针对制癌蛋白M(OSM)的抗原结合蛋白

1. 结合蛋白，其与OSM特异性结合且抑制OSM与gp130受体的结合但不与位点II 残基直接相互作用；其中所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:3的CDRH3、SEQ ID NO:2的CDRH2、SEQ ID NO:77的CDRH1、SEQ ID NO:4的CDRL1、SEQ ID NO:5的CDRL2和SEQ ID NO: 6的CDRL3。
2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有包含以下残基的重链构架：
2位Val、Ile或Gly
4位Leu或Val
20位Leu、Ile、Met或Val
22位Cys
24位Thr、Ala、Val、Gly或Ser
26位Gly
29位Ile、Phe、Leu或Ser
36位Trp
47位Trp
48位Ile、met、Val或Leu
69位Ile、Leu、Phe、Met或Val
71位Arg
78位Ala、Leu、Val、Tyr或Phe
80位Leu、Met
90位Tyr或Phe
92位Cys
94位Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白不经由CDR H1或CDR L2与OSM直接相互作用。
4.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其包含由SEQ ID NO:73编码的重链可变区和由SEQ ID NO:71编码的轻链可变区。
5.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:74的重链可变区和SEQ ID NO:72的轻链可变区。
6.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化抗体。
7.根据权利要求6所述的抗原结合蛋白，其中所述抗体是IgG1。
8.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中当与OSM结合时，共晶体包含具有a=168.525 A、b=81.614A、c=55.540 A且β=106.60度大小的单位晶胞。
9.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白额外地结合非人灵长类OSM。
10.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于40pm的亲和力结合OSM。
11.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在竞争ELISA测定中不与下列抗体竞争：所述抗体具有SEQ ID NO:79的重链和SEQ ID NO:80的轻链。
12.多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO:74的抗原结合蛋白的重链和/或编码根据SEQ ID NO:72的抗原结合蛋白的轻链。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的抗原结合蛋白或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗患有炎性病症或疾病的人患者的方法中的药物的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述炎性病症或疾病为炎性关节病、类风湿性关节炎、骨关节炎、特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化病(SS)、Sjogrens综合症、硬皮病和/或牛皮癣。

针对制癌蛋白M(OSM)的抗原结合蛋白\n发明领域\n[0001] 本发明涉及特异性结合制癌蛋白M(OSM)且特别是人OSM(hOSM)的免疫球蛋白。\n[0002] 本发明还涉及用所述免疫球蛋白治疗疾病或病症的方法，包含所述免疫球蛋白的药物组合物及制造方法。本发明的其他实施方案从下述说明将是显而易见的。\n[0003] 发明背景\n[0004] 制癌蛋白M为28 KDa糖蛋白，其属于细胞因子的白介素6(IL-6)家族，所述家族包括IL-6、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养蛋白-1(CT-1)和心肌营养蛋白-1样细胞因子(参见Kishimoto T等人(1995) Blood 86: 1243-1254)，其共享gp130跨膜信号传递受体(参见Taga T和Kishimoto T (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: \n797-819)。OSM最初由于其能够抑制黑色素瘤细胞系A375的生长而被发现(参见Malik N (1989)等人Mol Cell Biol 9: 2847-2853)。随后，发现了更多作用且发现其为多功能介质，类似于IL-6家族的其他成员。OSM在多种细胞类型中产生，包括巨噬细胞、活化T细胞 (参见Zarling JM (1986) PNAS (USA) 83: 9739-9743)、多形核中性粒细胞(参见Grenier A等人(1999) Blood 93:1413-1421)、嗜伊红细胞(参见Tamura S等人(2002) Dev. Dyn. \n225: 327-31)、树突状细胞(参见Suda T等人(2002) Cytokine 17:335-340)。其还在胰脏、肾、睪丸、脾、胃和脑(参见Znoyko I等人(2005) Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283: 182-186)以及骨髓(参见Psenak O等人(2003) Acta Haematol 109: 68-75)中表达。其主要生物学作用包括活化内皮(参见Brown TJ等人(1993) Blood 82: 33-7)、活化急性期反应(参见Benigni F等人(1996) Blood 87: 1851-1854)、诱导细胞增殖或分化、调节炎性介质释放和血细胞生成(参见Tanaka M等人(2003) 102: 3154-3162)、骨骼重塑(参见de Hooge ASK (2002) Am J Pathol 160: 1733-1743)和促进血管生成(参见Vasse M等人(1999) Arterioscler Thromb Vasc Biol 19:1835-1842)和伤口愈合。\n[0005] OSM的受体(OSM受体β，“OSMRβ”)在多种细胞上表达，所述细胞包括上皮细胞、软骨细胞、成纤维细胞(参见Langdon C等人(2003) J Immunol 170: 548-555)、神经元平滑肌、淋巴结、骨骼、心脏、小肠、肺和肾(参见Tamura S等人(2002) Mech Dev 115: \n127-131)和内皮细胞。若干证据表明内皮细胞是OSM的主要靶。这些细胞在OSM刺激后表达10至20倍更高数目的高亲和力受体和低亲和力受体且呈现深远和长期的表型改变(参见Modur V等人(1997) J Clin Invest 100: 158-168)。此外，OSM是卡波氏肉瘤细胞的主要自分泌生长因子，卡波氏肉瘤细胞被认为是内皮细胞来源的(参见Murakami-Mori K等人(1995) J Clin Invest 96:1319-1327)。\n[0006] 与其他IL-6家族细胞因子相同，OSM与跨膜转导传递糖蛋白gp130结合。gp130细胞因子的一个关键特征是形成包含gp130和一种或多种共受体(取决于配体)的寡聚受体复合物(综述于Heinrich PC等人(2003) Biochem J. 374: 1-20)。作为结果，取决于形成的受体复合物的组成，这些细胞因子可以在体外和体内介导共有和独特的生物学活性。\n人OSM(hOSM)与其他IL-6细胞因子的不同之处在于其可以与gp130和两种共受体(LIFR\n或制癌蛋白受体(OSMR))中的任一种形成复合物。图27说明hOSM与gp130、LIFR和OSMR\n之间的相互作用。\n[0007] 已经解析了hOSM的晶体结构且显示其包含具有2个潜在糖基化位点的四α螺旋束。已经通过hOSM分子上的定点诱变鉴定了两个独立的配体结合位点(参见Deller MC\n等人(2000) Structural Fold Des. 8:863-874)。称为位点II(有时称为“位点2”)的第一位点与gp130相互作用且在分子相对末端处的称为位点III(有时称为“位点3”)的第二位点与LIFR或OSMR相互作用。诱变实验已经显示LIFR和OSMR的结合位点几乎相同，\n但单氨基酸突变可以区分两者。\n[0008] 越来越多的证据支持下列假设：调节OSM-gp130相互作用可以有益于治疗RA和其他疾病和病症，尤其是慢性炎性疾病和病症，诸如骨关节炎、特发性肺纤维化、疼痛、炎性肺病、心血管疾病和牛皮癣。\n[0009] OSM在人RA 患者的SF中发现(参见Hui W等人(1997) 56: 184-7)。这些水\n平与下列相关：SF中的中性粒细胞数目、SF中的TNF α(有时称为"TNF")水平和软骨破坏标志物相关(Manicourt DH等人(2000) Arthritis Rheum 43: 281-288)。此外，来自RA患者的滑膜组织先体内后体外自发分泌OSM(参见Okamoto H等人(1997) Arthritis \nand Rheumatism 40: 1096-1105)。也已经表明OSM存在于滑液巨噬细胞中(Cawston TE等人(1998) Arthritis Rheum 41: 1760-1771)，且如先前所讨论的，OSM受体和gp130在内皮细胞、滑液成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞上表达。正常小鼠关节中鼠OSM(mOSM)的腺病毒表达导致严重炎性和侵蚀性关节炎(参见Langdon C等人(2000) Am J Pathol \n157: 1187-1196)。类似地，侵袭性疾病见于腺病毒mOSM递送之后无TNF、IL-1、IL-6和iNOS的基因敲除小鼠中(参见de Hooge ASK等人(2003) Arthritis and Rheumatism \n48:1750-1761)，表明OSM可以介导关节炎病理学的所有实施方案。使用腺病毒表达的mOSM载体来表达小鼠OSM导致作为幼年特发性关节炎的典型特征的生长板破坏(参见de Hooge ASK等人(2003) Arthritis and Rheumatism 48:1750-1761)。在胶原蛋白诱导的关节炎的实验模型中，治疗性施用于小鼠的抗OSM抗体防止疾病的所有进一步进展。当将抗OSM预防性施用于患有降植烷(pristane)诱导的关节炎的小鼠(模拟人疾病的复发/缓解模型)时，发现类似结果(参见Plater-Zyberk C等人(2001) Arthritis and Rheumatism 44:\n[0010] 骨关节炎是影响关节的病况。骨关节炎具有3个特征。其引起软骨(使骨骼成排且使关节能够在无摩擦情况下容易地移动的坚固光滑表面)的损伤。其导致关节边缘周围形成骨骼生长且其引起关节周围组织的轻度炎症(滑膜炎)。已经证明OSM在软骨损坏、炎症和骨骼转换中起重要作用，且因此阻断该细胞因子可以在疾病发病机制的关键方面中起作用。OSM与IL-1或TNF协同作用以诱导人鼻软骨中的胶原溶解，其涉及蛋白聚糖(PG)和胶原蛋白的损失，后者与诱导MMP-1和MMP-13相关。OSM与IL-1还将诱导人关节软骨的PG损失，但胶原蛋白损失的增加并不显著。(Morgan等人2006)许多使用腺病毒载体增加关节细胞因子浓度的研究已经显示OSM过表达将诱导炎症、关节翳形成、软骨破坏和骨侵蚀。\n(Langdon等人2000)。总而言之，文献提出，OSM，尤其当与其他细胞因子组合时，诱导参与导致软骨降解和骨侵蚀的蛋白聚糖和胶原蛋白分解的蛋白酶。\n[0011] 来自文献的信息表明，OSM分子可能在一定程度上参与和牛皮癣相关的炎性过程。\nBoifati等人(1998)的工作已经显示，与非病变性牛皮癣皮肤和正常皮肤相比，牛皮癣病变的器官培养物中OSM的自发性释放增加。(Kunsfeild等人2004)角质细胞表达该分子\n的受体且响应于该配体，其引起角质细胞迁移且增加重构表皮的厚度。比较OSM与33种不同细胞因子的基因调节作用的微阵列分析表明，OSM是有效的角质细胞活化剂且在分子诸如S100A7的诱导和β-防卫素2表达(牛皮癣皮肤的特征)中可以与促炎性细胞因子协\n同作用。(Gazel等人2006)。\n[0012] 文献中还提出了OSM在炎性肺病诸如哮喘和肺纤维化中的作用。这些疾病的特征在于细胞外基质(ECM)的沉积增加，伴有上皮下成纤维细胞的增殖和活化。已经在急性肺损伤期间(尤其在肺炎的情况下)患者的支气管肺泡灌洗液中检测到OSM(Grenier等人\n2001)。\n[0013] 已经在MS患者脑中检测到OSM，其位于微神经胶质细胞、星形胶质细胞和浸润性白细胞(Ruprecht等人2001)。此外，与来自健康对照的细胞相比，从MS患者分离的PBMC自发地释放更多细胞因子，包括OSM，且MS患者显示血清[OSM]增加的趋势(Ensoli等人\n2002)。\n[0014] 除促进脑部炎症以外，OSM可以直接促成神经退化，这是阿尔兹海默氏病、MS和一部分HIV患者的特征。来自HIV患者的单核细胞上清液引起深度神经母细胞生长抑制和神经元细胞死亡。这些作用是由培养物上清液中的制癌蛋白M介导的(Ensoli等人1999)。\n因为许多HIV患者患有由神经元细胞损失引起的脑萎缩，所以OSM可以是该病理学的一种介质。\n[0015] Tamura等人的工作表明，OSM可能参与神经痛的发展和维持(2003)。其研究揭示了一部分表达OSMβ受体的疼痛感受性感觉神经元。所有OSMβR+ve神经元还表达VR1和P2X3受体，已经显示VR1和P2X3受体对神经病性疼痛和炎性疼痛的发展是关键的(Jarvis等人2002, Walker等人2003)。也已经显示OSM -/-小鼠对化学、热、内脏和机械疼痛显示的有害反应降低(Morikawa等人2004)。有趣的是，这些动物缺乏VR1+、P2X3+小型神经元，但在其他方面所述动物表现正常。\n[0016] 文献中也已经提出支持OSM调节癌细胞生物学的作用。已经报道了在使用肿瘤细胞系的研究中OSM具有生长刺激和生长抑制特性(Grant和Begly 1999)。其为卡波氏肉瘤衍生的细胞(Miles等人，1992)和骨髓瘤细胞系(Zhang等人，1994)的有效促分裂原。OSM降低多种肿瘤细胞系(包括乳(Douglas等人，1998)和肺(McKormick等人，2000))的生长速率且增加其分化。然而，尽管OSM可以抑制生长(至少在一些乳癌细胞系中)，但其增加细胞分离且增强转移潜能(Holzer等人2004, Jorcyk等人2006)。在一些肿瘤细胞系中，OSM还上调透明质酸受体CD44的表达和活化状态(Cichy等人，2000)，透明质酸受体CD44与肿瘤生长和转移相关(Yu等人1997)。此外，OSM的血管生成特性和其诱导一些肿瘤细胞中的其他血管生成因子的能力(Repovic等人，2003)表明，其可以促进那些表达OSM的肿瘤中的肿瘤血管生成。科学文献提出OSM参与肿瘤生物学，但指出其复杂性。OSM中和作用可能对治疗一些肿瘤是有益的。另一方面，类似于TNF和IL-6中和作用，其在其他方面具有一定潜在风险。\n[0017] 来自文献的证据表明OSM在心血管疾病中的潜在作用。在动脉粥样硬化病变中的组织巨噬细胞中发现OSM(Modur等人，1997)且其作为血管生成因子(Vasse等人，1999)可以促进认为有助于血管壁脆性的动脉粥样硬化斑块特征性的新血管形成。然而，OSM还诱导内皮细胞中的其他血管生成因子，VEGF(Wijelah等人，1997)和bFGF(Bernard等人，\n1999)的表达。有趣的是，人内皮细胞的OSM受体密度是其他细胞的约10-20倍(Brown等人1991)。\n[0018] 因此，本发明的一个目标是提供治疗RA和其他疾病和病症、尤其是慢性炎性疾病和病症(诸如骨关节炎、特发性肺纤维化、癌症、哮喘、疼痛、心血管病和牛皮癣)的治疗方法。具体而言，本发明的一个目标是提供特异性结合OSM(例如hOSM，尤其是其位点II)且调节(即抑制或阻断)OSM与gp130之间相互作用的免疫球蛋白，尤其是抗体，其用于治疗对该相互作用的调节响应的疾病和病症。\n[0019] 在WO99/48523中，我们公开了OSM拮抗剂在治疗炎症疾病和病症中的用途。本公开在关节炎鼠动物模型中使用了抗-小鼠OSM抗体。\n[0020] 本说明书中公开的所有专利和参考文献清楚且完全通过引用并入本文。\n[0021] 附图概述\n[0022] 图1：人gp130 ELISA - 10G8、9G2、3E3和2B7对人OSM与人gp130的结合的抑制。\n出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表四次测定重复中的一次。\n[0023] 图2：KB细胞测定 - 10G8、9G2、3E3和2B7对人OSM的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0024] 图3：KB细胞测定 - 在25%人AB血清存在的情况下10G8、9G2、3E3和2B7对人\nOSM的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表两次测定重复中的一次。\n[0025] 图4：内源OSM人gp130测定 - 10G8、9G2、3E3和2B7抗体对内源人OSM与人gp130的结合的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(110)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表两个供体中的一个。\n[0026] 图5：KB细胞测定 - 10G8、9G2、3E3和2B7对人LIF缺乏抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。市售抗人LIF mAb(R&D Systems，MAB250)用作阳性对照。工具抗体用作阴性对照。\n[0027] 图6：KB细胞测定 - 10G8、9G2、3E3和2B7对狨猿OSM的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表两次测定重复中的一次。\n[0028] 图7：2B7、3E3、9G2和10G8杂交瘤的VH序列的比较。小框中的残基代表与大多数的差异。跨越序列的大框代表CDR。\n[0029] 图8：2B7、3E3、9G2和10G8杂交瘤的VL序列的比较。小框中的残基代表与大多数的差异。跨越序列的大框代表CDR。\n[0030] 图9：可变轻链的序列分析 - 10G8、9G2、3E3和2B7与非竞争性抗OSM小鼠亲本抗体15E10比较。\n[0031] 图10：可变重链的序列分析 - 10G8、9G2、3E3和2B7与非竞争性抗OSM小鼠亲本抗体15E10比较。\n[0032] 图11：直接人OSM结合ELISA - 10G8和9G2嵌合体与15E10嵌合体(15E10c)的\n人OSM结合的比较。\n[0033] 图12：人gp130 ELISA - 10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体对人OSM与人gp130的结合的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0034] 图13：KB细胞测定 - 10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体对人OSM的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0035] 图14：KB细胞测定 - 在25%人AB血清存在的情况下10G8、10G8嵌合体、9G2和\n9G2嵌合体对人OSM的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0036] 图15：内源OSM人gp130测定 - 10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体抗体对内源人OSM与人gp130的结合的抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。\n工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表两个供体中的一个。\n[0037] 图16：人LIF KB细胞测定 - 10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体对人LIF无抑制。出于比较的目的，添加非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)。抗人LIF抗体(MAB250, R&D Systems)用作阳性对照。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0038] 图17：KB细胞测定 - 人源化10G8 L1和L4变体对人OSM的抑制。添加15E10h\n用于比较。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0039] 图18：人gp130 ELISA - 人源化10G8 H0L1、H1L1和H2L1变体对人OSM与人gp130的结合的抑制。添加15E10h用于比较。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表两次测定重复中的一次。\n[0040] 图19：人OSM-10G8 mAb结合复合物 - 人OSM与10G8 mAb轻链和重链的结合。显示OSM受体结合位点(位点II和位点III)。对于各位点列出受体结合区中重要的氨基酸\n残基。\n[0041] 图20：KB细胞测定 - 人源化10G8 H0L1 CDRH1和CDRL2变体抗体对人OSM的抑\n制。添加15E10h用于比较。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0042] 图21：人gp130 ELISA - 10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(huCDRH1)L1对人OSM与人gp130的结合的抑制。添加15E10h用于比\n较。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0043] 图22：KB细胞测定- 10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(huCDRH1)L1对人OSM的抑制。添加15E10h用于比较。显示的数据代表三\n次测定重复中的一次。\n[0044] 图23：KB细胞测定- 在25%人AB血清存在的情况下，10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(H1)L1对人OSM的抑制。添加15E10h用于\n比较。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表两次测定重复中的一次。\n[0045] 图24：内源OSM人gp130测定 - 10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(huCDRH1)L1对内源人OSM与人gp130的结合的抑制。添加\n15E10h用于比较。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表四个供体中的一个。\n[0046] 图25：人LIF KB细胞测定 - 10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)、H0(huCDRH1)L1对人LIF无抑制。添加15E10h用于比较。抗人LIF抗体(MAB250, R&D Systems)用作阳性对照。工具抗体用作阴性对照。显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0047] 图26：人原代肝细胞测定 - H0(huCDRH1)L1对(A)3 ng/ml和(B)10 ng/ml人OSM刺激的人肝细胞释放血清淀粉样蛋白A(SAA)的抑制。出于比较的目的，添加人源化15E10。\n显示的数据代表三个肝细胞供体中的一个。\n[0048] 图27：人原代肝细胞测定 - H0(huCDRH1)L1对(A)3 ng/ml和(B)10 ng/ml人OSM刺激的人肝细胞释放C-反应性蛋白(CRP)的抑制。出于比较的目的，添加人源化15E10。\n显示的数据代表三个肝细胞供体中的一个。\n[0049] 图28：人RA成纤维细胞样测定 - H0(huCDRH1)L1对(A)0.3 ng/ml和(B)3 ng/\nml人OSM刺激的人RA成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS-RA)细胞释放IL-6的抑制。出于比较\n的目的，添加人源化15E10。显示的数据代表三个HFLS-RA供体中的一个。\n[0050] 图29：人RA成纤维细胞样测定 - H0(huCDRH1)L1对(A)0.3 ng/ml和(B)3 ng/\nml人OSM刺激的人RA成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS-RA)细胞释放MCP-1的抑制。出于比\n较的目的，添加人源化15E10。显示的数据代表三个HFLS-RA供体中的一个。\n[0051] 图30：人脐静脉内皮细胞测定 - H0(huCDRH1)对(A)30 ng/ml和(B)100 ng/ml人OSM刺激的人脐静脉内皮细胞释放IL-6的抑制。出于比较的目的，添加人源化15E10。\n显示的数据代表三次测定重复中的一次。\n[0052] 图31：人肺成纤维细胞测定 - H0(huCDRH1)L1对人OSM刺激的人肺成纤维细胞释放MCP-1的抑制。出于比较的目的，添加人源化15E10。显示的数据代表(A)1名健康供体和(B)1名IPF供体。\n[0053] 图32：人肺成纤维细胞测定 - H0(huCDRH1)L1对人OSM刺激的人肺成纤维细胞释放IL-6的抑制。出于比较的目的，添加人源化15E10(标记为抗体X)。显示的数据代表(A)1名健康供体和(B)1名IPF供体。\n[0054] 图33：CDRH3变体结合数据 - 对于CDRH3中发现的残基进行丙氨酸扫描。提供的数据显示这种残基的变化如何影响结合亲和力。\n[0055] 图34：hOSM与gp130、LIFR和OSMR之间的相互作用的说明。\n[0056] 抗体命名法 - 为了避免引起疑问，15E10h和人源化15E10涉及相同抗体且在一些图中标记为抗体X。10G8/A9和10G8也涉及相同抗体。\n[0057] 发明概述\n[0058] 本发明提供了能够与OSM结合的抗原结合蛋白，例如与OSM特异性结合且抑制OSM与gp130受体的结合但不与位点II 残基直接相互作用的抗体。\n[0059] 本发明的OSM抗体涉及或源自鼠mAb 10G8。10G8鼠重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 26提供并且10G8鼠轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 28提供。\n[0060] 本发明的重链可变区(VH)可以包含以下CDR或这些CDR的变体 (如Kabat \n(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)所定义) ：\n[0061] SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO 77 的CDRH1\n[0062] SEQ ID NO. 2的CDRH2\n[0063] SEQ ID NO. 3的CDRH3。\n[0064] 本发明的轻链可变区(VL)可以包含以下CDR或这些CDR的变体(如Kabat (Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)所定义)：\n[0065] SEQ ID NO. 4的CDRL1\n[0066] SEQ ID NO. 5 或SEQ ID NO 78的CDRL2\n[0067] SEQ ID NO. 6的CDRL3。\n[0068] 本发明也提供了编码本文所述的任何抗原结合蛋白的重链的多核苷酸序列，和编码本文所述的任何抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。这样的多核苷酸代表与等效多肽序列相对应的编码序列，但是，应该理解，可以将这样的多核苷酸序列连同起始密码子、适当的信号序列和终止密码子一起克隆进表达载体中。\n[0069] 本发明也提供了转化的或转染的重组宿主细胞，其包含一种或多种编码本文所述的任何抗原结合蛋白的重链和或轻链的多核苷酸。\n[0070] 本发明进一步提供了用于产生本文所述的任何抗原结合蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：在合适的培养基(例如无血清的培养基)中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码本文所述的任何抗原结合蛋白的重链的多核苷酸，且所述第二载体包含编码本文所述的任何抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。\n[0071] 本发明进一步提供了药物组合物，其包含本文所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。\n[0072] 在进一步的方面，本发明提供了治疗或预防响应于hOSM和gp130之间相互作用的调节的疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的其抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0073] 因此，本发明的一个目标是提供治疗RA和其他疾病和病症、尤其是慢性炎性疾病和病症(诸如骨关节炎、特发性肺纤维化、疼痛、炎性肺病、心血管病和牛皮癣)的治疗方法。具体而言，本发明的一个目标是提供特异性结合OSM(例如hOSM，尤其是其位点II)且调节(即抑制或阻断)OSM与gp130之间相互作用的免疫球蛋白，尤其是抗体，其用于治疗对该相互作用的调节响应的疾病和病症。在本发明的另一个方面，提供了治疗患有炎性疾病或病症的人患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。在本发明的另一个方面，提供了使抗体人源化的方法，所述方法包括以下步骤：获得与靶抗原结合的非人抗体，获得抗体-抗原共晶体的晶体结构，从该晶体结构将直接参与与抗原结合的非人抗体的残基确定至约2-5Å ，将一个或多个不参与结合的残基突变至源自人序列的残基，且回收所述抗体。\n[0074] 发明详述\n[0075] 本发明提供了与OSM特异性结合的抗原结合蛋白，例如其特异性结合人\nOSM(hOSM)且抑制OSM与gp130受体的结合但不与位点II 残基直接相互作用。\n[0076] 如本文所述的本发明的进一步方面，抗原结合蛋白不与残基Q20、G120、Q16、N124直接结合。\n[0077] 如本文所述的本发明的进一步方面，提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与OSM特异性结合，例如特异性结合人OSM(hOSM)，抑制OSM与gp130受体的结合且与hu OSM的残基82、83、84、90、94、112、115、122、123、152的一个或多个相互作用。\n[0078] 在一个这样的方面，本发明提供了与OSM特异性结合的抗原结合蛋白，例如所述抗原结合蛋白特异性结合人OSM (hOSM)，抑制OSM与gp130受体的结合但不与位点II 残基直接相互作用且在竞争ELISA测定中不与下列抗体竞争，所述抗体具有SEQ ID NO.79的重链和SEQ ID NO. 80的轻链。\n[0079] 在一个这样的方面，本发明提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与如本文所述的抗原结合蛋白竞争与OSM的结合，例如与人OSM的结合。\n[0080] 在另一个方面，抗原结合蛋白以高亲和力与人OSM结合，例如当通过Biacore测定时，抗原结合蛋白以下列亲和力与人OSM 结合：500pM或更低的亲和力或400pM或更低、或\n300pM或更低、或250pM或更低、或200pM或更低、或例如140pM或更低的亲和力。在进一步实施方案中，抗原结合蛋白与人OSM 结合，当通过Biacore测定时，亲和力为约100pM和约\n500pM之间或约100pM和约300pM之间、或约100pM和约250pM之间、或约100pM和约200pM之间。在本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白以低于250pm 的亲和力结合OSM。在本发明的进一步实施方案中，抗原结合蛋白以低于140pm 的亲和力结合OSM 。\n[0081] 在一个这样的实施方案中，这通过Biacore测量，例如如实施例2.5.1中所述。\n[0082] 在另一个方面，抗原结合蛋白以高亲和力与人OSM结合，例如当通过基于溶液的Kinexa方法测定时，抗原结合蛋白以下列亲和力与人OSM结合：200pM或更低的亲和力或\n150pM或更低、或100pM或更低、或50pM或更低、或例如40pM或更低的亲和力。在进一步实施方案中，抗原结合蛋白与人OSM 结合，当通过Kinexa测定时，亲和力为约10pM和约\n200pM之间或约10pM和约150pM之间、或约10pM和约100pM之间、或约10pM和约70pM之\n间或约10pM和约40pM之间。在本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白以低于70pm 的亲和力结合OSM。在本发明的进一步实施方案中，抗原结合蛋白以低于40pm 的亲和力结合OSM 。\n[0083] 在一个这样的实施方案中，这通过Kinexa测量，例如如实施例2.5.1中所述。\n[0084] 在另一个方面，抗原结合蛋白与人OSM 结合并且在细胞中和测定中中和OSM，其中抗原结合蛋白具有下列的IC50：约10pM和约200pM之间、或约10pM和约150pM之间、或约10pM和约100pM之间、或约20pM和约100pM之间、或约20pM和约100pM之间。在本发\n明的进一步实施方案中，抗原结合蛋白结合OSM并且在细胞中和测定中中和OSM，其中抗原结合蛋白具有约20pM的IC50和低于140pm 的亲和力。\n[0085] 在一个这样的实施方案中，这通过细胞中和测定测量，例如如实施例2部分2.2.1中所述。\n[0086] 在一个方面，本发明进一步提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO. 3的CDRH3或SEQ ID NO. 3的变体，其中CDRH3被如下所述的在下列位置的一个或多个的可替代的氨基酸所取代(使用Kabat编号)：\n[0087] 95位被取代为Ala、Glu、Gly、His、Leu、Met、Pro、Gln、Ser、Thr或Val\n[0088] 96位被取代为Ala、Cys、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Ser、Thr、Trp或Tyr\n[0089] 97位被取代为Ala、Cys、Phe、Met或Ser\n[0090] 98位被取代为Ala、Asp、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln或Trp\n[0091] 99位被取代为Ala、Cys、Pro、Ser、Val或Tyr\n[0092] 100B位被取代为Glu\n[0093] 100C位被取代为Ala、Glu、Phe、Gly、Val或Trp\n[0094] 100D位被取代为Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Leu、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr[0095] 101位被取代为Glu、Gly、Ser、Thr或 Val\n[0096] 102位被取代为Ala、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser Tyr、His、Ile、Asp或Trp。\n[0097] 在本发明的进一步方面，抗原结合蛋白包含：\n[0098] i) 如SEQ ID NO. 3中所述CDRH3或SEQ ID NO. 3的变体，其中Val 102被取代为Tyr、His、Ile、Ser、Asp或Gly。\n[0099] ii) 如SEQ ID NO. 2中所述CDRH2或SEQ ID NO. 2的变体，其中Thr50被取代\n为Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val和/或Ile51被取代为Leu、Val、Thr、Ser或Asn和/或Ser52被取代为Phe、Trp或His和/或Gly53被取代为Asp、Ser或Asn和/或Gly54被\n取代为Ser和/或Phe56被取代为Ser、Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg和/或Tyr58被取代为\nGly、His、Phe、Asp或Asn。\n[0100] iii) 如SEQ ID NO. 4中所述CDRL1或SEQ ID NO. 4的变体，其中Ser27A被取代为Asn、Asp、Thr 或Glu和/或Ser 27C被取代为Asp、Leu、Tyr、Val、Ile、Asn、Phe、His、Gly或Thr和/或Asn 31被取代为Ser、Thr、Lys或Gly和/或Phe32被取代为Tyr、Asn、\nAla、His、Ser或Arg和/或Met 33被取代为Leu、Val、Ile或Phe。\n[0101] iv) 如SEQ ID NO. 6中所述CDRL3或SEQ ID NO. 6的变体，其中Leu89被取代\n为Gln、Ser、Gly或Phe和/或His90被取代为Gln或Asn，Ser 91被取代为Asn、Phe、Gly、Arg、Asp、His、Thr、Tyr或Val和/或Arg92被取代为Asn、Tyr、Trp、Thr、Ser、Gln、His、ala或Asp和/或Glu93被取代为Asn、Gly、His、Thr、Ser、Ar或Ala和/或Phe96被取代\n为Pro、Leu、Tyr、Arg、Ile或Trp。\n[0102] 在又进一步方面，抗原结合蛋白进一步包含：\n[0103] v) 如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 78中所述CDRL2\n[0104] 在又进一步方面，抗原结合蛋白进一步包含：\n[0105] vi) 如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77中所述CDRH1或SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77的变体，其中Tyr 32被取代为Ile、His、Phe、Thr、Asn、Cys、Glu或Asp和/或Ala \n33被取代为Tyr、Trp、Gly、Thr、Leu或Val和/或Met 34被取代为Ile、Val或Trp和/或Ser 35被取代为His、Glu、Asn、Gln、Tyr或Thr。\n[0106] 已经使用诱变和或经典技术确定用于CDR的L1、L2、L3、H1和H2的变体CDR序\n列。互补性决定区(CDR) L1、L2、L3、H1和H2趋于在结构上表现出有限数目的主链构象之一。通过CDR长度并通过环包裹(loop packing)二者来定义CDR的特定规范结构类型，其通过位于CDR和构架区二者内的关键位置的残基来决定(结构决定残基或SDR)。Martin\n和Thornton(1996；J Mol Biol 263:800-815)已经生成了定义"关键残基"规范模板\n(canonical template)的自动方法。用簇分析(cluster analysis)来定义CDR组的规范类别(canonical class)，然后通过分析埋入的疏水氢-键合的残基和保守的甘氨酸和脯氨酸来鉴定规范模板。可通过将序列与关键残基模板比较，并用同一性或相似性矩阵为每一个模板记分，将抗体序列的CDR指定为规范类别。\n[0107] 在一个方面，本发明提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ. ID. NO:3的CDR H3、SEQ. ID. NO:2的CDRH2、SEQ. ID. NO:4的CDRL1和SEQ. ID. NO:6的CDRL3\n且可以进一步包含SEQ. ID. NO:1或SEQ ID NO 77的CDR H1和SEQ. ID. NO:5或SEQ ID NO. 78的CDRL2。\n[0108] 在另一个方面，抗原结合蛋白包含SEQ. ID. NO:3的CDR H3、SEQ. ID. NO:2的CDRH2、SEQ. ID. NO:4的CDRL1、SEQ. ID. NO:5的CDRL2和SEQ. ID. NO:6的CDRL3。\n[0109] 在又另一个方面，抗原结合蛋白包含SEQ. ID. NO:3的CDR H3、SEQ. ID. NO:2的CDRH2、SEQ. ID. NO:1的CDR H1、SEQ. ID. NO:4的CDRL1、SEQ. ID. NO:5的CDRL2和SEQ. ID. NO:6的CDRL3。\n[0110] 在又另一个方面，抗原结合蛋白包含SEQ. ID. NO:3的CDR H3、SEQ. ID. NO:2的CDRH2、SEQ. ID. NO:1的CDR H1、SEQ. ID. NO:4的CDRL1、SEQ. ID. NO:78的CDRL2和SEQ. ID. NO:6的CDRL3。\n[0111] 在又另一个方面，抗原结合蛋白包含SEQ. ID. NO:3的CDR H3、SEQ. ID. NO:2的CDRH2、SEQ. ID. NO:77的CDR H1、SEQ. ID. NO:4的CDRL1、SEQ. ID. NO:5的CDRL2和SEQ. ID. NO:6的CDRL3。\n[0112] 在又另一个方面，抗原结合蛋白包含SEQ. ID. NO:3的CDR H3、SEQ. ID. NO:2的CDRH2、SEQ. ID. NO:77的CDR H1、SEQ. ID. NO:4的CDRL1、SEQ. ID. NO:78的CDRL2和SEQ. ID. NO:6的CDRL3。\n[0113] 在本发明的一个方面，抗原结合蛋白不经由CDR H1与OSM直接相互作用。\n[0114] 在一个方面，抗原结合蛋白不经由CDR H1或CDR L2与OSM直接相互作用。\n[0115] 本发明的抗原结合蛋白可包含本发明重链可变区和轻链可变区，可将所述可变区安排到天然抗体或其功能片段或等同物的结构中。因此，本发明抗原结合蛋白当与恰当的’\n轻链配对时，可包含安排到全长抗体、其(Fab )2片段、Fab片段或等同物(诸如scFV、双链抗体(bidody)、三链抗体或四链抗体、Tandabs等)中的本发明的VH区。抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；IgA、IgE或IgD或其修饰变体。抗体重链的恒定结构域可相应选择。轻链恒定结构域可以是κ或λ恒定结构域。此外，抗原结合蛋白可包含所有类别的修饰，例如IgG二聚体、不再结合Fc受体或介导C1q结合的Fc突变体。抗原结合蛋白还可以是WO86/01533中所述类型的嵌合抗体，其包含抗原结合区和非免疫球蛋白区。\n[0116] 根据所需的任何功能来选择恒定区。IgG1可通过与补体的结合来显示溶胞能力和/或介导ADCC (抗体依赖性细胞毒性)。如果需要非细胞毒性阻断抗体，可使用IgG4。然而，IgG4抗体在生产中可显示不稳定性，因此，一种备选是修饰通常更稳定的IgG1。推荐的修饰在EP0307434中描述，例如在235和237位上的突变。因此，本发明提供抗原结合蛋白的溶胞或非溶胞形式，例如本发明的抗体。\n[0117] 在某些形式中，本发明抗体是具有任一种本文所述重链可变区的全长(例如H2L2四聚体)溶胞或非溶胞IgG1抗体。\n[0118] 本发明的抗原结合蛋白源自具有如SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:28所述的可变区的鼠抗体或其非鼠等同物，诸如其大鼠、人、嵌合或其人源化变体，例如，它们源自具有如SEQ ID NO:54 和 SEQ ID NO:62所述的重链和轻链的人源化抗体。\n[0119] 在本发明的一个方面，提供了包含分离的重链可变结构域的抗原结合蛋白，所述分离的重链可变结构域选自下列中任何种：SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 56、SEQ ID NO.58或SEQ ID NO:74。\n[0120] 在本发明的另一个方面，提供了包含分离的轻链可变结构域的抗原结合蛋白，所述分离的轻链可变结构域选自下列中任何种：SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO.66或SEQ ID NO:68。\n[0121] 在本发明的进一步方面，提供了包含分离的重链可变结构域和分离的轻链可变结构域的抗原结合蛋白，所述分离的重链可变结构域选自下列中任何种：SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 56、SEQ ID NO.58或SEQ ID NO:74，所述分离的轻链可变结构域选自下列中任何种：\nSEQ ID NO 62、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO.66或SEQ ID NO:68。\n[0122] 在本发明的进一步实施方案中，提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO 54的分离的重链可变结构域和SEQ ID NO 62的分离的轻链可变结构域。在进一步的实施方案中，抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:74的重链可变区和SEQ ID NO:62的轻链可变区。\n[0123] 在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包含由SEQ. ID. NO:53编码的重链可变区和由SEQ. ID. NO:61编码的轻链可变区。\n[0124] 在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包含由SEQ. ID. NO:73编码的重链可变区和由SEQ. ID. NO:61编码的轻链可变区。\n[0125] 在一个方面，提供了编码分离的可变重链的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO. 53、或SEQ. ID. NO. 55、或SEQ. ID. NO. 57、或SEQ. ID. NO. 73。\n[0126] 在一个方面，提供了编码分离的可变轻链的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO. 61、或SEQ. ID. NO. 63、或SEQ. ID. NO. 65、或SEQ. ID. NO. 67。\n[0127] 在进一步的方面，提供了编码分离的可变重链的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO. 53、或SEQ. ID. NO. 73，和编码分离的可变轻链的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO. 61、或SEQ. ID. NO. 63、或SEQ. ID. NO. 65、或SEQ. ID. NO. 67。在又进一步方面，提供了编码分离的可变重链的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO. \n53或SEQ. ID. NO. 73，和编码分离的可变轻链的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO. 61。\n[0128] 在进一步方面，抗原结合蛋白可以包含如本文所述的任一种可变重链与如本文所述的任一种可变轻链的组合。\n[0129] 在一个方面，抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个根据本文所述的本发明的CDR或根据本文所述的本发明的重链或轻链可变结构域的一个或两个。在一个实施方案中，抗原结合蛋白结合灵长类OSM。在一个这样的实施方案中，抗原结合蛋白额外地结合非人灵长类OSM，例如食蟹猕猴OSM。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白结合狨猴OSM。\n[0130] 在一个方面，提供了抗原结合蛋白，当通过Biacore或Kinexa测量时，所述抗原结合蛋白以强于1nM的亲和力与狨猴和人OSM结合。\n[0131] 这些抗体中和狨猿OSM的能力提供了评价OSM在用于其他适应症的狨猿疾病模型(诸如MS的EAE模型)中的作用的独特方式。\n[0132] 在另一个方面，抗原结合蛋白选自dAb、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体(diabody)、三链抗体、四链抗体(tetrabody)、miniantibody和minibody。\n[0133] 在本发明的一个方面，抗原结合蛋白是人源化或嵌合抗体，在进一步方面抗体是人源化的。\n[0134] 在一个方面，抗体是单克隆抗体。\n[0135] 在一个方面，本发明进一步提供了抗原结合蛋白，其包含：\n[0136] i) 如SEQ ID NO. 3中所述CDRH3或SEQ ID NO. 3的变体，其中CDRH3被如下所述的在下列位置的一个或多个的可替代的氨基酸所取代(使用Kabat编号)：\n[0137] 95位被取代为Ala、Glu、Gly、His、Leu、Met、Pro、Gln、Ser、Thr或Val\n[0138] 96位被取代为Ala、Cys、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Ser、Thr、Trp或Tyr\n[0139] 97位被取代为Ala、Cys、Phe、Met或Ser\n[0140] 98位被取代为Ala、Asp、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln或Trp\n[0141] 99位被取代为Ala、Cys、Pro、Ser、Val或Tyr\n[0142] 100B位被取代为Glu\n[0143] 100C位被取代为Ala、Glu、Phe、Gly、Val或Trp\n[0144] 100D位被取代为Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Leu、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr[0145] 101位被取代为Glu、Gly、Ser、Thr或 Val\n[0146] 102位被取代为Ala、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser Tyr、His、Ile、Asp或Trp。\n[0147] ii) 如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77中所述CDRH1或SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77的变体，其中Tyr 32被取代为Ile、His、Phe、Thr、Asn、Cys、Glu或Asp和/或Ala \n33被取代为Tyr、Trp、Gly、Thr、Leu或Val和/或Met 34被取代为Ile、Val或Trp和/或Ser 35被取代为His、Glu、Asn、Gln、Tyr或Thr。\n[0148] iii) 如SEQ ID NO. 2中所述CDRH2或SEQ ID NO. 2的变体，其中Thr50被取代为Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val和/或Ile51被取代为Leu、Val、Thr、Ser或Asn和/或Ser52被取代为Phe、Trp或His和/或Gly53被取代为Asp、Ser或Asn和/或Gly54被\n取代为Ser和/或Phe56被取代为Ser、Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg和/或Tyr58被取代为\nGly、His、Phe、Asp或Asn。\n[0149] iv) 如SEQ ID NO. 4中所述CDRL1或SEQ ID NO. 4的变体，其中Ser27A被取代为Asn、Asp、Thr 或Glu和/或Ser 27C被取代为Asp、Leu、Tyr、Val、Ile、Asn、Phe、His、Gly或Thr和/或Asn 31被取代为Ser、Thr、Lys或Gly和/或Phe32被取代为Tyr、Asn、\nAla、His、Ser或Arg和/或Met 33被取代为Leu、Val、Ile或Phe。\n[0150] v) 如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 78中所述CDRL2。\n[0151] vi) 如SEQ ID NO. 6中所述CDRL3或SEQ ID NO. 6的变体，其中Leu89被取代\n为Gln、Ser、Gly或Phe和/或His90被取代为Gln或Asn，Ser 91被取代为Asn、Phe、Gly、Arg、Asp、His、Thr、Tyr或Val和/或Arg92被取代为Asn、Tyr、Trp、Thr、Ser、Gln、His、ala或Asp和/或Glu93被取代为Asn、Gly、His、Thr、Ser、Ar或Ala和/或Phe96被取代\n为Pro、Leu、Tyr、Arg、Ile或Trp。\n[0152] vii) 重链构架包含以下残基：\n[0153] 2位Val、Ile或Gly\n[0154] 4位Leu或Val\n[0155] 20位Leu、Ile、Met或Val\n[0156] 22位Cys\n[0157] 24位Thr、Ala、Val、Gly或Ser\n[0158] 26位Gly\n[0159] 29位Ile、Phe、Leu或Ser\n[0160] 36位Trp\n[0161] 47位Trp\n[0162] 48位Ile、met、Val或Leu\n[0163] 69位Ile、Leu、Phe、Met或Val\n[0164] 71位Arg\n[0165] 78位Ala、Leu、Val、Tyr或Phe\n[0166] 80位Leu、Met\n[0167] 90位Tyr或Phe\n[0168] 92位Cys\n[0169] 94位Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。\n[0170] 在一个方面，本发明进一步提供了抗原结合蛋白，其包含：\n[0171] i) 如SEQ ID NO. 3中所述CDRH3\n[0172] ii) 如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77中所述CDRH1\n[0173] iii) 如SEQ ID NO. 2中所述CDRH2\n[0174] iv) 如SEQ ID NO. 4中所述CDRL1\n[0175] v) 如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 78中所述CDRL2\n[0176] vi) 如SEQ ID NO. 6中所述CDRL3\n[0177] vii) 重链构架包含以下残基：\n[0178] 2位Val、Ile或Gly\n[0179] 4位Leu或Val\n[0180] 20位Leu、Ile、Met或Val\n[0181] 22位Cys\n[0182] 24位Thr、Ala、Val、Gly或Ser\n[0183] 26位Gly\n[0184] 29位Ile、Phe、Leu或Ser\n[0185] 36位Trp\n[0186] 47位Trp\n[0187] 48位Ile、met、Val或Leu\n[0188] 69位Ile、Leu、Phe、Met或Val\n[0189] 71位Arg\n[0190] 78位Ala、Leu、Val、Tyr或Phe\n[0191] 80位Leu、Met\n[0192] 90位Tyr或Phe\n[0193] 92位Cys\n[0194] 94位Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。\n[0195] 在一个方面，本发明进一步提供了抗原结合蛋白，其包含：\n[0196] i) 如SEQ ID NO. 3中所述CDRH3\n[0197] ii) 如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77中所述CDRH1\n[0198] iii) 如SEQ ID NO. 2中所述CDRH2\n[0199] iv) 如SEQ ID NO. 4中所述CDRL1\n[0200] v) 如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 78中所述CDRL2\n[0201] vi) 如SEQ ID NO. 6中所述CDRL3\n[0202] vii) 重链构架包含以下残基：\n[0203] 2位Val\n[0204] 4位Leu\n[0205] 20位Leu\n[0206] 22位Cys\n[0207] 24位Ala\n[0208] 26位Gly\n[0209] 29位Phe\n[0210] 36位Trp\n[0211] 47位Trp\n[0212] 48位Val\n[0213] 69位Ile\n[0214] 71位Arg\n[0215] 78位Leu\n[0216] 80位Leu\n[0217] 90位Tyr\n[0218] 92位Cys\n[0219] 94位Arg。\n[0220] 在一个方面，本发明进一步提供了抗原结合蛋白包含：\n[0221] i) 如SEQ ID NO. 3中所述CDRH3\n[0222] ii) 如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 77中所述CDRH1\n[0223] iii) 如SEQ ID NO. 2中所述CDRH2\n[0224] iv) 如SEQ ID NO. 4中所述CDRL1\n[0225] v) 如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 78中所述CDRL2\n[0226] vi) 如 SEQ ID NO. 6中所述CDRL3\n[0227] vii) 重链构架包含以下残基：\n[0228] 2位Val\n[0229] 4位Leu\n[0230] 20位Leu\n[0231] 22位Cys\n[0232] 24位Ala\n[0233] 26位Gly\n[0234] 29位Phe\n[0235] 36位Trp\n[0236] 47位Trp\n[0237] 48位Leu\n[0238] 69位Ile、Leu、Phe、Met或Val\n[0239] 71位Arg\n[0240] 78位Ala\n[0241] 80位Leu、Met\n[0242] 90位Tyr或Phe\n[0243] 92位Cys\n[0244] 94位Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。\n[0245] 通过用包含本发明的抗原结合蛋白的编码序列的表达载体转染宿主细胞，可以产生抗原结合蛋白，例如本发明的抗体。通过将抗原结合蛋白的这些编码序列置于与常规的调节控制序列的可操作关联下，产生表达载体或重组质粒，所述调节控制序列能够控制在宿主细胞中的复制和表达和/或从宿主细胞的分泌。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子和可以源自其他已知的抗体的信号序列。类似地，可以产生具有DNA序列的第二表达载体，所述DNA序列编码互补的抗原结合蛋白轻链或重链。在某些实施方案中，除了所涉及的编码序列和选择标记之外，这种第二表达载体与第一表达载体相同，以确保尽可能地有功能地表达每条多肽链。可替代地，抗原结合蛋白的重链和轻链编码序列可以存在于单一载体上。\n[0246] 通过常规技术，用第一载体和第二载体共转染选定的宿主细胞(或仅用单一载体转染)，以生成包含重组的或合成的轻链和重链的本发明的转染的宿主细胞。然后通过常规技术，培养转染的细胞，以产生本发明的工程改造的抗原结合蛋白。通过合适的测定，诸如ELISA或RIA，从培养物筛选包括重组重链和/或轻链的结合体的抗原结合蛋白。可以采用相似的常规技术，构建其他抗原结合蛋白。\n[0247] 本领域技术人员可以选择适用于在本发明的方法和组合物构建中采用的克隆和亚克隆步骤的载体。例如，可以使用常规的pUC克隆载体系列。一种载体pUC19可从供应点商业获得，诸如Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom)或Pharmacia (Uppsala, Sweden)。另外，能够容易地复制的、具有丰富的克隆位点和选择基因(例如，抗生素抗性)并且易于操作的任何载体，可以用于克隆。因而，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。\n[0248] 通过适用于放大异源DNA序列的表达的基因，例如，哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，也可以表征表达载体。其他载体序列包括：聚腺苷酸(poly A)信号序列，诸如来自牛生长激素(BGH)以及β珠蛋白启动子序列(betaglopro)。通过本领域技术人员众所周知的技术，可以合成在本文中有用的表达载体。\n[0249] 这些载体的组件，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可以从商业来源或天然来源获得，或通过已知程序合成，用于指导重组DNA的产物在选定的宿主中的表达和/或分泌。为了这个目的，也可以选择其他合适的表达载体，其中许多类型在本领域已知用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达。\n[0250] 本发明还涵盖用含有本发明的抗原结合蛋白的编码序列的重组质粒转染的细胞系。对于这些克隆载体的克隆和其他操作而言有用的宿主细胞也是常规的。然而，来自各种大肠杆菌菌株的细胞可以用于克隆载体的复制和本发明的抗原结合蛋白的构建中的其他步骤。\n[0251] 适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括：哺乳动物细胞诸如NS0、Sp2/0、CHO (例如DG44)、COS、HEK、成纤维细胞(例如，3T3)和骨髓瘤细胞，例如它可以在CHO或骨髓瘤细胞中表达。可以使用人细胞，因而允许分子用人糖基化模式来修饰。可替代地，可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法，是本领域已知的。参见，例如，以上引述的Sambrook 等人。\n[0252] 可以证明，细菌细胞可用作宿主细胞，其适合表达本发明的重组Fab或其他实施方案(参见，例如，Plückthun, A., Immunol. Rev.,130: 151-188(1992))。但是，由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式，必须筛选在细菌细胞中产生的任何重组Fab，以保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以适当地折叠的形式产生，该细菌细胞将是期望的宿主，或者，在可替代的实施方案中，可以在细菌宿主中表达分子，然后随后进行重新折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株，是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种菌株，也可以用于该方法中。\n[0253] 如果需要，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞，例如果蝇和\n鳞翅目昆虫和病毒表达系统，也可用作宿主细胞。参见例如，Miller等人，Genetic \nEngineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) 和其中引用的参考文献。\n[0254] 可通过其构建载体的一般方法、产生本发明宿主细胞所需要的转染方法和从所述宿主细胞产生本发明抗原结合蛋白必需的培养方法，可以全部是常规技术。本发明培养方法通常是无血清培养方法，通常通过无血清悬浮培养细胞。同样地，一旦产生本发明抗原结合蛋白，可将其根据本领域标准程序从细胞培养内容物纯化出，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这类技术在本领域技术范围内，不限定本发明。例如，在WO 99/58679和WO 96/16990中描述了改变的抗体的制备。\n[0255] 表达抗原结合蛋白的又另一种方法可以利用在转基因动物中的表达，诸如美国专利号4,873,316中所述。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因地并入哺乳动物中时，允许雌性动物在其奶中产生希望的重组蛋白。\n[0256] 在本发明的进一步实施方案中，提供了产生本发明的抗体的方法，所述方法包括培养用编码本发明抗体轻链和/或重链的载体转化或转染的宿主细胞和回收由此产生的抗体的步骤。\n[0257] 根据本发明，提供了产生本发明抗OSM抗体的方法，所述抗OSM抗体与人OSM结合并中和其活性，所述方法包括以下步骤\n[0258] (a) 提供编码抗体的重链的第一载体；\n[0259] (b) 提供编码抗体的轻链的第二载体；\n[0260] (c) 用所述第一载体和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CHO)；\n[0261] (d) 在有助于所述抗体从所述宿主细胞分泌进所述培养基中的条件下，培养步骤(c)的宿主细胞；\n[0262] (e) 回收步骤(d)的分泌的抗体。\n[0263] 抗体一旦通过所需方法表达，就要通过利用适当的测定检查其体外活性。采用当前常规的ELISA测定形式来评价抗体与OSM的定性和定量结合。另外，也可以使用其他体外测定来证实中和效力，然后进行随后的人临床研究，以评价抗体在体内的持久性，不考虑一般的清除机制。\n[0264] 治疗的剂量和持续时间与本发明的分子在人循环中的相对持续时间有关，可以由本领域技术人员根据要治疗的状况和患者的总体健康来调整。预见到，可能需要在延长的时间段(例如，四到六个月)内的重复给药(例如，每周一次或每2周一次)来实现最大治疗效力。\n[0265] 在本发明的一个实施方案中，提供了重组转化、转染或转导的宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一个表达盒，例如，其中所述表达盒包含编码本文所述的本发明的抗原结合蛋白的重链的多核苷酸，并且进一步包含编码本文所述的本发明的抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸，或其中具有两个表达盒，第一个编码轻链，且第二个编码重链。例如，在一个实施方案中，第一表达盒包含编码本文所述的本发明的包含恒定区的抗原结合蛋白或其与恒定区连接的抗原结合片段的重链的多核苷酸；其进一步包含第二盒，所述第二盒包含编码本文所述的本发明的包含恒定区的抗原结合蛋白或其与恒定区连接的抗原结合片段的轻链的多核苷酸，例如所述第一表达盒包含编码选自SEQ. ID. NO:70或SEQ. ID. NO:76的重链的多核苷酸并且第二表达盒包含编码选自SEQ. ID. NO:72的轻链的多核苷酸。\n[0266] 应该理解，本文所述序列(SEQ ID NO.25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、\n49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、83)包括与本文所述序列基本相同的序列，例如至少90%相同的序列，例如至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%或至少\n95%、或至少96%、或至少97%或至少98%、或至少99%相同的序列。\n[0267] 对于核酸，术语“基本同一性”表示当在适当的核苷酸插入或缺失的情况下最佳比对和比较时，两种核酸或其指定序列在至少约80%的核苷酸、至少约90%-约95%、或至少约\n98%-约99.5%的核苷酸相同。可替代地，当DNA区段在选择性杂交条件下与互补链杂交时，存在基本同一性。\n[0268] 对于核苷酸和氨基酸序列，术语“相同的”表示当在适当的插入或缺失的情况下最佳比对和比较时，两种核酸或氨基酸序列之间的同一性程度。可替代地，当DNA区段在选择性杂交条件下与互补链杂交时，存在基本同一性。\n[0269] 在本发明的另一个实施方案中，提供了稳定转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含含有一个或多个表达盒的载体，所述一个或多个表达盒编码如本文所述的包含恒定区的抗体或或其与恒定区连接的抗原结合片段的的重链和/或轻链。例如，此类宿主细胞可以包含编码轻链的第一载体和编码重链的第二载体，例如所述第一载体编码选自SEQ. ID. NO:70或SEQ. ID. NO:76的重链并且第二载体编码轻链，例如SEQ ID NO:72的轻链。\n[0270] 在本发明的另一个实施方案中，提供了根据本文所述的本发明的宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞，例如其中所述细胞是哺乳动物细胞。此类细胞系的实例包括CHO或NS0。\n[0271] 在本发明的另一个实施方案中，提供了产生根据本文所述的本发明的包含恒定区的抗体或其与恒定区连接的抗原结合片段的方法，所述方法包括在培养基(例如无血清培养基)中培养宿主细胞的步骤。\n[0272] 在本发明的另一个实施方案中，提供了根据本文所述的本发明的方法，其中所述抗体进一步纯化至相对于含所述抗体的无血清培养基的至少95%或更高(例如98%或更\n高)。\n[0273] 在又另一个实施方案中，提供了包含抗原结合蛋白和药学上可接受载体的药物组合物。\n[0274] 在本发明的另一个实施方案中，提供了部件试剂盒(kit-of-parts)，所述部件试剂盒包含根据本文所述的本发明的组合物以及使用说明书。\n[0275] 本发明治疗剂的施用方式可以是将药物递送给宿主的任何合适途径。本发明的抗原结合蛋白和药物组合物特别可用于胃肠外施用，即皮下(s.c.)、鞘内、腹膜内、肌内(i.m.)或静脉内(i.v.)。\n[0276] 本发明的治疗剂可以制备成药物组合物，其含有在药学上可接受的载体中的作为活性成分的有效量的本发明的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，本发明的预防剂是水性悬浮液或溶液，其含有注射即用形式的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，所述悬浮液或溶液缓冲到生理pH。在一个实施方案中，用于肠胃外施用的组合物将包含溶于药学上可接受的载体中的本发明的抗原结合蛋白或其混合物的溶液。在一个实施方案中，载体是水性载体。可以使用多种水性载体，例如，0.9% 盐水、0.3% 甘氨酸等。这些溶液可以制成无菌的，一般没有颗粒物质。通过常规的众所周知的除菌技术(例如，过滤)，可以将这些溶液除菌。\n组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂等。本发明的抗原结合蛋白在这种药物制剂中的浓度可以广泛地变化，即，从低于约0.5%、通常在或至少约1%到多达约15或20%(按重量计)，主要基于液体体积、粘度等，根据选定的特定施用模式，进行选择。\n[0277] 因而，用于肌肉内注射的本发明的药物组合物可以制备成含有1 mL 无菌缓冲水，和约1 ng至约100 mg(例如约50 ng至约30 mg或约5 mg至约25 mg)的抗原结合\n蛋白，例如本发明的抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可以制备成含有约250 ml 无菌林格氏溶液，和约1至约30或5 mg至约25 mg本发明的抗原结合蛋白\n/ml 林格氏溶液。用于制备肠胃外施用的组合物的实际方法是众所周知的，或者对于本领域技术人员而言是显而易见的，更详细地描述在，例如，Remington's Pharmaceutical Science, 第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。关于静脉内\n施用的本发明抗原结合蛋白制剂的制备，参见：Lasmar U和Parkins D“The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, 第129-137页, 第3\n卷 (2000年4月3日)；Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals A 部 和 B 部，Ahern T.J., Manning M.C. 编 , New York, NY: Plenum Press (1992)；Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K 等人 “Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J \nPharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, “Mannitol-sucrose \nmixtures-versatile formulations for protein lyophilization”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922;和Ha, E Wang W, Wang Y.J. “Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)，其所有内容通过引用并入本文，并向读者特别地提及。\n[0278] 在一个实施方案中，当在药物制剂中时，本发明的治疗剂以单位剂量形式存在。本领域技术人员可容易地确定合适的治疗有效剂量。根据患者的体重，可以为患者计算合适的剂量，例如合适的剂量可在约0.1至约20mg/kg的范围内，例如约1至约20mg/kg，例如约\n10至约20mg/kg，或例如约1至约15mg/kg，例如约10至约15mg/kg。为了有效治疗状况，诸如人哮喘或IPF，合适的剂量可在约0.1至约1000 mg的本发明抗原结合蛋白的范围内，例如约0.1至约500 mg、例如约500 mg、例如约0.1至约100 mg、或约0.1至约80 mg、或约0.1至约60 mg、或约0.1至约40 mg、或例如约1至约100 mg、或约1至约50 mg的本发明抗原结合蛋白，其可以胃肠外施用，例如皮下、静脉内或肌内。如果必要，可以按照医师酌情选择的合适时间间隔，重复这种剂量。\n[0279] 可以冻干本文所述的抗原结合蛋白用于保存，并在使用前在适合的载体中重构。\n已经显示，这种技术对于常规的免疫球蛋白是有效的，且可以采用本领域已知的冻干法和重构技术。\n[0280] 在本发明的另一个方面，提供了治疗患有炎性关节病(诸如风湿性关节炎、幼年发病关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎)的人患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0281] 在本发明的另一个方面，提供了治疗患有疾病或病症的人患者的方法，所述疾病或病症选自1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠疾病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)、全身性红斑狼疮(SLE, 狼疮)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊红细胞性食道炎(eosinophilic esophagitis)、系统性硬化病(SS)或特发性肺纤维化(IPF)、Sjögren综合症、硬皮病、血管炎(包括高安氏动脉炎、巨细胞(颞)动脉炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、川崎病、分离的CNS脉管炎、Churg-Strauss动脉炎、显微多动脉炎/多血管炎、超过敏性血管炎(过敏性血管炎)、\n亨-舍二氏紫癜和必要的冷球蛋白性血管炎)、未分化脊柱关节炎(USpA)、强直性脊柱炎(AS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化病(MS)和哮喘，其中所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0282] 上述疾病的任何一种或多种可能是本发明的治疗方法的靶疾病。\n[0283] 在特定的方面，疾病或病症选自骨关节炎(OA)、牛皮癣、特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化病(SS Sjögren综合症、硬皮病、或多发性硬化病(MS。\n[0284] 在本发明的一个方面，自身免疫病是骨关节炎。\n[0285] 在本发明的一个方面，自身免疫病是牛皮癣。\n[0286] 在本发明的一个方面，自身免疫病或病症是纤维化的疾病或病症。\n[0287] 在本发明的一个方面，自身免疫病是特发性肺纤维化(IPF)。\n[0288] 在本发明的一个方面，自身免疫病是系统性硬化病(SS)。\n[0289] 在本发明的一个方面，自身免疫病是Sjögren综合症。\n[0290] 在本发明的一个方面，自身免疫病是硬皮病。\n[0291] 在本发明的另一个方面，提供了减少或预防在患有(或易患)软骨退化的人患者中的软骨退化的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0292] 在本发明的另一个方面，提供了减少患有响应于TNFα减少的疾病或病症的患者中TNFα产生的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白施用于所述患者。\n[0293] 在本发明的另一个方面，提供了治疗关节炎疾病或病症的关节外表现(例如\nFeltys费尔提氏综合症(Feltys syndrome))和/或治疗动脉粥样硬化斑块形成的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白施用于患有关节炎疾病或病症的关节外表现的人患者的步骤。\n[0294] 在本发明的另一个方面，提供了治疗患有内皮细胞起源的疾病的人患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0295] 在本发明的另一个方面，提供了治疗患有纤维化疾病或病症(诸如特发性肺纤维化、进行性系统性硬化病(硬皮病)、肝纤维化、肝肉芽肿、血吸虫病和利什曼原虫病)的人患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0296] 在本发明的另一个方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病或病症(诸如多发性硬化病(MS)、阿尔茨海默病(AD)和其他痴呆症)的人患者的方法，且此外涉及治疗疼痛(特别是神经性的和/或炎性疼痛)的用途，其中所述方法包括将治疗有效量的如本文所述抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0297] 也提供了如本文所述抗原结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗如本文所述的疾病和病症。\n[0298] 例如，在本发明的一个方面，提供了如本文所述抗原结合蛋白用于治疗或预防响应于hOSM和gp130之间相互作用的调节的疾病或病症的用途。\n[0299] 在本发明的另一个方面，提供了如本文所述抗原结合蛋白用于治疗或预防炎性关节病(诸如风湿性关节炎、幼年发病关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎)的用途。\n[0300] 在本发明的又另一个方面，提供了如本文所述抗原结合蛋白用于治疗或预防疾病和病症的用途，所述疾病和病症选自1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠疾病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)、全身性红斑狼疮(SLE，狼疮)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊红细胞性食道炎(eosinophilic \nesophagitis)、系统性硬化病(SS)或特发性肺纤维化(IPF)、Sjögren综合症、硬皮病、血管炎(包括高安氏动脉炎、巨细胞(颞)动脉炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、川崎病、分离的CNS脉管炎、Churg-Strauss动脉炎、显微多动脉炎/多血管炎、超过敏性血管炎(过敏性血管炎)、亨-舍二氏紫癜和必要的冷球蛋白性血管炎)、未分化脊柱关节炎(USpA)、强直性脊柱炎(AS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化病(MS)和哮喘，其中所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白施用于所述患者的步骤。\n[0301] 例如在一个特定的方面，提供了抗原结合蛋白用于治疗和预防骨关节炎(OA)、牛皮癣、特发性肺纤维化(IPF)或多发性硬化病(MS)的用途。\n[0302] 本发明的其他方面和优势在详述及其实施方案中进一步阐述。\n[0303] 在一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗原结合蛋白或其功能片段和药学上可接受的载体，其用于治疗和预防炎性疾病和或病症，例如炎性关节病诸如风湿性关节炎、幼年发病关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎或选自1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠疾病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)、全身性红斑狼疮(SLE，狼疮)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊红细胞性食道炎、系统性硬化病(SS)或特发性肺纤维化(IPF)、Sjögren综合症、硬皮病、血管炎(包括高安氏动脉炎、巨细胞(颞)动脉炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、川崎病、分离的CNS脉管炎、Churg-Strauss动脉炎、显微多动脉炎/多血管炎、超过敏性血管炎(过敏性血管炎)、亨-舍二氏紫癜和必要的冷球蛋白性血管炎)、未分化脊柱关节炎(USpA)、强直性脊柱炎(AS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化病(MS)和哮喘。\n[0304] 在本发明的另一个方面，提供了治疗患有炎性疾病或病症的人患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文所述本发明的抗原结合蛋白的步骤，例如，提供了治疗患有炎性疾病或病症的人患者的方法，所述方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和如本文所述的抗原结合蛋白的组合。在进一步实施方案中，提供了治疗患有炎性疾病或病症的人患者的方法，所述炎性疾病或病症选自，例如炎性关节病诸如风湿性关节炎、幼年发病关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎或选自1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠疾病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)、全身性红斑狼疮(SLE，狼疮)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊红细胞性食道炎(eosinophilic esophagitis)、系统性硬化病(SS)或特发性肺纤维化(IPF)、Sjögren综合症、硬皮病、血管炎(包括高安氏动脉炎、巨细胞(颞)动脉炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、川崎病、分离的CNS脉管炎、Churg-Strauss动脉炎、显微多动脉炎/多血管炎、超过敏性血管炎(过敏性血管炎)、亨-舍二氏紫癜和必要的冷球蛋白性血管炎)、未分化脊柱关节炎(USpA)、强直性脊柱炎(AS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化病(MS)和哮喘。\n[0305] 在本发明的可替代的方面，提供了用于使非人抗体或其抗体片段人源化的方法，所述方法包括以下步骤：\n[0306] a) 将一个或多个非人CDR并入到人受体构架上，以产生嵌合或人源化抗体\n[0307] b) 将嵌合或人源化抗体与其抗原结合\n[0308] c) 确定直接参与与抗原结合的抗体的残基\n[0309] d) 将一个或多个不参与步骤(c)的残基突变为人种系序列；\n[0310] e) 回收所述抗体。\n[0311] 在进一步方面，参与结合抗原的抗体的残基可以通过晶体学、同源性模型、蛋白对接、诱变或线性肽作图确定。\n[0312] 例如，在如本文所述的本发明的一个该方面，获得了抗体-抗原共晶体的晶体结构并且参与结合的残基确定至约2-5Å之间。\n[0313] 术语非人涵盖可以某种方式突变或取代以使其更接近人种系序列的任何抗体。以这种方式降低免疫原性的可能性。\n[0314] 在一个方面，至少一个CDR 回复到种系。在进一步方面，至少两个CDR 回复到种系。在又进一步方面，至少5个残基回复到种系，例如至少7个或至少8个或至少9个或至少10个残基回复到种系。\n[0315] 非人单克隆抗体或其片段转移至人受体上通常另外依赖于在构架内引入变化以重建适当CDR区-抗原相互作用，这些变化通常称为回复突变。在本发明的一个实施方案中，需要回复突变以重建适当CDR区-抗原相互作用。\n[0316] 在可替代的实施方案中，可以将人受体构架并入到具有一个或多个非人CDR的抗体上以产生嵌合抗体。在又一个可替代的实施方案中，可以通过寡核苷酸-合成生成序列。\n[0317] 将非人抗体的CDR(或高变区残基)并入到VL和/或VH人受体构架中。例如，可\n以并入对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。\n[0318] 在一个实施方案中，提供了用于使抗体人源化的方法，所述方法包括以下步骤：\n[0319] a) 获得与靶抗原结合的非人抗体\n[0320] b) 获得抗体-抗原共晶体的晶体结构\n[0321] c) 从该晶体结构将直接参与与抗原结合的非人抗体的残基确定至约2-5Å\n[0322] e) 将一个或多个不参与步骤(c)的残基突变至源自人序列的残基；\n[0323] f) 回收所述抗体。\n[0324] 在本文所述的方法的进一步实施方案中，抗体或抗体结合片段保留与其抗原的结合。例如，如与非人抗体相比，抗体或其抗体结合片段保留与其抗原的结合。例如，步骤f)的抗体具有步骤a)的非人抗体的10倍以内或比其更好的结合亲和力(KD)，例如步骤f)的抗体具有步骤a)的非人抗体的3-5倍以内或比其更好的结合亲和力(KD)。\n[0325] 例如，抗体或抗体结合片段当通过Biacore测量时在非人抗体的1000 nM以内，或当通过Biacore测量时在非人抗体的500 nM以内，或当通过Biacore测量时在非人抗\n体的100 nM以内保持与其抗原的结合。例如，抗体或抗体结合片段当通过Biacore测量时在非人抗体的500pM以内，或当通过Biacore测量时在非人抗体的300pM以内，或当通过Biacore测量时在非人抗体的100pM以内保持与其抗原的结合。例如，步骤f)的抗体以等于或小于400 pM，或等于或小于300 pM，或等于或小于200 pM，或等于或小于140 pM的亲和力(KD)与其抗原结合。\n[0326] 在本文所述方法的另一个实施方案中，抗体或抗体结合片段保留与非人抗体或抗体片段相同的规范结构。\n[0327] 在又另一个实施方案中，非人抗体或其抗体片段来自非人动物，例如小鼠、大鼠、兔、骆驼或鲨鱼。\n[0328] 在进一步实施方案中，非人抗体或其抗体片段来自小鼠。\n[0329] 在又另一个实施方案中，非人抗体或其抗体片段是单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体或这可以是免疫球蛋白单可变结构域，例如骆驼或鲨鱼免疫球蛋白单可变结构域，或其可以是作为非人非抗体蛋白支架衍生物的结构域。\n[0330] 在又进一步实施方案中，非人抗体是单克隆抗体。\n[0331] 在本文所述的方法的一个实施方案中，至少2个非人CDR并入人受体序列，或至少\n3个CDR或至少4个CDR或至少5个CDR或全部6个CDR并入人受体序列。\n[0332] 在本文所述方法的进一步实施方案中，待突变为源自人序列的残基的残基(其不直接参与结合抗原且还不是人序列)可以是CDR中或构架区中或两者中的残基。在进一步实施方案中，至少1个CDR突变为人种系序列，或突变至少2个CDR、或突变至少3个CDR、或突变至少4个CDR突变。\n[0333] 在又另一个实施方案中，至少5个残基突变为人种系序列，或至少7个残基、或至少10个残基、或至少15个残基、或至少20个残基或至少40个残基或至少60个残基突变\n为人种系序列。\n[0334] 在本文所述方法的又另一个实施方案中，确定直接参与抗原结合的抗体的残基为约2-5 Å，或约3-5 Å，或约3-4 Å，或约3.5 Å。\n[0335] 在本文所述方法的又进一步实施方案中，提供了可通过这种方法获得的抗体。\n[0336] 定义\n[0337] 本文中所用的术语“抗原结合蛋白”是指能够结合并且中和人OSM的抗体、抗体片段和其他蛋白构建体。\n[0338] 术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2以其标准含义(参见例如Harlow等人, Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988))使用。\n[0339] 术语“抗体”在最广义的意义上用于本文中，具体涵盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。\n[0340] 本文中所用的术语“单克隆抗体”是指由基本上同质抗体群所获得的抗体，即包含个别抗体的群体除了可能少量存在的可能的天然存在的突变外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原结合位点具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。\n[0341] “嵌合抗体”是指工程改造的抗体类型，其中重链和/或轻链的部分与源自特定供体抗体类型或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或子类的抗体以及所述抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们呈现所需生物活性(美国专利号4,816,567和Morrison等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA \n81:6851-6855) (1984))。\n[0342] "人源化抗体"是指工程改造的抗体类型，其具有源自非人供体免疫球蛋白的\nCDR，所述分子剩余的源自免疫球蛋白的部分源自一个(或多个)人免疫球蛋白。另外，可改变构架支持残基以保留结合亲和力(参见例如，Queen 等人，Proc. Natl Acad Sci USA, \n86:10029-10032 (1989), Hodgson 等人，Bio/Technology, 9:421 (1991))。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸及氨基酸序列的同源性选自以下常规数据库的抗体：例如KABAT®数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。特征为与供体抗体构架区的同源性(基于氨基酸)的人抗体，可适于提供重链恒定区和/或重链可变构架区用于插入供体CDR。可以相似的方式选择能够贡献轻链恒定区或可变构架区的合适的受体抗体。应该注意，受体抗体重链和轻链不必源自相同受体抗体。现有技术描述了产生所述人源化抗体的几种方式，参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。\n[0343] 用于多核苷酸和多肽的“同一性”，是指根据情况使用下列(1)和(2)所提供的算法计算的比较：\n[0344] (1) 多核苷酸的同一性通过下列步骤来计算：用给定序列中核苷酸的总数乘以定义百分比同一性的整数除以100，然后从所述序列中核苷酸的所述总数减去该乘积，或：\n[0345] \n[0346] 其中，nn为核苷酸改变的数，xn为给定序列中的核苷酸总数；对于95%，y为0.95，对于97%为0.97，或对于100%为1.00，·为乘法运算符，其中将xn和y的任何非整数的乘积向下近似为最近的整数，再从xn将其减去。编码多肽的多核苷酸序列的改变可以在此编码序列中产生无义、错义或移码突变，从而在这些改变后改变由多核苷酸编码的多肽。\n[0347] (2) 多肽的同一性通过下列步骤来计算：用氨基酸的总数乘以定义百分比同一性的整数除以100，然后从氨基酸的所述总数减去该乘积，或：\n[0348] \n[0349] 其中，na为氨基酸改变的数，xa为序列中的氨基酸总数，对于95%，y为0.95，对于\n97%为0.97，或对于100%为1.00，·为乘法运算符，其中将xa和y的任何非整数的乘积向下近似为最近的整数，再从xa将其减去。\n[0350] “分离的”是指“通过人手”由其天然状态进行改变的；或已经从其原始环境改变或移出的，或者二者。例如，天然存在于活的生物体的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存材料所分离的相同多核苷酸或多肽为“分离的”，其包括但不限于当将此多核苷酸或多肽回复引入细胞时，即使所述细胞与分离出多核苷酸或多肽的细胞是相同物种或类型。\n[0351] 整个本发明的说明书和所附权利要求书中，术语“包含”和“包括”并入“由……组成”和“由……构成”。也就是说，这些词意在表达可能包括上下文所允许而未特别列出的其他要素或整数。\n[0352] 在整个本发明说明书中所用的与本发明的抗原结合蛋白相关的术语“特异性结合”是指抗原结合蛋白结合人OSM (hOSM)而不结合或不明显结合其他人蛋白。然而，所述术语不排除本发明的抗原结合蛋白也可与OSM的其他形式例如灵长类OSM交叉反应的事实。\n[0353] 在整个本发明说明书中所用的与本发明的抗原结合蛋白相关的术语“直接相互作用”是指当抗原结合蛋白与人OSM(hOSM)结合时，抗原结合蛋白上的该特异性残基在hOSM上特异性残基的3.5 Å以内。\n[0354] 在整个本发明说明书中所用的与本发明的抗原结合蛋白相关的术语抑制是指在存在本发明的抗原结合蛋白的情况下，与不存在这种抗原结合蛋白的情况下OSM的活性相比，其OSM的生物活性降低。抑制可能是由于但不限于以下一种或多种：阻断配体结合，防止配体激活受体，下调OSM或影响效应功能。本发明的抗体可以中和OSM。可用几种方法测定中和作用的水平，例如通过使用以下实施例所述的测定，例如在实施例2.2.1中所述的KB细胞中和测定。OSM能够经由通过Gp130/OSMR复合物的信号传递来诱导从KB细胞释放白介素6。该测定中OSM的中和通过评价抗OSM单克隆抗体抑制IL6产生的能力来测定。\n[0355] 如果抗体或其抗原结合片段能够中和，则表明人OSM与其gp130受体之间相互作用的抑制。被认为对人OSM具有中和活性的抗体在KB细胞中和测定(如实施例2.2.1所\n述)中具有小于10微克/毫升、或小于5微克/毫升、或小于2微克/毫升、或小于1微克\n/毫升或小于0.1微克/毫升的IC50。\n[0356] “CDR”定义为抗体的互补性决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变结构域。在免疫球蛋白的可变部分中，存在3个重链和3个轻链CDR (或CDR区)。因\n此，本文所用的“CDR”可以是指所有3个重链CDR，或所有3个轻链CDR(适当时，或所有重链和所有轻链CDR)。\n[0357] CDR提供了抗体与抗原或表位结合的大部分接触残基。本发明中的目的CDR源自供体抗体可变重链和轻链序列，且包括天然存在CDR的类似物，该类似物还具有或保持着与它们所来源的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。\n[0358] 可通过Kabat编号系统(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)确定抗体CDR序列，或用以下来确定抗体CDR序列：Chothia编号系统(Al-Lazikani等人, (1997) JMB 273,927-948)、接触定义方法(contact definition method) (MacCallum R.M.和 Martin A.C.R. 和 Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745)或本领域技术人员已知的用于给抗体残基编号和确定CDR的任何其他确立的方法。\n[0359] 技术人员可获得的用于CDR序列的其他编号规则包括“AbM” (University of Bath)和“接触” (University College London) 方法。用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种可测定最小重叠区，以提供 "最小结合单元"。最小结合单元可以是CDR的亚部分。\n[0360] 下表1代表用每种编号规则对每个CDR或结合单元的一种定义。表1中用Kabat\n编号方案来给可变结构域氨基酸序列编号。应该注意，一些CDR定义可根据所用的单独出版物而变化。\n[0361] \n[0362] 整个本说明书中，根据Kabat方案对抗体序列中的氨基酸残基编号。类似地，术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循如Kabat 等人；\nSequences of Proteins of Immunological Interest, NIH 1987中所述的Kabat编号系统。\n[0363] 术语“VH” 和“VL”在本文中分别用于指抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。\n[0364] 本文中所用的术语"结构域"是指具有独立于蛋白的剩余部分的三级结构的折叠蛋白结构。结构域通常负责蛋白的不连续的功能性质，在很多情况下可将其加入、移走或转移到其他蛋白，而不损失蛋白的剩余部分和/或结构域的功能。“抗体单可变结构域”是折叠的多肽结构域，其包含抗体可变结构域特有的序列。因此，其包括完全抗体可变结构域和经修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环被以下序列取代：不具有抗体可变结构域特性的序列，或已经被截短或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。\n[0365] 短语“免疫球蛋白单可变结构域”是指抗体可变结构域 (VH、VHH、VL)，其独立于不同的V区或结构域而特异性结合抗原或表位。免疫球蛋白单可变结构域可以以含有其他不同的可变区或可变结构域的形式(例如，同源多聚体或异源多聚体)存在，其中其他区域或结构域不是单免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所必需的(即其中免疫球蛋白单可变结构域独立于另外的可变结构域而与抗原结合)。当该术语在本文中使用时，“结构域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单可变结构域”相同，其能够结合抗原。免疫球蛋白单可变结构域可以是人抗体可变结构域，但是也包括来自其他物种的单抗体可变结构域，诸如啮齿动物(例如如WO 00/29004中所公开的)、铰口鲨(nurse shark)和骆驼(Camelid) VHH \ndAb。骆驼科VHH为源自包括骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和原驼(guanaco)在内的物种的免疫球蛋白单可变结构域多肽，所述物种产生天然缺乏轻链的重链抗体。所述VHH结构域可根据本领域可获得的标准技术人源化，认为所述结构域仍为本发明的"结构域抗体"。本文中所用的“VH”包括骆驼VHH结构域。NARV是在包括铰口鲨在内的软骨鱼中鉴定出的另一类免疫球蛋白单可变结构域。这些结构域也称作新的抗原受体可变区 (通常缩写为V(NAR)或NARV)。关于其他细节，参见Mol. Immunol. 44: \n656-665 (2006)和US20050043519A。\n[0366] 术语“表位-结合结构域”表示以下结构域：其独立于不同的V区或结构域而特异性地结合抗原或表位，这可以是结构域抗体(dAb)，例如人、骆驼或鲨鱼免疫球蛋白单可变结构域，或它可以是作为选自下述的支架的衍生物的结构域：CTLA-4 (Evibody)；脂质运载蛋白(lipocalin)；源自蛋白A的分子诸如蛋白A的Z-结构域(亲和体, SpA)、\nA-结构域 (Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEl和GroES；转铁蛋白 (穿膜抗\n体(transbody))；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适配体；C-型凝集素结构域 (四连接素(Tetranectin))；人γ-晶体蛋白和人泛素 (affilins)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；已经蛋白工程改造以实现与不同于天然配体的配体结合的结构域。\n[0367] CTLA-4 (细胞毒性T 淋巴细胞-相关的抗原 4)是主要在CD4+ T-细胞上表达\n的CD28-家族受体。其胞外结构域具有可变结构域样Ig 折叠。对应于抗体CDR的环可被异源序列取代，以赋予不同的结合特性。工程改造以具有不同的结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies。进一步的详细信息参见Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。\n[0368] 脂质运载蛋白为运输小疏水分子(诸如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质)的胞外蛋白家族。它们具有在规范结构(canonical structure)的开放末端有多个环的刚性β-折叠二级结构，可将其工程改造以结合不同的靶抗原。Anticalin大小为160-180个氨基酸，源自脂质运载蛋白。关于进一步的详细信息参见Biochim Biophys Acta 1482: \n337-350 (2000), US7250297B1和US20070224633。\n[0369] 亲和体是源自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，可将其进行工程改造以结合抗原。\n结构域由约58个氨基酸的3个螺旋束组成。已经通过让表面残基随机化产生文库。关于进一步的详细信息参见 Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)和EP1641818A1。\n[0370] Avimer是源自A-结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采取确定的二硫化物键合的结构。通过A-结构域家族展示的天然变异的改组(shuffling)来产生多样性。关于进一步的详细信息参见Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。\n[0371] 转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可通过在容许的表面环插入肽序列，将转\n铁蛋白进行工程改造以结合不同的靶抗原。工程改造的转铁蛋白支架实例包括穿膜抗\n体(Trans-antibody)。关于进一步的详细信息参见J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。\n[0372] 设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)源自锚蛋白，所述锚蛋白是介导完整的膜蛋白与细胞骨架的连接的蛋白家族。单锚蛋白重复是由2个α-螺旋和1个β-转角组成的33\n个残基基序。可通过将每个重复的第一个α-螺旋和β-转角处的残基随机化，将其进行工程改造以结合不同的靶抗原。可通过增加模块数目来增加其结合界面(亲和力成熟的方法)。关于进一步的详细信息参见J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), \n1700-1705 (2003)和J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)和US20040132028A1。\n[0373] 纤连蛋白是可进行工程改造以结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个结构域的天然氨基酸序列骨架组成。可对β-夹心的一\n端的三个环进行工程改造以使Adnectin特异性识别目的治疗靶。关于进一步的详细信息参见Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。\n[0374] 肽适配体是由恒定支架蛋白组成的组合型的识别分子，所述恒定支架蛋白通常为含有在活性位点插入的限定的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于进一步的详细信息参见Expert Opin. Biol. Ther.5, 783-797 (2005)。\n[0375] 微抗体源自天然存在的25-50个氨基酸长的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥 - 微蛋白实例包括KalataBl和芋螺毒素和打结素(knottin)。微蛋白具有可工程改造以包括最多达25个氨基酸而不影响所述微蛋白的总折叠的环。关于工程改造的打结素结构域的进一步的详细信息参见WO2008098796。\n[0376] 其他表位结合结构域包括已经用作工程改造不同靶抗原结合特性的支架的蛋白，所述蛋白包括人γ-晶体蛋白和人泛素 (affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C-型凝集素结构域 (四连接\n素)，它们在Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, 由Stefan Dubel编辑)和\nProtein Science 15:14-27 (2006)的第7章非抗体支架中综述。本发明的表位结合结构域可以源自任何这些可替代蛋白结构域。\n[0377] 本文中所用的术语“抗原结合位点”是指在蛋白上能够特异性与抗原结合的位点，其可以是单结构域，例如表位-结合结构域，或其可以是如在标准抗体中存在的配对的VH/VL结构域。在本发明的一些实施方案中，单链Fv (ScFv)结构域可以提供抗原结合位点。\n[0378] 术语“mAb/dAb”和dAb/mAb”在本文中用于指本发明的抗原结合蛋白。这2个术语可以互换使用，且意在具有与本文中所用的相同含义。\n[0379] 本文中所用的术语“抗原结合蛋白”是指抗体、抗体片段例如结构域抗体(dAb)、ScFv、FAb、FAb2和其他蛋白构建体。抗原结合分子可以包含至少一个Ig 可变结构域，例如抗体、结构域抗体(dAbs)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ScFv、双抗体、mAbdAb、亲和体、异源缀合物抗体或双特异性抗体。在一个实施方案中，所述抗原结合分子是抗体。在另一个实施方案中，所述抗原结合分子是dAb，即免疫球蛋白单可变结构域，诸如VH、VHH或VL，其独立于不同的V区或结构域特异性地结合抗原或表位。抗原结合分子能够结合2种靶，即它们可以是双靶向蛋白。抗原结合分子可以是抗体和抗原结合片段的组合，例如，与单克隆抗体相连的一个或多个结构域抗体和/或一个或多个 ScFv。抗原结合分子也可以包含非-Ig结构域，例如作为选自下述的支架的衍生物的结构域：CTLA-4 (Evibody)；脂质运载蛋白；源自蛋白A的分子诸如蛋白A (亲和体、SpA) 的Z-结构域、A-结构域 (Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEl和GroES；转铁蛋白(穿膜抗体(transbody))；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适配体；C-型凝集素结构域 (四连接素)；人γ-晶体蛋白和人泛素 (affilins)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz类型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；它们已经蛋白工程改造，以实现与OSM的结合。本文中所用的“抗原结合蛋白”能够拮抗和/或中和人OSM。另外，抗原结合蛋白可以如下抑制和或阻断OSM活性：通过结合OSM并阻止天然配体结合和/或激活gp130受体。\n[0380] 本文中所用的术语“效应功能”意指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用和经由FcRn受体的抗体再循环中的一种或多种。对于IgG抗体，效应功能性包括ADCC和ADCP通过重链恒定区与免疫细胞表面上存在的Fcγ受体家族的相互作用介导。在人中，这些包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在与抗原结合的抗原结合蛋白和Fc/ Fcγ复合物形成之间的相互作用诱导一系列效应，包括细胞毒性、免疫细胞活化、吞噬作用和炎性细胞因子的释放。\n[0381] 在抗原结合蛋白的恒定区和多种Fc受体(FcR)之间的相互作用被认为介导抗原结合蛋白的效应功能。显著的生物学效应可以是效应功能性的结果，特别是抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体固定(补体依赖性细胞毒性或CDC)、和抗原结合蛋白的半衰期/清除。通常，介导效应功能的能力要求抗原结合蛋白与抗原的结合，并且并非所有抗原结合蛋白都介导每种效应功能。\n[0382] 效应功能可以以许多方法进行测量，包括例如经由FcγRIII与天然杀伤细胞的结合或经由FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量ADCC效应功能。例如，本发明的抗原结合蛋白可以在天然杀伤细胞测定中就ADCC效应功能进行评价。此类测定的实例可以在Shields等人，2001 The Journal of Biological Chemistry，第276卷，第6591-6604页；Chappel等人，1993 The Journal of Biological Chemistry，第268卷，第25124-25131页；Lazar等人，2006 PNAS, 103; 4005-4010中发现。\n[0383] 确定CDC功能的测定的实例包括在1995 J Imm Meth 184:29-38中所述的那些。\n[0384] 人恒定区的一些同种型特别是IgG4和IgG2同种型基本上缺乏下述功能：a)通\n过经典途径的补体活化；和b)抗体依赖性细胞的细胞毒性。取决于所需效应性质，可以进行对于抗原结合蛋白的重链恒定区的多种修饰。已分开描述了含有特定突变的IgG1恒定区，所述突变减少与Fc受体的结合，并且因此减少ADCC和CDC (Duncan等人，Nature \n1988, 332; 563-564; Lund等人J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel等人 \nPNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton和Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan等 人，Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh等 人，J. Virol. 2001, 75 (24); \n12161-12168)。\n[0385] 在本发明的一个实施方案中，提供了包含恒定区的抗原结合蛋白，使得所述抗原结合蛋白具有减少的ADCC和/或补体活化或效应功能性。在一个这样的实施方案中，所述重链恒定区可以包含IgG2或IgG4 同种型的天然有缺陷的恒定区或突变的IgG1恒定区。\n合适的修饰的实例描述在EP0307434中。一个实例包含在235和237位的丙氨酸残基的取代(EU索引编号)。\n[0386] 也已经描述了含有特定突变或在残基Asn297上具有改变的糖基化的人IgG1恒定区以增强与Fc受体的结合。也已经显示，在一些情况下，这些突变增强ADCC和CDC(Lazar等人 PNAS 2006, 103; 4005-4010；Shields等人 J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604；\nNechansky等人 Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817)。\n[0387] 在本发明的一个实施方案中，这种突变在选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置处或其他IgG同种型中的等效位置处。合适突变的实例是S239D和I332E和A330L。\n在一个实施方案中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在239和332位处突变，例如S239D和I332E，或在进一步实施方案中，其在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变，例如S239D和I332E和A330L。(EU索引编号)。\n[0388] 在本发明的可替代实施方案中，提供了抗原结合蛋白，其包含具有改变的糖基化概况的重链恒定区，使得该抗原结合蛋白具有增强的效应功能。例如，其中抗原结合蛋白具有增强的ADCC或增强的CDC或其中其具有增强的ADCC和CDC效应功能。产生具有改变的\n糖基化概况的抗原结合蛋白的合适的方法的实例描述于WO2003011878、WO2006014679和EP1229125，所有这些都可以被应用到本发明的抗原结合蛋白。\n[0389] 本发明还提供了用于产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包含以下步骤：\n[0390] a) 培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其中在所述重组宿主细胞中编码α-1,6-海藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和[0391] b) 回收抗原结合蛋白。\n[0392] 这种产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa, Inc. (Princeton, NJ)获得的POTELLIGENT™技术系统进行，其中缺乏FUT8基因的功能性拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的单克隆抗体，该活性相对于具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体增加。POTELLIGENT™技术系统的方面描述于US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中，其都通过引用并入本文。\n本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。\n[0393] 在本发明的一个实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，例如包含具有至少一个来自IgG3的CH2结构域的嵌合重链恒定区以使得抗原结合蛋白具有增强的效应功能的抗原结合蛋白，例如其中其具有增强的ADCC或增强的CDC，或增强的ADCC和CDC功能。在一个这种实施方案中，抗原结合蛋白可以包含一个来自IgG3的CH2结构域或两个CH2结构域都可以来自IgG3。\n[0394] 还提供了产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：\n[0395] a) 培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其中所述表达载体包含编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的Fc结构域的核酸序列；\n[0396] b) 回收抗原结合蛋白。\n[0397] 这种产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa, Inc. (Princeton, NJ)和Kyowa Hakko Kogyo (now, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd.获得的\nCOMPLEGENT™ 技术系统进行，其中重组宿主细胞包含表达载体，其中表达编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的核酸序列以产生具有增强的补体依赖\n性细胞毒性(CDC)活性的抗原结合蛋白，该活性相对于缺乏这种嵌合Fc结构域但其他方面都相同的抗原结合蛋白增加。COMPLEGENT™技术系统的方面描述于WO2007011041和\nUS20070148165中，其都通过引用并入本文。在可替代的实施方案中，可以通过在IgG链的Fc区中引入序列特异性突变来增加CDC活性。本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。\n[0398] 本领域技术人员将显而易见的是，这种修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此组合使用以进一步增强效应功能。\n[0399] 在本发明的一个这种实施方案中，提供了包含重链恒定区的抗原结合蛋白，所述重链恒定区包含突变和嵌合的重链恒定区，例如其中抗原结合蛋白包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域，其中IgG1 CH2结构域在选自239和332和\n330的位置处具有一个或多个突变(例如突变可以选自S239D和I332E和A330L)以使得抗\n原结合蛋白具有增强的效应功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。在一个实施方案中，IgG1 CH2结构域具有突变S239D和I332E。\n[0400] 在本发明的可替代实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区且具有改变的糖基化概况的抗原结合蛋白。在一个这种实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域且具有改变的糖基化概况以使得海藻糖与甘露糖的比率为0.8：3或更低，例如其中抗原结合蛋白经去海藻糖基化以使得所述抗原结合蛋白与具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等效抗原结合蛋白相比具有增强的效应功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。\n[0401] 在可替代的实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一个IgG3 CH2结构域和至少一个来自IgG1的重链恒定结构域，其中两个IgG CH2结构域都根据本文所述的限制进行突变。\n[0402] 在本发明的一个方面，提供了产生本文所述的本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：\n[0403] a) 培养含有表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体含有如本文所述的分离核酸，所述表达载体进一步包含编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的Fc核酸序列，且其中在该重组宿主细胞中编码α-1,6-海藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和\n[0404] b) 回收抗原结合蛋白。\n[0405] 这种产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa, Inc. (Princeton, NJ)获得的ACCRETAMAB™技术系统进行，所述系统组合POTELLIGENT™和COMPLEGENT™技术系统以产生具有增强的ADCC和CDC活性的抗原结合蛋白，所述活性相对于缺乏嵌合Fc结构域且在寡糖上具有海藻糖但其他方面相同的单克隆抗体增加。\n[0406] 在本发明的又另一个实施方案中，提供了包含突变和嵌合的重链恒定区的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有改变的糖基化概况以使得抗原结合蛋白具有增强的效应功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC。在一个实施方案中，突变选自239和332和330位，例如突变选自S239D和I332E和A330L。在进一步实\n施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构\n域。在一个实施方案中，重链恒定区具有改变的糖基化概况使得岩藻糖和甘露糖的比率为\n0.8:3或更低，例如抗原结合蛋白是去岩藻糖基化的，使得所述抗原结合蛋白与等效非嵌合抗原结合蛋白或缺乏所述突变和具有改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区相比具有增强的效应功能。\n[0407] 另一种修饰本发明的抗原结合蛋白的方式涉及通过修饰免疫球蛋白恒定结构域或FcRn(新生Fc受体)结合结构域来延长这种蛋白的体内半衰期。\n[0408] 在成年哺乳动物中，FcRn也称为新生Fc受体，通过充当结合且补救IgG同种型 的抗体不受降解的保护性受体，在维持血清抗体水平中起关键作用。IgG分子被内皮细胞内吞，如果它们与FcRn结合，那么再循环进入循环内。相比之下，不与FcRn结合的IgG分子进入细胞，靶向溶酶体途径，在其中降解。\n[0409] 认为新生FcRn受体既参与抗体清除又参与组织间的胞转作用 (参见Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57和Ghetie等人 (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, \n739-766)。确定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、\nThr307、Gln311、Asn434和His435。在此部分所述的任何这些位置处的改变可能提高本发明抗原结合蛋白的血清半衰期和/或改变其效应性质。\n[0410] 本发明的抗原结合蛋白可以具有增加恒定结构域或其片段对FcRn的亲和力的氨基酸修饰。延长治疗性和诊断性IgG和其他生物活性分子的半衰期可以具有多种益处，包括降低这些分子的给药的量和/或频率。因此，在一个实施方案中，提供了本文提供的本发明的抗原结合蛋白或融合蛋白，其包含具有一个或多个这些氨基酸修饰的IgG恒定结构域的全部或部分(FcRn结合部分)和缀合于这种修饰的IgG恒定结构域的非IgG蛋白或非蛋\n白分子，其中存在修饰的IgG恒定结构域延长抗原结合蛋白的体内半衰期。\n[0411] PCT公开号WO 00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和力的变体Fc区\n的多肽，所述多肽包含在Fc 区的下列氨基酸位置的任一个或多个处的氨基酸修饰：238、\n252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、\n362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、和447，其中Fc区中残基的编号是EU索引的编号(Kabat等人)。\n[0412] PCT公开号WO 02/060919 A2公开了包含IgG恒定结构域的修饰IgG，相对于野生型IgG恒定结构域，所述IgG恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中，与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，所述修饰IgG具有增加的半衰期，且其中一个或多个氨基酸修饰是在位置 251、253、255、285-290、308-314、385-389 和 428-435 中的一个或多个处。\n[0413] Shields 等人(2001, J Biol Chem ; 276:6591-604)使用丙氨酸扫描诱变来改变人IgG1抗体的Fc区中的残基，然后评价与人FcRn的结合。在改变为丙氨酸时有效废除与FcRn的结合的位置包括I253、S254、H435和Y436。在结合中显示较不显著的减少的其他位置如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置在改变为丙氨酸时显示FcRn 结合的改善；这些位置中尤其是P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424和N434。许多其他氨基酸位置显示FcRn结合的轻微改善(D265、N286、V303、K360、Q362和A378)或无变化\n[0414] \n[0415] \n。\n[0416] 针对具有改善的与FcRn的结合的组合变体发现了最显著的效果。在pH 6.0下，与相对于天然IgG1与FcRn的结合，E380A好2倍和N434A好3. 5倍相比，E380A/N434A变\n体相对于天然IgGl显示与FcRn的结合好超过8倍。向其中加入T307A导致结合相对于天\n然IgG1改善12倍。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含E380A/N434A突变且增强了与FcRn的结合。\n[0417] Dall'Acqua等人(2002, J Immunol.;169:5171-80)描述了针对小鼠 FcRn 的 人IgG1铰链-Fc片段噬菌体展示文库的随机诱变和筛选。他们公开了251、252、254-256、\n308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434和436位的随机诱变。IgG1-人FcRn复合体稳定性的主要改善存在于定位在横跨Fc-FcRn界面的带中的取代残基中 (M252、S254、T256、H433、N434和Y436)，且以较小的程度存在于外周残基如V308、L309、 Q311、G385、Q386、P387 和 N389 的取代。通过组合M252Y/S254T/T256E 和H433K/N434F/Y436H突变获得了对人FcRn具有最高亲和力的变体，且相对于野生型IgG1显示亲和力增加 57倍。与野生型IgG1相比，这种突变的人IgG1的体内行为显示在猕猴中的血清半衰期增加近4倍。\n[0418] 因此本发明提供了与FcRn优化结合的抗原结合蛋白的变体。在优选的实施方案中，抗原结合蛋白的所述变体包含在所述抗原结合蛋白的Fc区中的至少一个氨基酸修饰，其中与所述亲本多肽相比，所述修饰选自Fc区的\n[0419] \n[0420] ，其中Fc区中的氨基酸的编号是Kabat的EU索引的编号。\n[0421] 在本发明的进一步方面，修饰是M252Y/S254T/T256E。\n[0422] 此外，各种出版物描述了用于获得通过以下改变其半衰期的生理活性分子的方法：通过将FcRn结合多肽引入分子中(WO 97/43316；美国专利号5,869,046；美国专利号\n5,747,035；WO 96/32478；WO 91/14438)；或通过使分子与保留FcRn结合亲和力但对其他 Fc受体的亲和力已经大大降低的抗体融合(WO 99/43713)或与抗体的FcRn结合结构域融合(WO 00/09560；美国专利号4,703,039)。\n[0423] 此外，还提供了产生具有减少的生物半衰期的抗原结合蛋白的方法。其中His435突变为丙氨酸的变体IgG导致FcRn结合的选择性损失和显著减少的血清半衰期(Firan等人2001, International immunology 13:993)。美国专利号6,165,745公开了通过将突变引入编码抗原结合蛋白的DNA区段中来产生具有减少的生物半衰期的抗原结合蛋白的方法。突变包括Fc-铰链结构域的253、310、311、433 或434位上的氨基酸取代。\n[0424] 如本文中所用的术语“非人抗体或其抗体片段”意指来源于除人以外的任何物种的抗体或其片段，其中人抗体包括嵌合抗体。\n[0425] 术语“供体抗体”是指这样的抗体(单克隆和/或重组)，其贡献出其可变结构域、CDR或其其他功能片段或类似物的氨基酸序列给第一免疫球蛋白配偶体，以便提供改变的免疫球蛋白编码区，并导致表达具有供体抗体特征性的抗原特异性和中和活性的改变的抗体。\n[0426] 术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组)，其贡献编码其重链和/或轻链构架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部(或任何部分，但优选为\n全部)氨基酸序列给第一免疫球蛋白配偶体。人抗体为受体抗体。\n[0427] 如本文中所用的术语“人受体序列”意指抗体或其抗体片段的构架，其包含源自人抗体或其抗体片段的VH或VL构架或其中可以并入来自非人物种的CDR的人共有序列构架的氨基酸序列。\n[0428] 如本文中所用的术语“并入”CDR或高变区涵盖通过其使非人CDR位于人受体构架中的任何方式。应当理解的是，这可以多种方式实现，例如，可以通过突变编码非人可变结构域序列的核酸以使得其构架残基变为人受体构架残基，或通过突变编码人可变结构域序列的核酸以使得CDR变为非人残基，或通过合成编码所需序列的核酸来产生编码所需氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，在计算机芯片上产生最终序列。\n[0429] 现在仅借助实施例来描述本发明。随附权利要求可以包括一个或多个下列实施例的概括。\n实施例\n[0430] 实施例1 单克隆抗体生成和选择\n[0431] 1.1 免疫策略\n[0432] 从源自用重组糖基化人OSM(K598)免疫的小鼠的杂交瘤鉴定了抗人OSM mAb \nS168110G08(1)1A09 (“10G8”)。使用总共10µg蛋白与AS02样佐剂常规地腹膜内免疫雌性SJL小鼠(n=2, Harlan, UK, HOST SP06-06031)。增强免疫为使用5μg蛋白。每次增强后采集测试血液，且选择具有最佳响应的小鼠(168#4)用于杂交融合(R16092/177-198)。\n切割脾脏，破坏，且用小鼠骨髓瘤细胞X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58)进行PEG1500诱导的体细胞融合。将融合物铺板进10×96孔板和5 Nunc \nOmnitrays中的含有甲基纤维素的半固体培养基中。将集落从半固体培养基挑至5×96孔板中。\n[0433] 1.2 筛选策略\n[0434] 1.2.1 初始筛选\n[0435] 对于抗OSM备用抗体的初始筛选基于选择能够结合抗人OSM的杂交瘤材料和为了选择抗位点II分子而抑制人和猕猴OSM结合gp130受体。通过BIACore解离动力学分析\n来自这些筛选的阳性杂交瘤上清液以选择最佳结合杂交瘤。\n[0436] 从融合物回收了超过3000个克隆，其中86个通过结合ELISA显示与人OSM的明显结合。对通过用人和猕猴OSM的gp130 ELISA阳性杂交瘤进行关于抗位点II活性的分析。\n抑制人和猕猴OSM结合人GP13的杂交瘤克隆进行BIACore解离速率动力学分析。将通过\n解离速率分析的前四种人OSM结合剂10G8、9G2、3E3和2B7进行单克隆且重新筛选。在来自每种杂交瘤的单克隆之间在BIACore和ELISA结合活性或gp130抑制中没有差异。子代克隆：10G8.A9、9G2.C1、2B7.A6和3E3.A1进行冷冻保存，且用于无血清按比例放大和纯化。\n这些进入二次筛选。\n[0437] 1.2.2 二次筛选\n[0438] 将四种子代克隆10G8/A9、9G2/C1、2B7/A6和3E3/A1进行排序的二次筛选包括针对人/猕猴OSM的BIACore动力学分析；用人/猕猴OSM的人gp130 ELISA；用人/猕猴OSM\n的KB细胞中和测定。除这个以外，评价了中和内源中性粒细胞衍生的人OSM、保留在25％人AB血清中的中和能力和针对人LIF的反应性的能力。\n[0439] BIACore分析：\n[0440] BIACore分析表明，与可替代的非竞争性抗OSM小鼠抗体(15E10)相比，10G8、9G2、\n3E3和2B7对于人OSM具有更高的亲和力(表1)。10G8显示出对于人(~550pM)和猕猴\n(~310pM)OSM最大的亲和力。与15E10相比，10G8对于人OSM具有8倍/0.9 log增加的亲\n和力，且对于猕猴OSM具有11倍/1 log增加的亲和力。10G8和9G2都表现出对于猕猴OSM比对于人OSM的增加的亲和力。\n[0441] 表1：BIACore动力学-与15E10相比的四种抗OSM备份最重要抗体10G8、9G2、3E3和2B7。\n[0442] \n[0443] 人gp130 ELISA：\n[0444] 人gp130 ELISA使用相对高水平的OSM (25ng/ml)，降低了其在配体过量时区分高亲和力抗体与更低亲和力抗体的能力。4次重复该测定之后，显示10G8是在该测定中在阻断人和猕猴OSM与gp130受体结合中最有效的抗体(图1；表2)。\n[0445] 表2：人gp130 ELISA- 对10G8、9G2、3E3和2B7针对人和猕猴OSM的活性进行排序的重复4次的人gp130 ELISA的概述。添加非竞争性小鼠抗体15E10和阴性对照工具抗体用于比较。\n[0446] \n[0447] 在25％人AB血清存在的情况下重复人gp130测定。该测定的两次重复显示，所有四种最重要抗体10G8、9G2、3E3和2B7，连同15E10，保留了它们阻断人和猕猴OSM与gp130结合的能力(数据未显示)。\n[0448] KB细胞中和测定：\n[0449] OSM诱导从KB细胞(表达gp130和OSM受体的mRNA的人上皮细胞系)的IL-6释\n放。简而言之，在37℃用1 ng/ml OSM +/- 不同抗体浓度刺激KB细胞持续16-18小时，且通过ELISA监测IL6释放。与gp130测定相比，KB细胞中和测定使用减少量的OSM(1ng/ml相比于25ng/ml)。这使其成为用于区分高亲和力中和剂与低亲和力中和剂的辨别力更强的测定。与抗体15E10相比，在KB细胞中和测定中，10G8针对人OSM是15倍/1.2 log更\n有效。从测定的三次重复，10G8在所有重复中排序第一，给出针对人OSM的8ng/ml和针对猕猴OSM的6ng/ml的平均IC50值(图2；表3)。9G2在该测定中排序第二，针对人和猕猴\nOSM的IC50分别为18ng/ml和15ng/ml。\n[0450] 表3：KB细胞中和测定 - 对10G8、9G2、3E3和2B7针对人和猕猴OSM的活性进行排序的3次重复的KB细胞中和测定的概述。添加抗体15E10用于比较目的。该工具抗体\n用作阴性对照。\n[0451] \n[0452] 在25％人AB血清存在的情况下，10G8、9G2和3E3保留了它们中和人和猕猴OSM的能力(图3)。15E10和2B7无法产生量足以计算IC50值的拟合曲线。如同非人血清KB\n细胞测定，最有效的抗体是10G8，且9G2排序第二。在25％AB血清存在的情况下可见活性的一些下降。在一定程度上，这可能是由于AB血清干扰该测定的读出值。在该测定中观察到比在非人血清中更高的IL-6背景水平。\n[0453] 内源人OSM(gp130测定)：\n[0454] 所有四种最重要抗体10G8、9G2、3E3和2B7以及抗体15E10都抑制来自4个独立供体的内源人OSM(图4)。从GM-CSF刺激健康人中性粒细胞生成这种天然OSM。\n[0455] 人LIF反应性(KB细胞中和测定)：\n[0456] 人LIF是IL-6家族与人OSM最密切相关的成员。初始研究显示，10G8、9G2、3E3和\n2B7和人LIF之间没有反应性，表明这些抗体是OSM特异性的(图5)。\n[0457] 狨猴OSM反应性(KB细胞中和测定)：\n[0458] 在KB细胞中和测定中显示所有四种最重要分子10G8、9G2、3E3和2B7中和狨猴OSM(图6)。15E10和一组三种额外抗人OSM抗体10D3DLE、OM4.11.17和OM4.11.31也无\n法中和狨猴OSM。\n[0459] 根据两次测定重复，10G8是狨猴OSM的最有效的中和剂，9G2排序第二。\n[0460] 1.2.3 选择用于进行的单克隆\n[0461] 从四种抗体中，选择10G8作为用于嵌合化的最重要抗体，因为它在所有上面列出的测定中排序第一。在人源化困难的情况下，还选择9G2作为备份分子用于嵌合化。\n[0462] 1.3 抗体工程改造和最重要抗体系列选择\n[0463] 1.3.2 可变区序列\n[0464] 分离四种选择的单克隆2B7、3E3、9G2和10G8的可变基因且平行测序，以允许生成对应的嵌合抗体。从杂交瘤细胞沉淀中提取总RNA。通过RT-PCR或5'RACE扩增编码重和轻链V基因的序列，然后TA克隆用于序列分析。对于每种抗体一式两份进行V-基因扩增，以实现来自两个独立反应的正确序列的随后验证。对于所有4个杂交瘤克隆，获得可变重和可变轻链的序列。蛋白序列的比对显示，抗体在可变重和轻链区中都具有高度的序列同一性(图7 & 8)。这些抗体的重和轻链可变区的序列描述于SEQ ID NO. 26-48中。参见表A。\n[0465] 四种最重要单克隆和抗体15E10之间的序列比较显示轻(图9)或重(图10)链\n仅具有50-60％同一性。这表明，这些抗体结合不同于抗体15E10所识别的那些的表位。\n[0466] 1.3.3 抗体克隆\n[0467] 1.3.3.1 嵌合体的构建\n[0468] 通过将如上所述的小鼠VH和VL区分别嫁接到密码子优化的人γ1 Fc野生型和人κ恒定区上而生成10G8和9G2作为嵌合抗体。嵌合抗体用来验证克隆的小鼠V区的功能\n性，进行纯化，且用作当测试人源化构建体时的参考。基于2.3.1中确定的5'和3'DNA序列设计PCR引物，以包括对于克隆进Rlx和pTT5哺乳动物表达载体中所需的限制性位点。\n还设计引物以便用Campath信号序列替代天然信号序列。设计Hind III和Spe I位点以\n框入VH结构域且使其克隆到含有人γ1 C区的改进的Rld或pTT5载体中。将SpeI位点\n引入构架4序列导致FR4中108位的单一氨基酸改变。对于9G2 VH区，内部SpeI位点存\n在于DNA序列的5'-末端，设计用于9G2嵌合体的PCR引物以去除该内部SpeI位点。设计\nHind III和BsiWI位点以框入VL结构域且使其克隆到含有人κ C区的改进的Rln或pTT5\n载体中。\n[0469] 鉴定具有正确的VH和VL序列的克隆，且制备质粒用于在CHO或HEK细胞中的表\n达。\n[0470] 1.3.3.2 嵌合体的表达\n[0471] 分别将编码嵌合10G8和9G2 VH和VL结构域的Rld和Rln质粒通过电穿孔共转染\n到CHOE1A细胞中，且在多克隆细胞培养物中表达。使用脂质体转染方法将编码嵌合10G8和9G2 VH和VL结构域的pTT质粒共转染到HEK293细胞中，以允许瞬时附加体表达，附加体表达系统中的转染可以潜在地产生mg量的抗体。通过在蛋白A琼脂糖上的亲和层析从细胞培养上清液中纯化产生的嵌合抗体(10G8c和9G2c)。通过SDS-PAGE分析和大小排阻层析法QCed纯化的抗体。\n[0472] 1.3.3.3 结合测定数据\n[0473] 人OSM结合ELISA：\n[0474] 10G8和9G2嵌合体都成功地与人OSM结合，其程度上比15E10嵌合体(15E10c)更大(图11)。这是直接ELISA，其中人OSM以1µg/ml包被，且使用抗人IgG检测结合的抗体。\n[0475] BIACore分析：\n[0476] BIACore分析显示，与小鼠亲本抗体相比，在嵌合10G8和9G2分子中人或猕猴OSM有很少损失或没有损失(表4)。10G8嵌合体排序第一(654pM)，在9G2嵌合体(1.33nM)之前。所有抗体都表现出对于猕猴OSM比对于人OSM的增加的亲和力。\n[0477] 表4：BIACore动力学- 10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体抗体的结合动力学。\n[0478] \n[0479] 1.3.3.4 功能性测定数据\n[0480] 人gp130 ELISA：\n[0481] 人gp130 ELISA使用相对高水平OSM(25 ng/ml)，降低其在配体过量时区分高亲和力抗体与较低亲和力抗体的能力。在3次重复该测定后，10G8嵌合体是抑制人和猕猴OSM与gp130受体结合的最有效抗体。该测定中10G8小鼠亲本抗体和10G8嵌合体的值非常相似(图12；表5)。9G2与其嵌合体之间不存在显著性差异。\n[0482] 表5：人gp130 ELISA – 排序10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体针对人和猕猴OSM的活性的三次重复的人gp130 ELISA的概述。添加抗体15E10用于比较目的。工具抗体用作阴性对照。\n[0483] \n[0484] 对于人和猕猴OSM，在人AB血清存在的情况下重复人gp130测定。所有分子都在\n25%血清中保留其活性。针对人和猕猴OSM，10G8嵌合体和10G8小鼠亲本抗体分别排序第一和第二。这两种抗体的IC50值相似。在9G2嵌合体(排序第三)与其小鼠亲本抗体之\n间没有观察到显著性差异(数据未显示)。\n[0485] KB细胞中和测定：\n[0486] 10G8小鼠亲本抗体与嵌合体行为相似(图13；表6)。该测定中9G2小鼠亲本抗\n体和嵌合体分别排序第三和第四。\n[0487] 表6：KB细胞中和测定 – 排序10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体针对人和猕猴OSM的活性的三次重复的KB细胞中和测定的概述。添加抗体15E10用于比较目的。工\n具抗体用作阴性对照。\n[0488] \n[0489] 在25%人AB血清存在的情况下，10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体保留其中和人和猕猴OSM的能力(图14)。在25% AB血清存在的情况下发现活性有一定程度的降低。\n尽管在1 μg/ml抗体起始浓度下不能计算IC 50 值，但是除无关阴性对照以外所有抗体都发现清楚的滴定中和作用。这种活性降低可以在一定程度上归因于AB血清干扰该测定读出值。与非人血清中相比，该测定中观察到更高的IL-6背景水平。\n[0490] 内源人OSM (gp130测定)：\n[0491] 10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体抑制来自两个独立供体的内源人OSM(图\n15)。对于这两种供体，10G8和10G8嵌合体共同排序第一，而9G2和其嵌合体分别排序第三和第四(表7)。由GM-CSF刺激健康人中性粒细胞生成这种天然OSM。\n[0492] 表7：内源OSM人gp130测定 – 评价10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体针对内源人OSM的活性的gp130 ELISA中两个中性粒细胞供体的概述。工具抗体用作阴性对照。\n[0493] \n[0494] 人LIF反应性(KB细胞中和测定)：\n[0495] 人LIF是IL-6家族中与人OSM最密切相关的成员。三次重复人LIF KB细胞测定\n显示，10G8、10G8嵌合体、9G2和9G2嵌合体不中和人LIF。该测定中，市售抗人LIF抗体的确中和LIF(图16)。这证明这些抗体是OSM特异性的。\n[0496] 实施例2：人源化\n[0497] 2.1.1 重链人源化策略\n[0498] 在人V基因种系数据库的BLAST分析后，选择与小鼠10G8可变重链序列具有74%同一性(包括CDR)的人种系IGHV3_7)作为用于人源化的优选受体构架。基于序列相似性，将种系V区在计算机芯片上与合适的FR4(在这种情况下为JH2小基因)组合(Kabat Vol.\nII)。JH2小基因残基的前六个残基落入CDR3区内，这取代为来自供体抗体的引入CDR。基于序列比较和对抗体功能的可能影响，生成三种人源化重链变体。构建体H0是来自10G8(使用Kabat定义)的小鼠CDR直接嫁接到上文选择的人受体构架内。构建体H1和H2基于\nH0，两者并入一个额外的构架突变，其在每个构建体中是不同的；分别为2位和105位。\n[0499] 2.1.2 轻链人源化策略\n[0500] 在人V基因种系数据库的BLAST分析后，选择与小鼠10G8可变轻链序列具有64%同一性(包括CDR)的人种系IGKV4_1)作为用于人源化的优选受体构架。基于序列相似性，将种系V区在计算机芯片上与合适的FR4(在这种情况下为J区κ4小基因)组合(Kabat \nVol.II)。JK-4小基因残基的前两个残基落入CDR3区内，且等同于小鼠10G8轻链CDR3中的最后两个残基。基于序列比较和对抗体功能的可能影响，生成五种人源化轻链变体。构建体L0是来自10G8(使用Kabat定义)的小鼠CDR直接嫁接到上文选择的人受体构架内。\n构建体L1、L2和L3基于L0，各自并入一个额外的构架突变，其在每个构建体中是不同的；\n分别为46位、84位和103位。构建体L4并入所有三个上述回复突变。\n[0501] 2.1.3人源化载体的构建\n[0502] 使用LETO 1.0软件(Entelechon GmbH)序列最佳化人源化可变区的DNA序列，并且通过重叠寡核苷酸的叠加和PCR扩增从头合成。引物包括用于克隆到哺乳动物表达载体内的限制性位点和用于分泌的人免疫球蛋白信号序列。使用HindIII和SpeI将人源化可变重区H0-H2克隆到含有人γ1恒定区的哺乳动物表达载体内。平行地，使用HindIII和BsiWI将人源化可变轻区L0-L4克隆到含有人κ恒定区的哺乳动物表达载体内。\n[0503] 2.1.4 人源化变体组的初始筛选\n[0504] 为了筛选和缩小人源化变体组(3条重链×5条轻链=15)，在HEK细胞中表达抗体且通过BIACore、ELISA和功能性测定进行评价。\n[0505] 2.2 人源化10G8抗体生物测定：人源化mAb的嵌合体\n[0506] 2.2.1 二次筛选\n[0507] 对人源化10G8抗体(列于表9中)进行排序的二次筛选包括针对人OSM的\nBIACore动力学分析；用人/猕猴OSM的人gp130 ELISA；用人/猕猴OSM的KB细胞中和测\n定。除此之外，评价在25%人AB血清中阻断gp130结合的能力。\n[0508] BIACore分析：\n[0509] 对转染上清液的初始BIACore分析表明，与L0、L2和L3人源化变体相比，L1和L4人源化变体对于人OSM具有更高的亲和力(表8)。与单独直接嫁接物(H0L0)和10G8嵌合\n体相比，这些轻链突变改善了亲和力。与直接嫁接物H0相比，重链变体H1和H2对于抗体亲和力的影响很小。\n[0510] 对按比例放大的纯化的L1和L4变体的分析显示，这些mAb对人和猕猴OSM的亲\n和力之间的差异非常小(表9)。\n[0511] 表8：BIACore动力学 - 15种抗 OSM备用人源化 10G8抗体转染上清液与 10G8嵌合体相比的人 OSM结合动力学。\n[0512] \n[0513] 表9：BIACore动力学 - 抗OSM人源化 10G8 L1和 L4变体抗体的纯化批次与 10G8嵌合体相比的猕猴和人OSM结合动力学。\n[0514] \n[0515] KB细胞中和测定：\n[0516] KB细胞中和测定使用的OSM量与gp130测定相比降低(1 ng/ml相比于25 ng/\nml)。这使得其成为用于区分高亲和力中和剂与低亲和力中和剂的辨别力更强的测定。初始H0、H1、H2、L0、L1、L2、L3和L4变体构建体的KB细胞测定筛选显示L1构建体的优越性(数据未显示)。以较大批次产生这些连同在BIACore分析中进行良好的L4变体用于进一步测定。从3次重复测定，人源化10G8 L1变体排序第一，其针对人OSM的平均IC50值为\n14 ng/ml且针对猕猴OSM的平均IC50值为10 ng/ml(图17；表10)。\n[0517] 表10：KB细胞中和测定–将人源化 10G8 L1和 L4变体针对人和猕猴 OSM的活性排序的三次重复的 KB细胞中和测定的概述。\n[0518] \n[0519] 选择人源化10G8 L1变体用于进一步测试，因为其在KB细胞测定中显示与L4变体相比更强的生物活性。L4变体在CHO-E1a系统中具有非常低产量，且这还将其排除在进一步进展之外。\n[0520] 人gp130 ELISA：\n[0521] 人gp130 ELISA使用相对高水平OSM(25 ng/ml)，降低其在配体过量时区分高亲和力抗体与较低亲和力抗体的能力。在用人源化10G8 L1变体两次重复该测定后，在该测定中显示所有三种变体阻断人和猕猴OSM与gp130受体结合的能力等效(图18)。\n[0522] 还在25%人AB血清存在的情况下进行人gp130测定。两次重复该测定显示所有\n抗体(人源化10G8 H0L1、H1L1和H2L1变体)都保留其阻断人和猕猴OSM与gp130结合的\n能力(数据未显示)。\n[0523] 2.3 Fab片段的分离和10G8 mAb-OSM复合物的结晶\n[0524] 2.3.2 Fab片段的生成\n[0525] 通过在37℃下在含有20 mM磷酸盐缓冲液pH 7、10 mM EDTA和10 mM L-半胱氨酸的缓冲液中用珠粒固定的木瓜蛋白酶(Pierce 20341)消化20h而从10G8亲本抗体生成Fab片段。在消化后，使用一次性塑料柱去除珠粒，然后使用蛋白A型层析(MabSelect, GE Healthcare 17-5438-03)从Fab片段去除污染性Fc片段和未消化的抗体。使用Superdex \n200pg大小排阻层析(SEC)(GE Healthcare 17-1069-01)使用25mM HEPES pH 7.7, 150mM NaCl缓冲液作为流动相进一步纯化含有Fab片段的未结合部分。通过在4℃下将11.5 mg纯化的Fab(GRITS30249)与5.75 mg重组OSM(GRITS23122)混合(摩尔比1：1) 1.5h来制\n备复合物。然后使用Superdex 200pg SEC纯化复合物除去未复合物质。使用配备10kmwco膜(Vivaspin VS2002)的离心浓缩装置将解析的复合物浓缩至44 mg/mL总蛋白(产量\n9.2mg)。使用N末端测序、质谱法和SDS-PAGE验证复合物组分。使用gp130抑制测定确认Fab片段的OSM功能性结合活性(数据未显示)。\n[0526] 2.3.2 10G8-OSM复合物结晶\n[0527] 将10G8 OSM Fab片段与OSM复合，且使用PEG3500作为沉淀剂在20℃下将其结\n晶。使结晶最佳化，送往欧洲同步辐射装置(European Synchrotron Radiation Facility，ESRF)进行分析且在3.5 Å下解析结构。10G8 mAb以良好表面互补性结合OSM的螺旋B和\nC且纯粹通过位阻阻断OSM位点II与gp130受体结合，不与来自位点II的任何残基直接相互作用。当在3.5 Å下解析时直接参与结合(距离小于5 Å)的仅有残基说明于表11和图\n19中。轻链负责阻断作用中的大部分。四个CDR(CDRH2、H3和CDRL1和L3)直接或通过水介导的相互作用结合OSM的螺旋B和C。结合10G8 mAb后OSM分子不存在明显变形。由于\n两个CDR(CDRH1和L2)未结合，所以制备其中这些CDR中的一个或两个回复突变为人序列的抗体变体。这可以产生与直接人源化嫁接物相比免疫原性较低的分子。\n[0528] 表11：\n[0529] \n[0530] 2.3.3\n[0531] 2.3.4 人源化10G8抗体：人CDR取代\n[0532] 内部解析的抗OSM 10G8 mAb与OSM的复合物的晶体结构鉴定了CDRH1和CDRL2\n不直接参与抗原结合。选择合适的人种系CDR以替代这些小鼠种系CDR。测试两种CDRH1人种系序列和两种CDRL2人种系序列对抗原结合的作用。对于重链和轻链CDR，测试来自初始人种系受体构架的序列(分别为IGHV3_7和IGKV4_1)以及还有基于CDR和侧接构架同\n源性选择的两种其他人种系序列(IGHV3_23和IGKV1_5)。将人种系CDRH1和CDRL2序列替代为人源化H0和L1 V区中的各自的小鼠CDR。如部分1.1.4中，通过重叠寡核苷酸的构建和PCR扩增从头合成新的V区。\n[0533] 2.4 人源化10G8抗体生物测定：用人源化非结合CDR将人源化10G8 H0L1 mAb转化为人源化10G8 mAb\n[0534] 2.4.1 二次筛选\n[0535] BIACore分析：\n[0536] 对来自各种人源化10G8 H0L1 CDRH1和CDRL2构建体的转染上清液的BIACore\n分析表明，完全保留准候选mAb的人OSM亲和力的唯一抗体是H0(IGHV3_23)L1分子(表\n12)。按比例放大且纯化该构建体连同具有次最佳KD值的两种其他分子(H0L1(IGKV4_1)和H0(IGHV3_23)L1(IGK4_1))用于进一步研究。\n[0537] 表12：BIACore动力学 - 抗OSM备用人源化 10G8 H0L1 CDRH1和 CDRL2变体抗体的转染上清液与 10G8嵌合体相比的猕猴和人 OSM结合动力学。\n[0538] \n[0539] KB细胞中和测定：\n[0540] KB细胞中和测定表明，人源化10G8 H0(IGHV3_23)L1构建体(标记为H0(‘CDRH1)L1)显示的的效力与亲本人源化10G8 H0L1(标记为H0L1)mAb非常相似。非结合CDRL2向\n人序列的任何回复都显示中和活性降低，如从H0L1(IGKV4_1)(标记为H0L1(huCDRL2))和H0(IGHV3_23)L1(IGK4_1)(标记为H0(huCDRH1)L1(huCDRL2))抗体的数据所见的(图20，表13)。\n[0541] 表13：KB细胞中和测定–将人源化 10G8 H0L1 CDRH1和 CDRL2变体针对人和猕猴 OSM的活性排序的三次重复的 KB细胞中和测定的概述。\n[0542] \n[0543] 从这些数据选择人源化10G8 H0(huCDRH1)L1作为最重要准候选mAb用于完全表征。\n[0544] 2.5 人源化10G8抗体生物测定：人源化10G8 H0(IGHV3_23)L1 mAb\n[0545] 2.5.1 二次筛选\n[0546] BIACore分析：\n[0547] 对纯化的H0(IGHV3_23)L1 mAb进行BIACore分析且针对10G8嵌合体和人源化\n10G8 H0L1亲本mAb进行排序。H0(IGHV3_23)L1 mAb和亲本H0L1 mAb针对人和猕猴OSM的亲和力之间的差异很小或无差异(表6)。H0(IGHV3_23)L1 mAb对人OSM的亲和力是可替\n代非竞争性抗OSM人源化抗体15E10h的6.5倍(0.8 log)。本研究中使用新批次的OSM，\n然而产生较低KD值，人源化变体与非竞争性抗体之间的差异保持相同。\n[0548] 表14：BIACore动力学 – 纯化的H0(IGHV3_23)L1 mAb 与10G8嵌合体相比和与人源化10G8 H0L1亲本mAb相比和与可替代的非竞争性抗OSM 人源化抗体15E10h相比的\n猕猴和人OSM结合动力学。\n[0549] \n[0550] Kinexa分析\n[0551] 使用Kinexa (Sapidyne Instruments 3200)溶液相亲和力来测定抗OSM抗体\nH0(huCDRH1)L1和人源化15E10(无关OSM抗体)对人、猕猴、恒河猴和狨猿OSM的总亲和力(表15)。添加人源化15E10用于比较目的。\n[0552] 通过吸附(聚甲基丙烯酸甲酯珠粒- PMMA)或胺偶联(NHS-活化的琼脂糖珠粒)\n而制备OSM珠粒。研究的所述一系列OSM分子需要产生以不同浓度的OSM包被的珠粒。对于测定的溶液相部分，固定浓度的抗体与范围广泛的OSM浓度孵育，在分析进行前通过在室温孵育至少2小时而使其达到平衡。然后借助游离抗体结合于OSM珠粒基质，然后使用荧光染料标记的适当的二级抗体(根据待测试的构建体，或抗人或抗小鼠)而使用OSM珠粒确定溶液相样品中存在的游离抗体的量。用机器固有的Kinexa Pro分析软件拟合结合曲线。然后编辑使用不同起始浓度抗体的多次运行并使用n-曲线软件分析以更准确地测定亲和力。\n[0553] 如先前通过Biacore分析评价的，H0(huCDRH1)L1对人OSM显示较高亲和力。与其中抗体结合于芯片表面的Biacore不同，Kinexa使用流体相中的游离抗体和配体来评价亲和力，这更接近天然状态。\n[0554] 表15：Kinexa动力学 - 纯化的抗OSM备用抗体H0(huCDRH1)L1和人源化15E10的人、猕猴、恒河猴和狨猴 OSM结合动力学。\n[0555] \n[0556] ** 对狨猴OSM的亲和力非常弱，这意味着对于受体驱动的实验，对于使用uM量的OSM需要多于40nM抗体。\n[0557] 总体结论是人源化15E10与狨猿OSM的结合显著弱于人源化15E10与人OSM的结\n合。\n[0558] 人gp130 ELISA：\n[0559] 人gp130 ELISA使用过量OSM(25ng/ml)，因此降低其区分高亲和力抗体与较低亲和力抗体的能力。在3次重复gp130测定后，确认该测定中10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(huCDRH1)L1都有效阻断人和猕猴OSM与gp130受体的结合(图21)。由于该测定中抗原水平较高，因此无法辨别清楚的排序。\n[0560] 在25%人AB血清和25%人合并滑液存在的情况下重复人gp130测定。对各基质\n三次重复该测定显示，所有抗体(10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(huCDRH1)L1连同15E10h)都保持其阻断人和猕猴OSM与gp130结合的\n能力(数据未显示)。\n[0561] KB细胞中和测定：\n[0562] 由于使用较低(1 ng/ml)水平的OSM，因此与gp130测定相比，KB细胞中和测定是用于区分高亲和力中和剂和低亲和力中和剂的辨别力更强的测定。从三次重复测定，(H0(huCDRH1)L1针对人OSM的平均IC50值为30 ng/ml，针对猕猴OSM的平均IC50 值为\n41 ng/ml且针对狨猿OSM的平均IC50值为36 ng/ml(图22；表17)。\n[0563] 表17：KB细胞中和测定–将 H0(huCDRH1)L1针对人、猕猴和狨猴 OSM的活性排序的三次重复的 KB细胞中和测定的概述。添加 15E10h用于比较目的。\n[0564] \n[0565] 在25%人AB血清或25%合并人滑液存在的情况下，(H0(huCDRH1)L1和15E10h都\n保留其中和人和猕猴OSM的能力(图23)。在25% AB血清或25%合并滑液存在的情况下\n发现活性有一定程度的降低。这最可能是由于这些基质干扰该测定读出值。与正常测定相比，该测定中观察到更高的IL-6背景水平。\n[0566] 与15E10h不同，KB细胞中和测定中已经显示H0(huCDRH1)L1中和狨猿OSM。三种其他抗人OSM抗体10D3DLE、OM4.11.17和OM4.11.31的组也不能中和狨猿OSM。\n[0567] 内源人OSM gp130测定：\n[0568] 10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和\nH0(huCDRH1)L1以及15E10h都抑制来自四个独立供体的内源人OSM(图24)。从这四个供\n体的结果，H0L1亲本抗体与H0(huCDRH1)L1 mAb之间存在非常小的差异；这些抗体排序高于10G8小鼠亲本抗体和其嵌合体(表18)。H0(huCDRH1)L1的效力是15E10h的约12倍\n(1.09 log)。从GM-CSF刺激健康人中性粒细胞生成天然OSM。\n[0569] 表18：内源 OSM人 gp130测定 - 评价10G8小鼠亲本抗体、10G8 Ch、人源化10G8 H0L1亲本抗体 (H0L1)和 H0(huCDRH1)L1针对内源人 OSM的活性的 gp130 ELISA中四个中性粒细胞供体的概述。添加15E10h用于比较目的。无关抗体用作阴性对照。\n[0570] \n[0571] 人LIF反应性 (KB细胞中和测定 )：\n[0572] 人LIF是IL-6家族中与人OSM最密切相关的成员。三次重复人LIF KB细胞测定\n显示，10G8小鼠亲本抗体、10G8嵌合体、人源化10G8 H0L1亲本抗体(H0L1)和H0(huCDRH1)L1或15E10h无法中和人LIF。添加15E10h用于比较目的。该测定中，市售抗人LIF抗体\n的确中和LIF(图25)。这证明这些抗体是OSM特异性的。\n[0573] 原代人肝细胞测定：\n[0574] 人原代肝细胞对OSM敏感且响应于OSM刺激释放急性期蛋白，诸如SAA和CRP。\nH0(huCDRH1)L1以剂量依赖性方式抑制来自三个独立供体的肝细胞中人OSM诱导的SAA(图\n26)和CRP(图27)释放。添加人源化15E10用于比较目的。\n[0575] 使用其他原代人细胞类型进行等效测定。这些细胞包括人脐静脉内皮细胞；来自类风湿性关节炎患者的人成纤维细胞样滑膜细胞；来自健康人和特发性肺纤维化患者的人肺成纤维细胞(数据未显示)。如同先前测定，H0(huCDRH1)L1显示出优于人源化15E10的对OSM的中和作用。H0(huCDRH1)L1与人源化15E10之间的效力差异倍数根据细胞系和OSM浓度而变化。\n[0576] 2.6 生物物理学表征\n[0577] 进行H0(huCDRH1)L1连同人源化10G8 H0L1亲本mAb的基础生物物理学概况研究。\n抗体经受环境压力，诸如：\n[0578] - 温度，通过在4℃或37℃下孵育14天；\n[0579] - 五次冻融循环；\n[0580] - 强制脱酰胺，通过与1%碳酸氢铵在37℃下孵育48小时。\n[0581] 两种抗体在经受上述压力后均未显示生物物理学变化损失或活性损失。\n[0582] 2.6 CDRH3变体人源化抗体\n[0583] 2. 6.1 CDRH3变体人源化抗体的构建\n[0584] 在作为基础分子的pTT质粒(National Research Council Canada，具有修饰的多克隆位点(MCS))上使用重链H0 (IGHV3_23)全长序列SEQ ID NO. 75 (可变序列：SEQ ID NO：74)将CDRH3(SEQ ID NO：3)的各残基取代为可替代氨基酸残基。使用定点诱变技术(SDM)，由此设计在氨基酸取代位置处具有序列NNK (N = A/T/G/C；K = G或T)的寡核苷酸。使用聚合酶链式反应(PCR)生成含有变化的新质粒，且使用DNA测序来鉴定具有氨基酸变化的克隆。以这种方式，分离在12个CDRH3位置的每一处具有10至17个不同氨基酸的变体。通过将包含H0 (IGHV3_23)变体的pTT载体与L1轻链(SEQ ID NO：72)共转染来产生CDRH3变体抗体且测试上清液的结合。\n[0585] 生成164种CDRH3变体且在随后分析中进行测试(参见2.6.2和2.6.3)。\n[0586] 2.6.2 在HEK 293 6E细胞中表达CDRH3变体\n[0587] 将编码重链(H0 (IGHV3_23)) CDRH3变体的pTT质粒和轻链L1瞬时共转染到HEK \n293 6E细胞中且小规模表达以产生抗体。直接从组织培养上清液评价抗体。\n[0588] 2.6.3 CDRH3-变体组织培养物上清液的动力学分析\n[0589] 在ProteOn XPR36 (Biorad Laboratories)上进行对CDRH3筛选的初始动力学分析，且选择某些上清液在BiaCore T100上进行更精确的动力学分析。\n[0590] 对于ProteOn分 析，通 过伯胺 偶联 使抗人 IgG(GE Healthcare/Biacore \nBR-1008-39)与GLM芯片(Biorad Laboratories 176-5012)偶联。将CDRH3变体直接捕\n获至该表面上且使重组人OSM在256、64、16、4和1 nM下穿过捕获抗体表面，使用单独缓冲液注射(即0 nM)作为结合曲线的双重参考。在OSM结合事件后，用3M MgCl2再生捕获表面，再生作用去除先前捕获的抗体以准备用于另一个捕获循环和结合分析。然后将数据拟合到ProteOn分析软件固有的1 : 1模型(用传质(mass transport)模型)。用HBS-EP \n(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)进行运行，且分析温度为25℃。\n[0591] 使用相似方法用于以Biacore T100分析构建体，通过伯胺偶联将抗人IgG(GE Healthcare/Biacore BR-1008-39)与CM5芯片(GE Healthcare/Biacore BR-1006-68)偶联，将抗体捕获在该表面上且重组人OSM在256、64、16、4和1 nM下穿过捕获抗体表面，使用单独缓冲液注射(即0 nM)作为结合曲线的双重参考。通过使用3M 3M MgCl2或100mM\n磷酸的脉冲或使用两种试剂进行再生。将数据拟合至Biacore T100分析软件固有的1：1模型。使用HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)进行运行且分析温度为25℃。\n[0592] 对于结合数据结果，参见图33。\n[0593] 序列概述(表 A)\n[0594] \n[0595] \n[0596] \n[0597] 序列表\n[0598] \n[0599] \n[0600] \n[0601] SEQ ID NO:25 10G8 VH核苷酸序列\n[0602] \n[0603] SEQ ID NO:26 10G8 VH氨基酸序列\n[0604] \n[0605] SEQ ID NO:27 10G8 VL核苷酸序列\n[0606] \n[0607] SEQ ID NO:28 10G8 VL氨基酸序列\n[0608] \n[0609] SEQ ID NO:29 3E3 VH核苷酸序列\n[0610] \n[0611] SEQ ID NO:30 3E3 VH氨基酸序列\n[0612] \n[0613] SEQ ID NO:31 3E3 VL核苷酸序列\n[0614] \n[0615] SEQ ID NO:32 3E3 VL氨基酸序列\n[0616] \n[0617] SEQ ID NO:33 2B7 VH核苷酸序列\n[0618] \n[0619] SEQ ID NO:34 2B7 VH氨基酸序列\n[0620] \n[0621] SEQ ID NO:35 2B7 VL核苷酸序列\n[0622] \n[0623] SEQ ID NO:36 2B7 VL氨基酸序列\n[0624] \n[0625] SEQ ID NO:37 9G2 VH核苷酸序列\n[0626] \n[0627] SEQ ID NO:38 9G2 VH氨基酸序列\n[0628] \n[0629] SEQ ID NO:39 9G2 VL核苷酸序列\n[0630] \n[0631] SEQ ID NO:40 9G2 VL氨基酸序列\n[0632] \n[0633] SEQ ID NO:41 10G8 VH嵌合核苷酸序列\n[0634] \n[0635] SEQ ID NO:42 10G8 VH嵌合氨基酸序列\n[0636] \n[0637] SEQ ID NO:43 10G8 VL嵌合核苷酸序列\n[0638] \n[0639] SEQ ID NO:44 10G8 VL嵌合氨基酸序列\n[0640] \n[0641] SEQ ID NO:45 9G2 VH嵌合核苷酸序列\n[0642] \n[0643] \n[0644] SEQ ID NO:46 9G2 VH嵌合氨基酸序列\n[0645] \n[0646] SEQ ID NO:47 9G2 VL嵌合核苷酸序列\n[0647] \n[0648] SEQ ID NO:48 9G2 VL嵌合氨基酸序列\n[0649] \n[0650] SEQ ID NO:49 IGHV3_7人VH种系受体核苷酸序列\n[0651] \n[0652] SEQ ID NO:50 IGHV3_7人VH种系受体氨基酸序列\n[0653] \n[0654] SEQ ID NO:51 IGKV4_1人VL种系受体核苷酸序列\n[0655] \n[0656] SEQ ID NO:52 IGKV4_1人VL种系受体氨基酸序列\n[0657] \n[0658] SEQ ID NO:53 10G8人源化VH H0核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0659] \n[0660] SEQ ID NO:54 10G8人源化VH H0氨基酸序列\n[0661] \n[0662] SEQ ID NO:55 10G8人源化VH H1核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0663] \n[0664] SEQ ID NO:56 10G8人源化VH H1氨基酸序列\n[0665] \n[0666] SEQ ID NO:57 10G8人源化VH H2核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0667] \n[0668] SEQ ID NO:58 10G8人源化VH H2氨基酸序列\n[0669] \n[0670] SEQ ID NO:59 10G8人源化VL L0核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0671] \n[0672] \n[0673] SEQ ID NO:60 10G8人源化VL L0氨基酸序列\n[0674] \n[0675] SEQ ID NO:61 10G8人源化VL L1核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0676] \n[0677] SEQ ID NO:62 10G8人源化VL L1氨基酸序列\n[0678] \n[0679] SEQ ID NO:63 10G8人源化VL L2核苷酸序列- leto密码子最优化的\n[0680] \n[0681] SEQ ID NO:64 10G8人源化VL L2氨基酸序列\n[0682] \n[0683] SEQ ID NO:65 10G8人源化VL L3核苷酸序列 - leto密码子最优化的\n[0684] \n[0685] \n[0686] SEQ ID NO:66 10G8人源化VL L3氨基酸序列\n[0687] \n[0688] SEQ ID NO:67 10G8人源化VL L4核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0689] \n[0690] SEQ ID NO:68 10G8人源化VL L4氨基酸序列\n[0691] \n[0692] SEQ ID NO:69 成熟H0重链核苷酸序列 -leto密码子最优化的\n[0693] \n[0694] \n[0695] SEQ ID NO:70 成熟H0重链氨基酸序列\n[0696] \n[0697] SEQ ID NO:71 成熟L1轻链核苷酸序列 - leto密码子最优化的\n[0698] \n[0699] SEQ ID NO:72 成熟L1轻链氨基酸序列\n[0700] \n[0701] SEQ ID NO:73 人源化VH变体H0 (IGHV3_23 CDRH1)核苷酸序列- leto密码子最优化的\n[0702] \n[0703] SEQ ID NO:74 人源化VH变体H0 (IGHV3_23 CDRH1)氨基酸序列\n[0704] \n[0705] SEQ ID NO:75 成熟H0 (IGHV3_23 CDRH1)重链核苷酸序列 - leto密码子最优化的\n[0706] \n[0707] SEQ ID NO:76 成熟H0 (IGHV3_23 CDRH1)重链氨基酸序列\n[0708] \n[0709] SEQ ID NO:77 人重链种系IGHV3_23 CDRH1\n[0710] \n[0711] SEQ ID NO:78 人轻链种系IGKV1_5 CDRL2\n[0712] \n[0713] SEQ ID NO:79 15E10人源化重链氨基酸序列:\n[0714] \n[0715] SEQ ID NO:80 15E10人源化轻链氨基酸序列:\n[0716] \n[0717] SEQ ID NO:81 15E10人源化VH B3\n[0718] \n[0719] SEQ ID NO:82 15E10人源化VL L2\n[0720] \n[0721] SEQ ID NO:83 人OSM多核苷酸序列\n[0722] \n[0723] SEQ ID NO:84 人OSM氨基酸序列\n[0724]