一种促水产动物生长和提高抗病力的功能水产肽及其制备方法

1.一种促进对虾生长的粉剂产品，其特征是利用新鲜的鱼、虾水产加工副产物为原料，经如下加工步骤制得功能水产肽，其制备方法包括如下步骤：
(1)以新鲜的鱼、虾水产加工副产物为原料，经绞肉机绞碎成为粗糜浆，糜浆加水，1份粗糜浆加2～4份水，再经胶体磨磨成为50～100目的微细胶体浆液；
(2)将上述微细胶体浆液调pH值至5.0～8.5，按浆液原料的重量比，加入0.2％～
0.4％的内切酶，与原料中原有的内源生物酶组合形成复合工具酶，进行酶水解2小时，水解温度30～45℃，得到酶解液；所述的内切酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶中的一种蛋白酶；
(3)将上述酶水解液进行发酵，
a.配制发酵培养基：培养基为液体，各组分为：蛋白胨1.0～2.5g、葡萄糖4～5g、可溶性淀粉10～20g、蔗糖10～15g、黄豆粉5～15g、麦芽糖2～5g、生长因子3g，自来水
1000ml，其中生长因子是Na2PO42g、Mg2SO41g的混合物，调节pH至6.0～7.5，灭菌，得到液体培养基；
b.制备种子液：将真菌A.S 3.042和A.S 3.350同时接入灭菌后的上述液体培养基中，于28～32℃培养48～72小时，得到种子液；所述的真菌A.S 3.042和A.S 3.350接
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入液体培养基中的接种量为1.0×10cfu/ml培养基，真菌A.S 3.042和A.S 3.350的比例
10∶2；
c.发酵工艺：将上述酶解液加入发酵罐中，然后加入碳源，使酶解液中的含氮量与加入碳源的含碳量的重量之比为2～10∶1，调pH至6.0～7.5，将待发酵液在0.12～
0.15MPa、121～125℃灭菌20～30分钟，冷却到25～35℃；加入种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1.5∶10，发酵起始温度控制在30～32℃，发酵10～18小时后，发酵热使反应体系升温，待发酵体系温度接近35℃，开始通入无菌空气，使发酵体系得到充足的氧气，控制反应体系温度在32～35℃，微生物进入有氧深层发酵20～30小时；所述的发酵罐中加入的碳源为面粉，或玉米粉，或碎大米粉，或甘薯粉；
(4)上述发酵液经灭菌、浓缩、流化床干燥，制成产品。

一种促水产动物生长和提高抗病力的功能水产肽及其制备\n方法\n[0001] (一)技术领域：本发明涉及新鲜鱼、虾等水产加工副产物的生物工程利用领域，具体涉及应用生物酶解结合发酵法制备具有促水产动物生长和提高抗病力的功能水产肽的方法。\n[0002] (二)背景技术：随着社会的发展，人们对无公害产品的需求日益增加，因此为防止药物残留对人类产生危害，联合国粮农组织、国际动物卫生组织和世界卫生组织共同提出控制动物药物的使用，未来将彻底禁止动物使用抗生素及人工合成的促生长素等化学物质。因而，新型无污染、无残留、无公害，能够提高畜、禽、水产等动物免疫力、抗病力及生产性能的安全绿色饲料添加剂将成为饲料行业创新和研究开发的重点。\n[0003] 肽是蛋白质不完全降解的产物，其在生物体内的营养价值及生理功能非常重要，因此被称为生物活性肽。活性肽包括生物体内自然存在的内源性活性肽(如有镇痛作用的脑啡肽、抗病毒改善肝功能作用的胸腺肽等)，以及天然蛋白质经酶水解生成的外源性活性肽(如酪蛋白磷酸肽、大豆降血压肽、水产降血压肽等)。由于酶解制得的寡肽具有多种生理功能作用，因而被广泛应用于医药、保健、畜禽等领域，显示出良好的应用前景。\n[0004] 生物功能肽作为一种绿色饲料添加剂已逐渐被各国科学家和企业家所关注。美国乐能公司中国分公司以大豆为原料，采用生物酶法制备了大豆肽，产品名称为乐能大豆肽，试验证明产品具有调节猪、禽消化系统、免疫系统、改善肠道内环境，提高饲料利用率和抗病力。华中农业大学生命科学院、国家饲料工程技术研究中心、江西省农业科学院先后研究采用混合固态发酵技术开发大豆蛋白肽，获得的大豆蛋白肽体外消化率大于95％，可用于配制早期断奶的仔猪、犊牛等饲料的营养添加剂，成为易消化吸收的蛋白饲料。近年一项专利“一种活性肽饲料添加剂及其制备方法和用途”(ZL200410029787.0)提出以植物蛋白、动物蛋白为原料，采用芽孢杆菌等微生物发酵法降解动植物蛋白质制备活性肽，该活性肽添加入断奶仔猪饲料，仔猪日增重率和饲料转化率显著高于空白对照组及抗生素组。活性肽添加于蛋鸡日粮，可提高产蛋率、增加蛋重、降低饲料消耗率，同时有对鸡外周血-T淋巴细胞增殖活力的影响。\n[0005] 然而，活性肽饲料添加剂目前均局限于家畜禽，也基本以大豆、动物皮和内脏等陆地蛋白源为制备生产活性肽的原料。\n[0006] 水产动物由于生活环境与家畜禽截然不同，是一变温动物，在进化史上较畜禽低等，有着独特的生理功能特性。生物活性肽的专一性决定了调节水产动物生理功能的活性肽的结构与家畜禽不同。其特殊的水体养殖环境也为试制功能活性肽带来一定难度，因此具有调节水产动物生理功能特性的功能肽产品还未曾见有。\n[0007] 水产鱼类、虾类深加工将产生50％左右的下脚料，资源量大。下脚料中含蛋白质高达48％、必需氨基酸含量占总氨基酸的50％以上，含有极其丰富的Ca、P、Fe、Se等常量和微量元素。虾头、鱼体内脏含有大量的生物酶及其未知的促生长因子，同时富含具有制备调节促水产动物生长和提高抗病力等生理功能作用的必需氨基酸和芳香族氨基酸，是制备水产活性肽的好原料。目前这些加工下脚料一部分用于生产粗饲料，由于加工手段原始，饲料颗粒粗，鱼蛋白质和鱼骨不能充分被水产动物利用。有的加工下脚料因得不到及时加工导致腐烂而被丢弃。目前虾头壳下脚料主要用于生产甲壳素，由于甲壳素的强酸强碱生产工艺严重破坏了虾下脚料中蛋白质、虾红素等营养物质结构，失去了蛋白质的营养价值。宝贵的生物资源成为废弃物，造成资源浪费和环境污染。\n[0008] 水产动物的生活环境为水体，由于水温低，又是变温动物，因此消化腺不发达，消化道简单，消化酶因体温低活性不高等因素，导致常规水产饲料淀粉、蛋白质等原料利用率很低。本发明以水产加工副产物为原料，采用先进的前处理技术，及复合生物酶和微生物多菌种有氧深层发酵相结合的生物工程技术，制备的功能水产肽有提高水产动物体内的蛋白酶活力和淀粉酶活力的功能，同时有促进水产动物钙和磷的吸收，改善机体微环境，提高免疫力和抗病力的作用。大大提高饲料中蛋白质和淀粉的利用率，提高水产动物生长和成活率。\n[0009] (三)发明内容：本发明的任务是提供一种采用先进的前处理技术、复合生物酶和微生物多菌种有氧深层发酵相结合的生物工程技术加工生产功能水产肽的方法，该方法生产的功能水产肽可用作水产饲料添加剂，具有促进水产动物生长和提高抗病能力，同时改善养殖水产品品质，提高养殖水产的增重率和成活率。\n[0010] 将新鲜的鱼、虾等水产加工副产物经胶体磨研磨成80～100目的胶体物，再将微细胶体浆调pH至5.0～8.5，用原料的0.2％～0.4％内切酶与原料中原有的生物酶组合形成复合水解工具酶，复合水解1.5～2小时，水解温度控制在30～45℃，使蛋白质大分子大尺度的被水解成为大肽链分子；在初步水解的液态原料中加入发酵介质碳水化合物、微量元素等，调pH至6.0～7.5，灭菌后，接入真菌A.S 3.042、A.S 3.350，起始温度控制在\n30～32℃，发酵10小时后，发酵热使反应体系升温，待发酵体系温度接近35℃，开始通入无菌气体，控制反应体系温度在32～35℃，此时微生物得到充足的氧气，快速生长，并大量分泌中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胶原蛋白酶等形成复合酶系，使原料、微生物、蛋白酶共为一体系，进行深层发酵。在该体系中大分子肽被微生物分泌的蛋白酶进一步定向水解成为有促生长和调节免疫功能的小分子肽。发酵后期，由于受到嗜酸性微生物的调控，及蛋白质和糖等发酵物质的分解使发酵体系呈酸性，此时鱼骨、鱼鳞、甲壳钙质开始被分解，转化为易为动物体吸收的离子钙，使鱼骨、鱼鳞、甲壳钙质得到充分转化利用。发酵30～48小时，经灭菌、浓缩、流化床干燥，制成粉剂产品，或将发酵灭菌后的产品经浓缩制成25％含固物的浓缩产品。\n[0011] 本发明的技术方案：\n[0012] 本发明提供的促水产动物生长和提高抗病力的功能水产肽，是利用新鲜的鱼、虾水产加工副产物为原料，经如下加工步骤制得的功能水产肽。\n[0013] 其制备方法包括如下步骤：\n[0014] (1)以新鲜的鱼、虾水产加工副产物为原料，经绞肉机绞碎成为粗糜浆，糜浆加水，\n1份粗糜浆加2～4份水，再经胶体磨磨成为(50～100目)微细胶体浆液，为下一步生物酶水解提供更多的作用底物；本发明直接以新鲜的虾头壳、鱼等水产加工副产物为原料，保留了虾头内脏及鱼体内原有的内源生物酶和微量元素、维生素、促生长因子等营养元素；\n[0015] (2)将上述微细胶体浆液调pH值至5.0～8.5，按浆液原料的重量比，加入\n0.2％～0.4％的内切酶，该与原料中原有的内源生物酶组合形成复合水解工具酶，进行酶水解1.5～2小时，水解温度30～45℃，使蛋白质大分子大尺度的被水解成为大肽链分子，得到酶解液；\n[0016] (3)将上述酶水解液进行发酵：\n[0017] a.配制发酵培养基：培养基为液体，各组分比例：蛋白胨1.0～2.5g、葡萄糖4～\n5g、可溶性淀粉10～20g、蔗糖10～15g、黄豆粉5～15g、麦芽糖2～5g、生长因子3g，自来水1000ml，其中生长因子是Na2PO42g、Mg2SO41g的混合物，调节pH至6.0～7.5，灭菌，得到液体培养基；\n[0018] b.制备种子液：将真菌A.S 3.042和A.S 3.350同时接入灭菌后的上述液体培养基中，于28～32℃培养48～72小时，得到种子液；\n[0019] c.发酵工艺：将上述酶解液加入发酵罐中，然后加入碳源，使酶解液中的含氮量与加入碳源的含碳量的重量之比为2～10∶1，调pH至6.0～7.5，将待发酵液在0.12～\n0.15MPa、121～125℃灭菌20～30分钟，冷却到25～35℃；加入种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1.5∶10，发酵起始温度控制在30～32℃，前期发酵10～18小时后，发酵热使反应体系升温，待发酵体系温度接近35℃，开始通入无菌空气，使发酵体系得到充足的氧气，然后进行有氧深层发酵20～30小时，控制反应体系温度在32～35℃；此时微生物得到充足的氧气，快速生长，并大量分泌中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胶原蛋白酶等形成复合酶系，使原料大分子肽、微生物、蛋白酶共为一体系，该体系中大分子肽被微生物分泌的蛋白酶进一步定向水解成为有促生长和调节免疫功能的小分子肽；发酵后期，由于受到嗜酸性微生物的调控，及蛋白质和糖等发酵物质的分解使发酵体系呈酸性，鱼骨、鱼鳞、甲壳钙质开始被分解，转化为易为动物体吸收的离子钙，使鱼骨、鱼鳞、甲壳钙质得到充分转化利用；总体发酵时间控制在30～48小时，将产生更多的功能性水产短肽、生物钙离子等营养元素；\n[0020] (4)上述发酵液经灭菌、浓缩、流化床干燥，制成粉剂产品；或将发酵液灭菌后经浓缩制成25％含固物的浓缩液。\n[0021] 所述的第(2)步外加的专一性内切酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶中的一种，加入量为酶解原料的0.2％～0.4％。\n[0022] 所述的第(3)中，真菌A.S 3.042和A.S 3.350的接种量为1.0×105cfu/ml培养基，接入的真菌A.S 3.042和A.S 3.350的比例10∶2。\n[0023] 所述的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶购自杭州三叶生物酶制剂厂，活力3000U/g，最适pH7.5～8.5，酶解最适温度40℃；胃蛋白酶购自上海生化试剂厂，活力4500U/g，最适pH4～\n5，酶解最适温度38℃；枯草杆菌中性蛋白酶，购自于无锡酶制剂厂，活力50000U/g，最适温度42℃，最适pH7.2。\n[0024] 所述的真菌A.S 3.042、A.S3.350均为食品工业用菌，食用安全，均购自中国科学院微生物所。A.S 3.042为好气菌，生长速度快、分生孢子大、数量多、对杂菌的抵抗力强，其最适生长温度为30～33℃，最高不宜超过38℃，最适pH7.5，培养20小时为产酶旺盛期，\n28小时为高峰期，主要分泌中性蛋白酶、还有果胶酶、淀粉酶等。A.S 3.350最适生长温度\n28～30℃，最适pH6.5，培养24小时为产酶旺盛期，30小时为高峰期，主要分泌酸性蛋白酶、糖化酶、果胶酶和少量端肽酶等。\n[0025] 本发明采用氢氧化钠或盐酸调胶体浆pH值、培养基pH值和发酵罐中发酵液pH值。\n[0026] 本发明技术的先进性在于：\n[0027] 1)该方法将生物酶工程、微生物多菌种深层发酵结合使用于水产加工副产物的深度转化，使原本浪费的低值资源中的蛋白质转化为有促水产动物生长、提高免疫功能的小分子肽，实现鱼骨、鱼鳞转化为生物钙，使资源充分的得到利用。\n[0028] 2)初步酶解的液态原料(或机械破碎的糜浆)通过多种微生物协同深层发酵，可被微生物分泌的多种蛋白酶分解，大大提高功能小分子肽比例。\n[0029] 3)发酵中后期，由于受到嗜酸性微生物的调控及蛋白质和糖等发酵物质的分解使发酵体系呈酸性，有效地激活了酸性蛋白酶、胶原蛋白酶的活性，使鱼骨、鱼鳞、甲壳钙质在生物酶和酸性环境中开始被分解，转化为易为动物吸收的离子钙；\n[0030] 4)工艺和技术达到资源全部转化和利用，无废弃物排放，确保了生态环境安全。\n[0031] 采用高效液相色谱[方法参考：中国食品学报，2006，6(3)：128～132，题目：高效液相色谱法测定奶粉中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量]分析测得本发明产品中肽相对分子质量分布(表1)，其中相对分子质量5000以下的短肽含量高达95％以上，具有活性功能的肽一般均为小分子短肽。\n[0032] \n 相对分子质量 比例 肽链长度(氨基酸数)\n Relative molecular Ratio(％) Length of peptide chain\n mass(u)\n 13800 0.32 108\n 8650 0.25 68\n 7850 0.92 61\n 6500 0.48 51\n 5430 2.86 42\n 4890 1.98 38\n 4320 0.95 34\n 3860 11.99 30\n 2680 12.02 21\n 1890 5.92 15\n 1550 10.12 12\n ＜1000 52.16 ＜8\n[0033] 在水产养殖饲料中添加1％-3％的本发明功能肽粉剂，采用逐级扩大混合的方法与饲料混合均匀，制成颗粒饲料饲喂；或将发酵后经浓缩制成的25％含固物的浓缩液直接喷雾添加于常规饲料中饲喂；养殖45天(在同等饲喂条件下，以不添加本发明产品为对照)，测得胰蛋白酶活力提高45％-53％，淀粉酶活力提高50％-65％，增重率提高\n10％-15％，成活率提高12％-15％，功能作用显著。\n[0034] (四)具体实施方案：\n[0035] 实施例1：\n[0036] (1)将新鲜的虾头、壳100公斤，经绞肉机绞碎成为粗糜浆，粗糜浆加水混合，水的加入量为1份粗糜浆加2～4份水，本实施例为4份水，再经胶体磨成为50～100目的胶体浆液；\n[0037] (2)将胶体浆液调pH至8.5，加入胶体浆液原料重量的0.2％的胰蛋白酶(或胰凝乳蛋白酶)，并与虾头(壳)中大量的内源酶(原有的内源生物酶有脂肪酶、肝胰脏蛋白酶、肝胰脏淀粉酶、肠淀粉酶、几丁质酶等)复合，共同水解2小时，水解温度42℃，使虾头壳中的蛋白质大分子被水解成为大肽链分子，制成水解液；\n[0038] (3)制备种子液：\n[0039] 配制培养基：蛋白胨1.0～2.5g、葡萄糖4～5g、可溶性淀粉10～20g、蔗糖10～\n15g、黄豆粉5～15g、麦芽糖2～5g、生长因子3g，自来水1000ml，其中生长因子是Na2PO4 \n2g、Mg2SO4 1g的混合物，调节pH至6.0～7.5，灭菌，得到液体培养基；\n[0040] 将真菌A.S 3.042和A.S 3.350同时接入灭菌后的液体培养基中，接种量为\n5\n1.0×10cfu/ml培养基，接入的真菌A.S 3.042和A.S 3.350的比例10∶2，于28～32℃培养48～72小时，本实施例培养60小时，得到种子液；\n[0041] (4)发酵：将步骤(2)得到的酶解液加入发酵罐中，测定酶解液的含氮量，加入碳源面粉(或玉米粉，或碎大米粉，或甘薯粉)和蔗糖，两者的重量比＝4∶1，碳源的加入量为使发酵液体的氮碳比为2～10∶1，本实施例为10∶1，调pH至7.2，再将待发酵液在\n0.12～0.15MPa、121～125℃灭菌20～30分钟，冷却到25～35℃；加入种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1.5∶10，发酵起始温度控制在30～32℃，发酵10～18小时后，开始通入无菌空气，通气速率为1.5L/min，使发酵体系得到充足的氧气，微生物进入有氧深层发酵20～30小时，控制反应体系温度在32～35℃，产生更多的功能性水产短肽。\n[0042] (5)发酵液经灭菌、浓缩、流化床干燥，制成30公斤本发明产品(为虾红色粉剂产品)。\n[0043] (6)本发明产品的应用：\n[0044] 在对虾养殖饲料中添加2％上述本发明产品(粉剂)，采用逐级扩大混合的方法与饲料混合均匀，制成颗粒饲料饲喂。\n[0045] 实施例2：\n[0046] (1)新鲜的鱼类加工副产物(碎鱼肉、肉皮、鱼骨、鱼鳞、内脏等)100公斤，经绞肉机绞碎成为粗糜浆，糜浆加水(1份粗糜浆+2份水)，再经胶体磨成为80目微细胶体浆液；\n[0047] (2)将胶体浆液调pH至7.0，加入胶体浆液原料重量的0.4％枯草杆菌中性蛋白酶(或胃蛋白酶，此时浆液调pH至5.0)，并与鱼内脏的内源酶(内源生物酶有脂肪酶、肝胰脏蛋白酶、肝胰脏淀粉酶、肠淀粉酶、几丁质酶等)复合，共同水解2小时，水解温度45℃，使下脚料中蛋白质大分子被水解成为大肽链分子，制成水解液；\n[0048] (3)制备种子液：同实施例1；\n[0049] (4)发酵：将步骤(2)中得到的酶解液加入发酵罐中，测定酶解液的含氮量，然后加入碳源面粉和蔗糖(面粉和蔗糖的重量比＝4∶1)，碳源的加入量为使发酵液体的氮碳比为5∶1，调pH至7.2，再将待发酵液在0.12～0.15MPa、121～125℃灭菌20～30分钟，冷却到25～35℃；加入种子液，种子液和发酵液的体积比为1∶10，发酵起始温度控制在30～32℃，发酵12小时后，开始通入无菌空气，通气速率为1.5L/min，使发酵体系得到充足的氧气，微生物进入有氧深层发酵30小时，控制反应体系温度在32～35℃，产生更多