防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法

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技术领域\n本发明涉及一种防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法，属 于利用微生物防治土传植物病害的技术领域。\n背景技术\n棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起 的棉花上最为重要的世界性难治病害，目前仍没有有效的防治措施。 统计表明，我国每年棉花黄萎病发病面积约占播种面积的50％，年损 失近200万担，折合人民币10亿元，严重影响了棉花生产和纺织业 的发展。因此，控制棉花黄萎病的危害己成为生产上急需解决的问题。\n棉花黄萎菌是典型的土壤习居菌，其防治极其困难。该菌之所以 如此猖獗为害且难以防治，其主要原因是它能够在作物病残体上，甚 至直接在土壤中长期存活达十几年之久，且菌量可以常年积累，目前 的防治方法，包括应用抗病品种、化学药剂和农业措施，都不能达到 理想的防病效果。因为缺乏抗原育种材料，棉花抗黄萎病品种选育受 到限制；化学药剂防治一则防效欠佳，二则污染环境，破坏农田生态 平衡；农业措施中较为有效的是多年轮作，但在中国特定的农业环境 下，人多地少且作物种类单一，难以推广应用。\n利用微生物防治植物病害特别是土传植物病害是最有效的防治 措施之一，目前，经检索，尚未发现利用枯草芽孢杆菌(B.subtilis) 防治棉花黄萎病的报道。\n发明内容\n本发明所要解决的技术问题是提供一种防治棉花黄萎病的菌株 及其菌剂的制备方法。\n本发明解决其技术问题所采用的技术方案：\n一、防治棉花黄萎病的菌株：\nNCD-2菌株经API系统鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)。\n保藏日期：2003年10月15日，保藏单位名称及简称：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：1019。\n二、防治棉花黄萎病的菌剂的制备方法：\n该方法包括从原种开始，经三角瓶、种子罐、发酵罐的三级发酵 工艺，其特征在于：\n(1)用于接种的菌株为枯草芽孢杆菌NCD-2；\n(2)发酵温度、PH值及放罐条件：\nA.液体发酵的温度控制在28-37℃，优选30-32℃；初 始PH值控制在7.0-8.0，优选7.2-7.6；\nB.放罐条件：镜检观察到发酵液中芽孢产生率90％以上， 菌体浓度达到1010以上；\n发酵时间一般与培养基的组成、发酵温度、发酵罐的体积、通 气条件等有关。通常摇瓶和种子罐的培养时间为1.5-2天，发酵罐 的发酵时间为2-4天，总发酵时间约为一周。\n(3)将上述发酵液制成液体制剂或者固体制剂：\nA.液体制剂的制备：\n将发酵液与下列添加剂按配比要求复合制成液体制剂：\n几丁质      0.3％-0.5％Kg/L(发酵液体积)\n胶原蛋白    0.2％-0.5％Kg/L(发酵液体积)\n甲基纤维素  0.5％-1％Kg/L(发酵液体积)\nB.固体制剂的制备：\n将发酵液浓缩获得芽孢，再与固体填充物按照重量份数比 1∶1000的比例混合，然后经烘干和粉碎制成固体制剂。\n所述的固体填充物由膨润土和葡萄糖按下述重量百分比混合而 成：膨润土99.7％、葡萄糖0.3％。\n种子罐培养基各组分的重量百分比为：\n玉米粉     2.0％\n豆饼粉     2.0％\n麦麸       2.0％\nNa2HPO4    0.2％\nNaH2PO4    0.02％\nMgSO4      0.03％\nZnSO4      0.05％\nα-淀粉酶  3-5u/kg配料\n泡敌       0.02％\n发酵罐培养基各组份的重量百分比为：\n玉米粉    2.0％\n豆饼粉    2.0％\n麦麸      2.0％\nNa2HPO4   0.2％\nNaH2PO4   0.02％\nMgSO4     0.03％\nZnSO4     0.05％\nCaCO3     0.3％\nα-淀粉酶 3-5u/kg配料\n泡敌      0.02％\n枯草芽杆菌NCD-2菌种的筛选分离方法与过程：\n在棉花黄萎病缺乏防治措施的背景下，本发明人在国际上首先提 出“微菌核际”概念，并开展微菌核际微生物分离及拮抗微生物筛选 和应用。本发明人于1997年应用一般土壤细菌分离方式，对河北省 农林科学院植物保护研究所的连作20年棉田土壤中细菌进行了分 离，分离到2000余个细菌菌株，应用对峙培养方法初步测定其对大 丽轮枝菌(V.dahliae)菌丝生长的作用后发现，NCD-2菌株及其 他18个细菌菌株对大丽轮枝菌的微菌核和菌丝生长具有较强的抑制 作用。随后应用对峙培养方法对NCD-2菌株的抑菌作用进行了详细 研究，证明NCD-2菌株抑菌率为57.4％，同时产生明显的抑菌带达 7.0毫米。室内通过盆栽实验证明，用NCD-2菌株悬浮液(108菌体 /ml)对棉花种子浸种处理能够极显著地降低棉花黄萎病的病情指数， 防病效果达到77.0％。说明NCD-2菌株是一个非常有开发潜力的菌 株，1999年设置田间小区试验，试验方法如下：将NCD-2菌株悬 浮液(cfu为1010细菌/ml)，按照2∶1比例(菌液：包衣剂体积)与 包衣剂A充分混合制成包衣剂。以种子量10％(体积/重量)的包衣 剂对棉花种子进行包衣。将包衣的棉花种子播入营养钵中，每钵播3 粒种子，盖土并轻轻压实。播种期比当地棉花正常播种期提前10天， 播种后的营养钵放在塑料拱棚中，出苗一周后，每钵中留一棵壮苗。 在棉苗有2片真叶时，移栽到大田，移栽时，每穴中灌入20ml拮抗 细菌悬浮液(拮抗细菌活体浓度107细菌/ml)。以清水包衣种子，穴 中灌入清水为对照。每小区15m2，重复3次，随机排列。小区试验 结果表明NCD-2菌株处理能够防治棉花黄萎病，防病效果达78.1％， 从而确立了NCD-2菌株作为专门防治棉花黄萎病的生防菌株。随 后，2000-2002年，分别在河北省、山东省和新疆进行了多点小区 试验，主要应用NCD-2菌株固体制剂，使用方法为按种子量的10％ 进行均匀拌种后进行正常播种，防病效果达到56.3％-92.6％。\n本发明的菌株液体制剂使用方法如下：按种子量(脱绒种子)的 20％进行拌种、育苗，在移栽时应用该制剂的130倍水液蘸根。\n本发明的菌株固体制剂使用方法如下：按种子量的10％进行均匀 拌种后再进行正常播种。\n本发明提供的枯草芽孢杆菌NCD-2菌株经生物测定不仅对黄 萎菌及其微菌核具有强烈的抑制作用，而且对棉刺盘孢菌(棉花炭疽 病菌)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(棉花枯萎病菌)、玉米大斑凸脐蠕孢 菌(玉米大斑病菌)、玉蜀黍平脐蠕孢菌(玉米小斑病菌)、新月弯孢 霉(玉米弯孢霉叶斑病菌)、串珠镰刀菌(玉米茎基腐菌)、禾谷丝核 菌(小麦纹枯病菌)、禾谷镰刀菌(小麦赤霉病菌)、禾生炭疽菌(高 梁炭疽病菌)、轮纹大茎点菌(苹果轮纹病菌)、链格孢苹果专化型(苹 果斑点落叶病菌)、白腐盾壳霉(葡萄白腐病菌)、茄链格孢(番茄早 疫病菌)和葱链格孢(葱紫斑病菌)等14种主要农作物病原菌具有 抑菌作用，说明拮抗细菌NCD-2具有广谱性抑菌谱。生物安全性测 定结果表明NCD-2对目前国内主要种植作物(小麦、玉米、棉花、 马铃薯、黄瓜、茄子和大豆)是非致病的。另外，如果将本发明的枯 草芽孢杆菌NCD-2采用液体发酵的三级发酵工艺，并加入添加剂生 产该菌株的制剂，则更方便于大面积推广应用。\n本发明的有益效果将本发明的菌剂用于防治棉花黄萎病，防治效 果显著，防治效果达56.3％-92.6％，并且无污染、无公害、低成本、 便于大面积推广应用。\n枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株：\n保藏日期：2003年10月15日\n保藏单位名称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC)\n保藏号：1019\n保藏单位地址：中国北京市海淀区中关村北一条街13号中国科 学院微生物研究所\n具体实施方式\n实施例：枯草芽孢杆菌NCD-2菌株制剂的制备方法：\n严格按照上述发明内容部分中关于防治棉花黄萎病菌剂制备方 法中的工艺步骤操作，即可制取该菌株的液体或固体制剂。