一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条及其制备方法

1.一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条，其特征在于用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条由聚氯乙烯材料背衬(1)、样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)组成，在聚氯乙烯材料背衬(1)上依次连续粘附有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，所述结合垫(3)分别与所述硝酸纤维素膜(4)和样品垫(2)之间有搭接，所述硝酸纤维素膜(4)与所述吸水垫(5)之间有搭接；所述结合垫(3)上包被有金霉素单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜(4)上分别包被有金霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条，其特征在于硝酸纤维素膜(4)上包被的金霉素-载体蛋白偶联物中载体蛋白为牛血清白蛋白或者卵清蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条，其特征在于所述结合垫(3)上包被有金霉素单克隆抗体-胶体金标记物，其中金霉素单克隆抗体-胶体金标记物的包被量为0.1μg。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条，其特征在于所述硝酸纤维素膜(4)上分别包被有金霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线T和羊抗鼠IgG构成的质控线C，其中金霉素-载体蛋白偶联物的包被量为每毫米
0.05μg，羊抗鼠IgG的包被量为每毫米0.05μg。
5.如权利要求1所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条的制备方法是通过以下步骤实现的：一、金霉素-载体蛋白偶联物的合成：a、将邻联甲苯胺溶解于
0.2moL/L的0～4℃的HCl溶液中得浓度为5.5～5.6mg/mL的邻联甲苯胺溶液，然后向邻联甲苯胺溶液中逐滴加入NaNO2溶液，然后在4℃、避光条件下反应1h，得溶液A，其中控制邻联甲苯胺与NaNO2的质量比为1.4～1.5∶1；b、将金霉素和载体蛋白溶解于硼砂缓冲液中，然后再加入溶液A，避光反应2h，得金霉素免疫原溶液，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或者卵清蛋白，载体蛋白为牛血清白蛋白时，金霉素与牛血清白蛋白的质量比为
1∶1.8～1.9，载体蛋白为卵清蛋白时，金霉素与牛血清白蛋白的质量比为1∶1.0～11；
控制金霉素质量与硼砂缓冲液体积的比例为0.078g∶10mL，溶液A加入量与硼砂缓冲液的体积比为1∶2；c、在0～4℃条件下，用磷酸盐缓冲液缓冲液透析三天，控制6～8h更换透析液，然后将透析液以5000g的离心速度离分3～8min，取上清液，得金霉素-载体蛋白偶联物，所述金霉素-载体蛋白偶联物为金霉素-BSA偶联物或者金霉素-OVA偶联物；
二、将步骤一制备的金霉素-载体蛋白偶联物包被在硝酸纤维素膜(4)上构成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(4)上构成质控线；
三、制备金霉素单克隆抗体；
四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将金霉素单克隆抗体加入胶体金溶液中，制备得金霉素单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫(3)上；
五、在聚氯乙烯材料背衬(1)上依次连续粘附样品垫(2)、步骤四所得结合垫(3)、步骤二所得硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，再进行切割加工，即得用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤三中制备金霉素单克隆抗体的具体操作步骤如下：一、免疫小鼠：a、选取7～8周龄健康的BaLb/c小鼠，在小鼠的尾静脉采血，同时取血清做阴性对照；b、将具体实施方式三步骤一制备的100μg金霉素-BSA偶联物溶解于100μL生理盐水中，然后再与100μL等体积的弗氏佐剂混合乳化，然后在小鼠腹腔注射进行第一次免疫，注射剂量为0.2mL/只；c、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳化，然后在小鼠腹腔注射进行第二次免疫，注射剂量为0.3mL/只，然后每隔一周，采用相同的方法在小鼠腹腔注射进行免疫；d、第5次免疫后，小鼠尾静脉采血，用间接ELISA方法检测抗血清效价，同时取未免疫小鼠血清作阴性对照，抗血清效价达到1∶6400后，采取小鼠脾细胞；
二、细胞融合：a、将步骤一中采取的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞悬液按10∶1的体积比混合于50mL离心管中充分混匀，加入不完全RPMI-1640培养液，1000r/min离心10min，除净上清；b、将细胞沉淀分散在剩余液中，再置于37℃的水浴中，然后再向离心管中滴加
1mL、37℃的50％PEG4000，控制在1min内滴加完毕，再静置1min；c、向离心管中滴加20mL、
37℃的不完全RPMI1640培养液，控制加入方式为：第1min加入1mL，第2min加入4mL，第
3min加入15mL；d、将离心管在1000r/min离心速度下离心10min，弃上清液，再将沉淀细胞用不完全RPMI-1640培养液清洗一次，以除净PEG4000；然后将沉淀细胞分散于含20％胎牛血清的37℃的HAT选择培养液中，分散均匀的细胞悬液；e、将细胞悬液接种于已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养；
三、融合细胞的培养和筛选：a、培养至第7～10天后，进行培养液的更换或者补加，然后培养至第10～14天时，取上清液，用间接ELISA法检测确定为阳性的杂交瘤细胞孔，然后将为阳性的杂交瘤细胞孔中混匀的悬液取出10μL，然后用培养液稀释至10个细胞/mL，然后将稀释好的细胞悬液以100μL/孔的用量加入到含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；b、然后采用a中同样的方法操作，直至筛选出所有克隆的孔中杂交瘤细胞均为100％阳性为止；
四、腹水诱生制备单克隆抗体及抗体纯化：a、取步骤三筛选得到的杂交瘤细胞，离心，
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用PBS缓冲液清洗3次，然后稀释至10 个/mL得注射剂，将注射剂注入小鼠腹腔，注射1-2周后，腹腔膨大，然后采集腹水；b、在4℃、2500r/min离心速度条件下，离心10min，取上清液，然后采用辛酸-硫酸铵法纯化即得金霉素单克隆抗体；其中a中注射小鼠前一周，先在小鼠腹腔注射液体石蜡。
7.根据权利要求5或6所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤四中金霉素单克隆抗体-胶体金标记物的具体制备步骤如下：一、胶体金溶液的制备：按双蒸馏水和质量浓度为1％的氯化金按体积比为100∶1的比例将双蒸馏水和氯化金溶液混合，加热至沸腾，然后在沸腾状态下滴加质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，混合均匀，然后保持沸腾状态30min，冷却，即得胶体金溶液，其中柠檬酸钠溶液与氯化金溶液的体积比为2.5∶1；二、金霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备：
a、采用0.2M K2CO3调节步骤一得的胶体金溶液pH值为9.0，搅拌状态下向胶体金溶液中加入具体实施方式五步骤三制备的金霉素单克隆抗体，控制加入速度为1mg的蛋白质5min加完，加完后，搅拌30min，得胶体金标记金霉素单克隆抗体，其中保证胶体金标记金霉素单克隆抗体中蛋白量为11.4μg/mL；b、再加入牛血清白蛋白，控制牛血清白蛋白的加入量是a中胶体金标记金霉素单克隆抗体质量的1％，搅拌30min后，在4℃静置2h后，于4℃、离心速度为2000rpm条件下离心20min，去沉淀，然后上清液继续在4℃、离心速度为10000rpm条件下，离心1h，去上清液，沉淀即为合成金标抗体，然后将沉淀以溶于原体积1/10的量的胶体金稀释液中，即得金霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
8.根据权利要求7所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤二的具体操作步骤为：将羊抗小鼠IgG和具体实施方式五步骤一制得的金霉素-载体蛋白偶联物分别用0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释为
1.0mg/mL的羊抗鼠IgG溶液和1.0mg/mL的金霉素-载体蛋白偶联物溶液，然后用点膜机分别将羊抗鼠溶液和金霉素-载体蛋白偶联物溶液喷在硝酸纤维素膜4上构成质控线C和检测线T，控制羊抗鼠IgG的包被量为0.05μL/mm，金霉素-载体蛋白偶联物的包被量为0.05μL/mm，然后将硝酸纤维素膜4在37℃恒温箱中固定15min，然后再经封闭液封闭
30min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液冲洗3次后，37℃烘干即可。
9.根据权利要求5或6所述的一种用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于控制步骤五进行切割加工后得到的用于检测肉类及水产品中金霉素残留的免疫层析试纸条中结合垫3上金霉素单克隆抗体-胶体金标记物的包被量为
0.1μg。

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