抗CD20嵌合抗体突变体基因及其应用

1、一种抗CD20抗体的轻链可变区突变基因，其具有SEQ ID NO：2的序列。
2、如权利要求1的基因编码的多肽，其具有SEQ ID NO：1的序列。
3、如权利要求2所述的多肽在制备用于肿瘤的诊断和治疗的药物中的应用。

技术领域：\n本发明涉及抗CD20单克隆抗体轻链突变的可变区基因，由所述基因编码的 多肽，及其含有所述的基因和多肽在制备用于肿瘤的诊断和治疗的药物中的应 用。具体地讲，本发明涉及的轻链可变区基因来源于抗CD20抗体HI47的一个突 变亚型。\n背景技术：\n恶性肿瘤是我国攻关的重点疾病之一。B淋巴细胞瘤是一种常见的血液系 统疾病，其发病率约为2/10000，按此估计，我国每年约有两万多病例。目前对 B淋巴细胞瘤的治疗方法主要有化疗，放疗和生物辅助治疗三种疗法，生物治 疗作为辅助疗法主要用于化疗替代、联合应用治疗、微量残留肿瘤细胞的杀伤 和早期潜在转移灶的治疗，提高病人的愈后质量。CD20是B淋巴细胞表面膜蛋 白，CD20与Ca2+离子在B淋巴细胞跨膜运输密切相关，CD20对B淋巴细胞的分 化和增殖起调节作用。CD20作为治疗B淋巴细胞瘤靶点有如下优点：\n1)CD20只在前-B淋巴细胞，未成熟B淋巴细胞，成熟B淋巴细胞，激活B淋 巴细胞表达，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞，浆细胞不表达。\n2)CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因 为抗体的结合而减少\n3)CD20比较暴露不为其它表面分子所掩盖，因而容易接近。\n4)在人体血清中无游离的CD20存在。\n抗CD20单克隆抗体的研究已有十多年的历史，早在80年代抗CD20抗体1F5、 B1已用于临床实验，但收效甚微，直至1997年才取得突破性的进展。是年美 国FDA批准抗CD20嵌合抗体Rituxan应用于B淋巴细胞瘤的临床治疗，疗效 显著，毒副作用小。不同的抗CD20抗体和CD20结合后引起的效应不同，有的 可使B淋巴细胞从G0期进入G1期，引起B淋巴细胞的活化；有的抑制B淋巴 细胞的活化。抗CD20抗体主要是通过抗体依赖性细胞毒作用(ADDC)、补体 依赖性细胞毒作用(CDDC)以及抗体和B淋巴细胞的凋亡等三种机制杀伤B 淋巴细胞瘤。\nHI47(IgG3)是我所于1990研制成功的抗CD20鼠源性单克隆抗体，第四届 国际人类白细胞分化抗原会议将HI47命名为CD20+X(上海免疫学杂 志：1990.Vol.10 No.2).HI47的组织反应性和IF5、B1略有不同。HI47能抑制SAC 诱导的B淋巴细胞DNA、RNA的合成，而对Anti-IgM和PMA引起B细胞 活化及细胞系的增殖无明显作用，HI47使SAC激活的B细胞HI抗原表达明显 减少，但对PMA激活细胞HI抗原表达没有明显影响。这些结果预示HI47的作 用位点与B1的作用位点不同(Eur J Immunol.：1986.Vol.16)。HI47的抑制活性是 抗体的特异性作用。\n人体对鼠源性抗体的免疫反应(HAMA反应)是鼠源性抗体应用于临床治 疗的主要障碍，且鼠源性抗体不能介导人的ADDC、CDC反应。抗体的人源化 和嵌合抗体的构建可大大降低鼠源性抗体的免疫原性。临床实验表明，抗CD20 抗体在B淋巴细胞瘤临床治疗过程中，HAMA反应发生率较低。\n作为治疗剂和诊断剂，CD20抗体的产量低，一方面不能满足大量病人的需 求；另一方面生产的成本相应较高，直接表现为昂贵的价格，使病人难以接受。 抗体的亲和低，减弱了抗体杀伤肿瘤的作用强度，增加了抗体的使用剂量。抗 体与靶点的亲和力和抗体表达产量决定了其临床应用的可能性。为了增强抗体 与靶抗原的亲和力或(和)提高抗体的表达量，以原来工作为基础，在抗CD20抗 体的可变区中引入突变，最终获得高产高活性的突变体是降低生产成本满足临 床需要的重要手段。\n发明内容\n本发明的一个目的在于提供一突变的抗CD20单克隆抗体的轻链可变区基因 和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗CD20片段，能增加 抗体与抗原的亲和力以及抗体的活性，同时相应地提高抗体表达产量。本发明 的另一个目的在于抗CD20片段在制备用于肿瘤的诊断和治疗的药物中的应用.\n本发明涉及一突变的抗CD20单克隆抗体轻链可变区基因，所述的轻链可变 区基因的全长为330bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸 序列如SEQ ID NO：1所示。本发明采用定点突变PCR技术，在抗CD20抗体的 轻链可变区基因中引入了突变，并将其与原重链基因重新克隆到表达载体 pAYZcd20中。\n本发明的有益效果是：本发明涉及的突变体的表达产物为分泌性表达，纯 化后的产物具有与表达CD20抗原的Raji细胞的结合活性，与未突变的克隆相比， 其表达产量提高的同时，其活性也相应的提高。该突变的引入使抗体的产量和 活性都增加，如果该产品应用于临床治疗或诊断，可减轻肿瘤患者的经济负担， 打破价格昂贵的同类产品Rituxan在中国的垄断，因此，本发明在医学领域是 一个很大的贡献。\n附图说明\n附图1SDS-PAGE还原电泳分析图。\n图中，1.突变体粗提物，2.原抗体粗提物，3.Protein-G纯化的突变体， 4.Protein-G纯化的原抗体。\n附图2免疫荧光竞争实验的测定结果图。\n图中，1.空白对照(PBS)，2.阳性对照(HI47)，3.阴性对照(anti-CD3) 4.抗CD20单克隆抗体Fab+HI47，5.抗CD20单克隆抗体突变体Fab+HI47。\n具体实施方式\n以下列举部分实施例仅对本发明进行具体说明，但不限制本发明。\n实施例1、抗CD20抗体轻链的基因的定点突变\n以抗CD20Fab表达载体pAYZcd20(本发明人所在实验室保存)为模板， 用下列引物①②和引物③④扩增抗CD20轻链前后部分基因，再用Overlap法将 两次PCR片段扩增出完整的抗CD20轻链基因片段，获得一个突变的基因。\n实施例2、抗CD20Fab抗体表达载体的构建\n用下列引物⑤⑥扩增抗CD20的重链基因片段。将PCR扩增的抗CD20的抗 体轻重链的基因分别用MluI、NheI和NheI、ApaI酶切，pAYZ表达载体用MluI、 ApaI酶切。连接并转化大肠杆菌16C9，挑取单菌落鉴定。\n引物：\n①5′-GCTACAAACGCGTACGCTGACATCGAGCTC-3’\n②5’-ACTTGAGTTGGCCCTGCAAGT-3’\n③5’-ACTTGCAGGGCCAACTCAAGA-3’\n④5’-AACTTGCGTGCTAGCGCCAC-3’\n⑤5′-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTGAAGCTG-3′\n⑥5′-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT-3′\n实施例3、抗CD20Fab片段的表达和纯化\n3.1抗CD20抗体片段的表达和纯化\na、挑取正确的单菌落，接于5ml 2×YT培养基(含50ug/ml氨苄青霉素)，37℃， 200r/min振荡培养至A600＝0.7；离心收集菌体，将菌体重悬浮于20ml AP5培 养基(含50ug/ml氨苄青霉素)，30℃，振荡培养24小时；离心收集菌体， 将菌体于-20℃冷冻1小时，化冻后，加1ml周间质提取液将菌体打散，4℃ 轻摇1小时，22000g，4℃离心20分钟，收集上清。\nb、收集的上清经Protein G亲和柱分离纯化。\nc、12％SDS-PAGE还原电泳分析：表达产物分子量约为25KD(见附图1)。 从图中可见，在所有条件相同的情况下，抗CD20嵌合抗体Fab突变体的表达高 于原抗CD20嵌合抗体Fab片段，经蛋白测定证实突变的表达量可提高2倍。\n实施例4、抗CD20抗体活性测定\n免疫荧光竞争实验：将浓度为4ug/ul的HI47溶液与1×106Raji细胞在4℃下 孵育1小时，2000g，4℃离心10min，弃上清液，PBS洗三次，将细胞重悬于 20ug，30ul的抗CD20Fab′片段溶液，4℃放置1小时，2000g，4℃离心10min， 弃上清液，PBS洗三次，将细胞重悬于30ul的工作液羊抗鼠IgG-FITC溶液，4℃ 放置30min，2000g离心10min，弃上清液，PBS洗三次，FACS测定HI47结合 Raji细胞的阳性率(见附图2)。检测结果表明，在突变和未突变的抗CD20抗体 Fab存在的条件下，HI47的结合率分别为37.55％和70.26％。\n序列表\n<110>中国医学科学院血液学研究所\n<120>抗CD20抗体轻链突变基因及由其重组的抗CD20抗体\n<160>2\n<210>1\n<211>108\n<212>PRT\n<213>小鼠(musculus)\n<220>\n<400>1\nAsp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro\n1                5                   10                 15\nGly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn Ser Ser Val Ser\n                 20                  25                 30\nTyr Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro\n                 35                  40                 45\nTrp Ile Tyr Ala Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg\n                 50                  55                  60\nPhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser\n                 65                  70                  75\nArg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp\n                 80                  85                  90\nThr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu\n                 95                  100                105\nLys Arg Ala\n                 110\n<210>2\n<211>330\n<212>DNA\n<213>小鼠(musculus)\n<220>\n<400>2\ngacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60\natgacttgca gggcca actc aagtgtaagt tacatgctct ggtaccagca gaagccagga 120\ntcctccccca aaccctggat ttatgccaca tcccacctgg cttctggagt ccctactcgc 180\nttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240\ngatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggtgctggg 300\naccaagctgg agctgaaacg ggcggccgca                                  360