2SO4、370mg/L MgSO4、96mg/L CaCl2、8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4、27.8mg/L FeSO4、170mg/L KH2PO4、\n22.4mg/L MnSO4、6.2mg/L H3BO3、0.25mg/L NaMoO2·2H2O、37.3mg/L Na2EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L蔗糖、\n5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸和蒸馏水制成，pH值为5.8。\n[0041] 培养基中所添加的激素都在培养基高温灭菌后加入。