一种脲酶抑制剂组合物

1.一种脲酶抑制剂组合物，其特征在于，包括醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮，所述醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:7；所述醋酸棉酚为棉籽加工过程中的副产物，醋酸
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棉酚的质量百分比含量为60%～100%；所述聚乙烯吡咯烷酮相对分子质量为8×10～
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1.3×10。
2. 根据权利要求1所述的脲酶抑制剂组合物，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮相对分子质量为10000～40000。
3.权利要求1所述脲酶抑制剂组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.按比例将醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮固体混合均匀后得混合物1，加入二氯甲烷，搅拌至混合物1完全溶解得混合体系；
或者，按比例准备醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮，将醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮分别溶于溶剂中后，再混合得混合体系；
S2. 将S1所得混合体系在60℃以下的较低温度下常压蒸至近干，或在抽真空的条件下干燥得混合物2；
S3.将S2所得混合物2放入烘箱中平衡脆化后研磨成粉状备用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S1所述溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、乙醇或丙酮。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2所述较低的温度为35℃～45℃。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S3所述烘箱的温度为40℃，平衡时间为24h。
7.权利要求3所述的制备方法制备得到的脲酶抑制剂组合物。

一种脲酶抑制剂组合物\n技术领域\n[0001] 本发明涉及肥料技术领域，具体涉及一种脲酶抑制剂组合物，更为具体地，涉及一种以棉酚为活性物质的脲酶抑制剂组合物。\n背景技术\n[0002] 尿素具有许多优良特性，是目前世界和我国农业生产中应用最广泛、数量最多的氮肥，约占50%的世界氮肥生产及消费市场，也是牛、羊、兔等反刍动物用来合成自身蛋白（MCP）的最廉价且广泛使用的非蛋白氮(NPN)饲料，同时也是人体和动物体中大量含氮化合物的代谢产物。作为化肥，它有促进穗大粒重，养根健叶、壮秆防倒伏的作用。尿素本身无毒，能够稳定地存在于水溶液中，但环境和生物体中广泛存在的脲酶（Urease）能将尿素迅速催化水解成NH3，其速度是未经催化水解的1014倍，极大地降低了动植物对氮素的利用，\n7 \n使尿素利用率通常只有30%～40%，全国每年因此损失化学氮素约1.0×10 t左右。尿素的快速分解，不仅造成农业资源的严重浪费，同时对人类、动物和植物等也有严重的危害：导致植物“烧苗”和亚硝酸盐污染农产品，增加农业成本，引起严重的环境氮污染和农村面源污染，并导致水体富营养化。因此，如何提高尿素利用率，解决脲酶所引起的经济、环境和健康等问题，已成为当前农、牧业生产上一个迫切需要解决的难题，也是当今世界经济和农业可持续发展上的一个挑战性课题。\n[0003] 脲酶的活性是影响尿素分解的最主要因素。在土壤中脲酶作用下，尿素水解为简单无机离子，水解的速度非常快，通常在15天内就接近完全水解。若要使尿素的分解速度与植物吸收氮的速度同步，关键是要控制能引起尿素分解的脲酶的活性。目前较为常用的做法是在尿素中添加适量脲酶抑制剂，脲酶抑制剂是对土壤脲酶活性有抑制作用的一类物质，它在短期内能延缓尿素的水解，减少氮的损失，添加适量脲酶抑制剂适当抑制土壤中脲酶的活性，以达到延缓尿素的水解，提高氮肥利用率的目的。\n[0004] 至今已使用过的脲酶抑制剂有100多种，主要分为Ag、Hg等金属盐、有机物小分子和植物提取物等三大类。由于金属盐毒性较大，限制了其应用；有机类则高残留、毒副作用大、易溶易流失、有效抑制时间短；而植物源脲酶抑制剂一般具有制剂成分复杂、不易标准化、发挥药效慢、活性成分易分解等缺点，不易为农民接受。\n[0005] 公开号为CN101687045A的发明专利公开了脲酶抑制剂的组合物，脲酶抑制剂主要为正丁基膦酰三胺(NBTP)、二氨基苯基磷酸酯(PPDA)或它们的混合物，稳定剂主要为聚乙二醇、丙三醇、一缩二丙二醇，或它们的混合物。公开号为CN101891546A的中国专利公开了一种具有脲酶抑制作用的包膜尿素，具有脲酶抑制作用的活性成份主要为黄腐酸、黑腐酸、腐植酸盐等。公开号为CN1781879A的中国专利公开了一种脲酶和硝化抑制剂组合型缓释尿素及其制备方法，所用脲酶抑制剂主要为N-甲基-2-吡咯烷酮。公开号为CN102249817A的中国专利公开了一种抑制土壤氮流失的制剂、制备其应用，脲酶抑制剂主要为氢醌。\n[0006] 棉酚大量存在于棉籽和棉根皮中，棉籽仁中的棉酚质量分数通常接近1%。长期以来，由于棉酚的原因，棉籽蛋白和棉籽油的应用受到很大限制。提取棉酚除可提供优质蛋白原料和食用油外，还可得到大量棉酚。棉酚低毒、无残留，但目前棉酚除少量用作避孕药外，用作其它药物的原料药尚在研究阶段和起步阶段，未见在肥料中使用棉酚作为脲酶抑制剂的报道。\n发明内容\n[0007] 本发明要解决的技术问题是针对现有脲酶抑制剂的不足，以及棉酚在脲酶抑制应用方面的技术不足，提供一种脲酶抑制剂组合物。\n[0008] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：\n[0009] 提供一种脲酶抑制剂组合物，包括醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），所述醋酸棉酚和PVP的质量比例为1:2～1:20。\n[0010] 所述醋酸棉酚是棉酚的衍生物，结构式见式（Ⅰ）所示：\n[0011] \n[0012] （Ⅰ）\n[0013] 优选地，所述醋酸棉酚和PVP的质量比例为1:5～1:14。\n[0014] 更为优选地，所述醋酸棉酚和PVP的质量比为1:7、1:9或1:13。\n[0015] 所述醋酸棉酚为棉籽加工过程中的副产物，醋酸棉酚的质量百分比含量为60%～\n100%，优选95%～98%.\n[0016] 优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮相对分子质量为8×103～1.3×106，优选10000～\n40000。\n[0017] 本发明同时提供所述脲酶抑制剂组合物的制备方法，包括以下步骤：\n[0018] S1.按比例将醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮固体混合均匀后得混合物1，加入二氯甲烷，搅拌至混合物1完全溶解得混合体系；\n[0019] 或者，按比例准备好醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮，将醋酸棉酚和聚乙烯吡咯烷酮分别溶于溶剂中后，再混合得混合体系；\n[0020] S2. 将S1所得混合体系在60℃以下的较低温度下常压蒸至近干，或在抽真空的条件下干燥得混合物2；\n[0021] S3.将S2所得混合物2放入烘箱中平衡脆化后研磨成粉状备用。\n[0022] S1所述溶剂可以采用二氯甲烷、二氯乙烷、乙醇或丙酮。溶剂的用量适量即可。\n[0023] S1所述溶剂优选二氯甲烷或乙醇。\n[0024] 优选地，所述溶剂二氯甲烷或乙醇的用量按照0.05g醋酸棉酚：10～20mL二氯甲烷确定。\n[0025] 优选地，S2所述较低的温度是指60℃以下，为有效防止棉酚在空气氧化或聚合，优选的温度为35℃～45℃。可以将S1所得混合体系置入恒温水浴锅中蒸干溶剂得混合物\n2，优选地，S2所述恒温水浴锅的温度为40℃。为了加快干燥速度，可采用真空干燥。\n[0026] 优选地，S3所述烘箱的温度为40℃，平衡时间为24h。\n[0027] S2和S3所述干燥和研磨方法可采用常规方法。\n[0028] 本发明抑制剂组合物优选为水剂或粉剂。\n[0029] 本发明的有益效果是：\n[0030] 棉酚低毒、无残留，但目前棉酚除少量用作避孕药外，用作其它药物的原料药尚在研究阶段。本申请人首次发现了醋酸棉酚具有脲酶抑制活性，在《醋酸棉酚对土壤脲酶活性的抑制作用》和《醋酸棉酚对土壤脲酶动力学特性的影响》中对醋酸棉酚的脲酶抑制动力学进行了总结，但是醋酸棉酚不易在水中分散，在高热、高湿、光照环境下均不稳定，不易保存，使用效果也不稳定，所以作为脲酶抑制剂的研究仍处于起步和实验室阶段，现有的实际应用存在很大困难，影响了实际应用，\n[0031] 本申请人经过创造性的研究结合多年的实验和实践总结，在本发明中提供了一种脲酶抑制剂组合物，发现了PVP和醋酸棉酚之间显著的增效作用，并找到了适宜的配伍比例，获得了很好的增效和增溶作用，得到的组合物比醋酸棉酚使用方便，粉剂更易保存，使用效果更好，克服现有脲酶抑制剂不易在水中分散，使用不便、毒性较高、有残留的技术不足，具有重要的实际推广应用价值。\n[0032] 本发明同时提供了所述抑制剂的制备方法，采用适宜的溶剂帮助醋酸棉酚和PVP组合物良好分散，制备方法简单易行，易于生产推广。\n附图说明\n[0033] 图1 7天内浊度与时间的关系图。\n[0034] 图2醋酸棉酚分散体的脲酶抑制活性。\n具体实施方式\n[0035] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。\n[0036] 实施例1 制备脲酶抑制剂\n[0037] 仪器：WGZ-2XJ细菌浊度计（仪）（上海昕瑞仪器仪表有限公司），HH-2型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司），DHG 9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）\n[0038] 试剂：醋酸棉酚（≥98.0%，陕西慈缘生物技术有限公司），PVP (K15)、PVP (K25)、PVP (K30)（阿拉丁试剂（上海）有限公司），二氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司），无水乙醇（南京化学试剂有限公司），脲（广东光华化学厂有限公司），尿素酶（activity＞4U/mg，上海金穗生物科技有限公司）。试验中所用试剂均为分析纯。\n[0039] 以下是本发明部分实施例：\n[0040] 抑制剂1的制备过程：\n[0041] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和0.35g的PVP (K15)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷12mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0042] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入40℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0043] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0044] 抑制剂2的制备过程：\n[0045] S1.准确称取0.05g醋酸棉酚和0.45g的PVP (K15)的固体，分别置于烧杯中，加入二氯甲烷12mL，搅拌至完全溶解后将两个烧杯中的溶液混合均匀得混合体系；\n[0046] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入45℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0047] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0048] 抑制剂3的制备过程：\n[0049] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和0.65g的PVP (K15)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷12mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0050] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入35℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0051] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0052] 1:2～1:20 1:5～1:14 1:7、1:9或1:13\n[0053] 抑制剂4的制备过程：\n[0054] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和0.70g的PVP (K15)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷12mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0055] S2. 将S1混合体系抽真空直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0056] S3.将S2所得混合物2放入45℃的烘箱中平衡23h脆化后研磨成粉状备用。\n[0057] 抑制剂5的制备过程：\n[0058] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和1g的PVP (K15)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷18mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0059] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入40℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0060] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0061] 抑制剂6的制备过程：\n[0062] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和0.1g的PVP (K15)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷13mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0063] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入40℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0064] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0065] 抑制剂7的制备过程：\n[0066] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和0.25g的PVP(K25)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷16mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0067] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入40℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0068] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0069] 抑制剂8的制备过程：\n[0070] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和0.05g的PVP(K30)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷10mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0071] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入40℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0072] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0073] 抑制剂9的制备过程：\n[0074] S1. 准确称取0.05g醋酸棉酚和1.25g的PVP(K15)的固体，在烧杯中混合均匀后，加入二氯甲烷20mL，搅拌至其完全溶解得混合体系；\n[0075] S2. 将S1盛有混合体系的烧杯放入40℃的恒温水浴锅中，直至溶剂蒸干得混合物2；\n[0076] S3.将S2所得混合物2放入40℃的烘箱中平衡24h脆化后研磨成粉状备用。\n[0077] 实施例2 抑制剂的性能检测\n[0078] 1. 脲酶抑制剂组合物在水中的分散实验，沉降性能的检测\n[0079] 分别取0.01g样品（实施例1制备的抑制剂1～9）于烧杯中，加入5mL蒸馏水，超声分散至溶液澄清后，将样液全部转移到测样瓶中。细菌浊度计预热30min后，进行调零与校正，放入装液的测样瓶，每隔一段时间读取浊度值（单位为MCF）及对应的电压值（单位mV），并绘图。醋酸棉酚分散体的沉降曲线见附图1所示。由附图1可见，0～7天内，通过浊度及其对应的电压数据分析得知，PVP对分散体的浊度变化基本不产生影响。在PVP-棉酚分散体中，随着PVP的量的增加，溶液越稳定。而且分散体的浊度与其溶液的颜色有明显的关系，由于PVP低含量的分散体中，棉酚所占比例较重，溶液的颜色也相对较深，因此其整体的浊度会较高PVP含量的高。\n[0080] 实施例3脲酶抑制剂组合物的脲酶抑制性能实验\n[0081] 1. 尿素酶液的配制 准确称取0.0190 g 尿素酶，在烧杯中用蒸馏水溶解，并将溶液移至25 mL容量瓶中，定容，过滤。移取20 mL滤液至100 mL容量瓶中，蒸馏水定容。\n[0082] 2. 反应液的配制 在50 mL的各个容量瓶中，分别加入不同浓度的抑制液和3 mL尿素酶液，将容量瓶置于温度37 ℃的水浴锅中预培养。1 h后，在容量瓶中加入些许pH7.0磷酸缓冲溶液及1 mL 10 %尿素，并磷酸缓冲溶液定容，置于37 ℃水浴锅中培养继续培养\n0.5 h。\n[0083] 3. 检测方法 以无尿素添加做参照，采用靛酚蓝分光光度法测定。分别在培养后的各容量瓶中取出2 mL溶液，置于已装有4mL苯酚钠溶液的50 mL容量瓶中，加入20 mL蒸馏水水，3 mL次氯酸钠，并用蒸馏水定容。将容量瓶置于37 ℃水浴锅中显色0.5 h，取出后冷却至室温，在分光光度计上波长630 nm处测定溶液的吸光度值AX，以显色剂作为参比，以没有添加抑制液为空白组A0。抑制率%=(A0- AX)/A0×100。剩余尿素回收率越高，表示脲酶抑制性能越强。实验结果见附图2所示。图2中CK为样品对照，即为醋酸棉酚：PVP=1：\n0，有醋酸棉酚，无PVP，CK的反应曲线见图2中最下面的一条线。由附图2可见，在试验培养时间里，CK处理下的尿素回收率从第2天的35.47 %下降到第5天的9.20 %，表明土壤脲酶活性的变化趋势，尿素回收率随之递减。在醋酸棉酚分散剂处理下，从第2天开始到第\n5天，质量比为1:7醋酸棉酚分散剂的情况表现为，各尿素回收率同比CK多51.48 %，63.14 %，65.85 %，53.86 %；质量比为1:9的情况表现为，各尿素回收率同比CK多69.95 %，50.82 %，24.95 %，17.57 %；质量比为1:13的情况表现为，各尿素回收率同比CK多65.51 %，34.32 %，24.34 %，16.74 %；三种不同质量比的醋酸棉酚分散剂对土壤脲酶活性具有明显的抑制效果。同样培养两天的处理下，质量比1:9和1:13的分散剂抑制下的尿素回收率最高，接近100 %，说明在该情况下土壤脲酶活性处于完全被抑制；而随着培养天数的增加，质量比\n1:7的分散剂的抑制对土壤脲酶活性的抑制优势更显著，培养5天的尿素回收率仍保持63 %以上，而1:9和1:13的分散剂的抑制情况在培养天数为四天时的尿素回收率已经低于32 %。