梅花鹿鹿脾提取物在抗疲劳药物中的应用

1.一种梅花鹿鹿脾提取物，是通过以下方法制备的：
1）称取梅花鹿鹿脾，去除表面结缔组织，切成0.5cm厚的薄片；
2）加入1~3倍重量的生理盐水，研磨2~5min；
3）将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至60~70℃，调pH值至6.0，加入2.5~7.3%重量的复合酶后在水浴锅中保温1~2h；
4）继续加入1%~3% 重量的5’-磷酸二酯酶保温2~3h；
5）将混悬液用4000g离心10min，取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末；
所述的复合酶为木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和中性蛋白酶，其中上述木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为：2~4：1~2：1~2；
所述的酶为5’-磷酸二酯酶为在60~70℃具有较高活性的酶为5’-磷酸二酯酶；
所述梅花鹿鹿脾提取物中多肽含量为30~45%，游离核苷酸含量为1~2%，肌苷含量为
0.01~0.2%。
2.权利要求1所述的梅花鹿鹿脾提取物在制备抗疲劳药物中的用途。

梅花鹿鹿脾提取物在抗疲劳药物中的应用\n[0001] 技术领域：\n[0002] 本发明涉及梅花鹿鹿脾提取物在抗疲劳药物中的应用，利用梅花鹿鹿脾提取物制备药物或保健品，属于中医制药技术领域。\n[0003] 技术背景：\n[0004] 随着社会压力的增大和生活节奏的加快，全球有35%以上的人处于疲状态劳，过疲劳会使机体内分泌紊乱、免疫力下降，严重影响人们的生活质量。近年来，不少学者在抗疲劳方面做了大量工作，具有抗疲劳作用的主要有中药、化药等，中药主要有西洋参、红景天等，化药主要有咖啡因、苯丙胺等中枢兴奋药，长期服用化药存在一定的副作用。\n[0005] 鹿脾口感不佳，不为人们食用，研究甚少。梅花鹿全身是宝，具有极高的药用价值，其全身均为本草纲目上有记载的名贵中药即食疗补品。虽然没有鹿脾具有抗疲劳的研究，但通过常压耐缺氧、亚硝酸钠中毒缺氧等实验发现：梅花鹿鹿脾提取物中含有大量多肽、多糖、核苷酸等成分，具有抗疲劳活性。\n[0006] 发明内容：\n[0007] 本发明公开了梅花鹿鹿脾提取物在抗疲劳药物中的应用，用于制备抗疲劳药物或保健食品。\n[0008] 本发明所述的鹿脾提取物是通过以下方法制备的：\n[0009] 1）称取梅花鹿鹿脾，去除表面结缔组织, 切成0.5cm 厚的薄片；\n[0010] 2）加入1~3倍重量的生理盐水，研磨2~5min；\n[0011] 3）将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至60~70℃，调ph值至6.0，加入2.5~7.3%重量的复合酶后在水浴锅中保温1~2h；\n[0012] 4）继续加入1%~3% 重量的5’-磷酸二酯酶保温2~3h；\n[0013] 5）将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末；\n[0014] 所述的复合酶为木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：中性蛋白酶的质量比为：2~4：1~2：1~2；\n[0015] 所述的酶为5’-磷酸二酯酶，其在60~70℃具有较高的活性；\n[0016] 所述鹿脾提取物中多肽含量为30~45%，游离核苷酸含量为1~2%，肌苷含量为0.01~\n0.2%。\n[0017] 本发明所述的梅花鹿鹿脾提取物在抗疲劳药物中的用途。\n[0018] 本发明所述的鹿脾提取物可用于制备抗疲劳作用的药物和保健食品，在剂型方面可采用各种剂型，如口服液、片剂、颗粒剂、散剂、或丸剂、胶囊等或缓释剂型；口服单位剂量包含20~100mg该提取物。\n[0019] 本发明的积极效果在于：\n[0020] 通过动物实验表明，本发明工艺制备的鹿脾提取物能提高小鼠的常压耐缺氧能力，提高小鼠耐亚硝酸钠毒性的能力，延长小鼠的游泳时间，降低小鼠剧烈运动后的血清尿素氮含量，减轻小鼠运动后的生理负荷，能够增加小鼠的肝糖原储备量，具有显著的抗疲劳效果，可用于制备抗疲劳作用的药物和保健食品。\n具体实施方式\n[0021] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。\n[0022] 实施例1\n[0023] . 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织, 切成0.5cm 厚的薄片；\n[0024] . 加入600ml生理盐水，研磨5min；\n[0025] . 将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至65℃，调ph值至6.0，加入5.1g木瓜蛋白酶，\n2.3g菠萝蛋白酶和2.4g中性蛋白酶在水浴锅中保温2h；\n[0026] . 继续加入3.5g 5’-磷酸二酯酶保温2h；\n[0027] . 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末。\n[0028] 实施例2\n[0029] . 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织, 切成0.5cm 厚的薄片；\n[0030] . 加入750ml生理盐水，研磨5min；\n[0031] . 将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至67℃，调ph值至6.0，加入7.5g木瓜蛋白酶，\n1.9g菠萝蛋白酶和1.7g中性蛋白酶在水浴锅中保温2h；\n[0032] . 继续加入3.7g 5’-磷酸二酯酶保温2h；\n[0033] . 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末。\n[0034] 实施例3\n[0035] . 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织, 切成0.5cm 厚的薄片；\n[0036] . 加入550ml生理盐水，研磨5min；\n[0037] . 将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至65℃，调ph值至6.0，加入7.3g木瓜蛋白酶，\n1.8g菠萝蛋白酶和1.8g中性蛋白酶在水浴锅中保温1h；\n[0038] . 继续加入3.5g 5’-磷酸二酯酶保温2h；\n[0039] . 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末。\n[0040] 实施例4\n[0041] . 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织, 切成0.5cm 厚的薄片；\n[0042] . 加入650ml生理盐水，研磨5min；\n[0043] . 将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至70℃，调ph值至6.0，加入7.2g木瓜蛋白酶，\n2.0g菠萝蛋白酶和2.0g中性蛋白酶在水浴锅中保温1h；\n[0044] . 继续加入3.5g 5’-磷酸二酯酶保温2h；\n[0045] . 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末。\n[0046] 实施例5\n[0047] . 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织, 切成0.5cm 厚的薄片；\n[0048] . 加入550ml生理盐水，研磨2min；\n[0049] . 将鹿脾混悬液放在水浴锅中升温至60℃，调ph值至6.0，加入7.0g木瓜蛋白酶，\n2.5g菠萝蛋白酶和2.5g中性蛋白酶在水浴锅中保温1h；\n[0050] . 继续加入4.8g 5’-磷酸二酯酶保温3h；\n[0051] . 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗疲劳作用的鹿脾提取物粉末。\n[0052] 以下试验表明本发明的鹿脾提取物具有抗疲劳的作用：\n[0053] 将鹿脾提取物进行下面中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所对小鼠进行抗疲劳作用实验。\n[0054] 1.1试剂与材料\n[0055] 1.1.1试剂\n[0056] 肝糖原、血清尿素氮测定试剂盒（购于南京建成生物工程研究所），钠石灰（分析纯），亚硝酸钠（分析纯）、凡士林。\n[0057] 1.1.2材料与仪器\n[0058] 250mL磨口瓶、秒表，低氧分压呼吸效应实验系统、血细胞分析仪、可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器。\n[0059] 1.1.3动物处理\n[0060] 雄性小鼠体重18－22g，将小鼠分为A、B、C、D四大组，每大组50只小鼠分为五小组，每组10只，即空白对照组（生理盐水），实施例1、实施例2和实施例3给药剂量组以及阳性药对照组（红景天片，国药准字B20050013 ），实施例给药组给予鹿脾提取物剂量100mg/kg.w。\n对照组给予蒸馏水，每周称重两次，按体重调整每只小鼠的受试样品的量，连续给药30天。\n[0061] 1.2实验\n[0062] 1.2.1常压耐缺氧实验\n[0063] 每组10只小鼠，各组于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的\n250mL磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡的时间。\n[0064] 1.2.2缺氧存活实验\n[0065] 每组10只小鼠，各组于末次灌胃后1小时各组按80mg/kg BW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g BW），立即计时，记录动物存活时间。\n[0066] 1.2.3鹿脾提取物对小鼠游泳耐力的影响\n[0067] 小鼠末次灌胃后0.5h，在水深30cm，水温25℃±0.5℃的游泳箱进行负重5%的游泳实验，以小鼠头部全部入水持续8s不能浮出水面为判定终点，记录游泳衰竭时间。\n[0068] 1.2.4氮素含量测定\n[0069] 小鼠末次灌胃0.5h后，在水深30cm，水温25℃±0.5℃的游泳箱游泳90min后取血，利用尿素氮试剂盒测定氮素含量。\n[0070] 1.2.5肝糖原含量测定\n[0071] 小鼠末次灌胃0.5h后，在水深30cm，水温25℃±0.5℃的游泳箱游泳90min后立即处死，取肝，测定肝糖原含量。\n[0072] 1.3结果\n[0073] 1.3.1常压耐缺氧实验结果\n[0074] 常压耐缺氧实验是以测定小鼠缺氧存活时间为指标的实验方法。从表1可以看出，实施例1耐缺氧时间为46.21min，实施例2耐缺氧时间为45.33min，实施例3耐缺氧时间为\n46.11min，显著高于空白对照组的24.54min（P＜0.001）。表明本发明鹿脾提取物能提高小鼠的常压耐缺氧能力，增强小鼠体质。\n[0075] 表1 鹿脾提取物对小鼠常压耐缺氧时间的影响（x±s，n=10）\n[0076]\n组别 存活时间（min）\n空白对照组 24.54±6.43\n实施例1 46.21±5.37***\n实施例2 45.33±6.43***\n实施例3 46.11±9.26***\n阳性对照组 43.25±6.13***\n[0077] 1.3.2缺氧存活实验\n[0078] 从表2可以看出，空白对照组小鼠注射亚硝酸钠后存活时间为10.89min，而实施例\n1、2、3鹿脾提取物灌胃的小鼠存活时间分别为16.02min、16.54min、16.14min，明显高于空白对照组（P＜0.01），本发明鹿脾提取物能够可显著提高小鼠耐亚硝酸钠毒性的能力，增强其体质。\n[0079] 表2 鹿脾提取物对小鼠亚硝酸钠中毒性存活时间的影响（x±s，n=10）[0080]\n组别 存活时间（min）\n空白对照组 10.89±2.31\n实施例1 16.02±3.12**\n实施例2 16.54±3.27**\n实施例3 16.14±5.12**\n阳性对照组 17.24±3.11**\n[0081] 1.3.3鹿脾提取物对小鼠游泳耐力的影响结果\n[0082] 运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。鹿脾提取物对小鼠负重游泳时间的实验结果见表3。从表3可以看实施例\n1、2、3鹿脾提取物组与空白对照组相比，小鼠的游泳时间明显延长。本发明鹿脾提取物可以明显延长小鼠的游泳时间，即增强小鼠的抗疲劳性。\n[0083] 表3 鹿脾提取物对小鼠负重游泳的影响（x±s，n=10）\n[0084]\n组别 存活时间（s）\n空白对照组 376.80±58.08\n实施例1 687.49±65.61**\n实施例2 653.31±76.89**\n实施例3 689.38±52.34**\n阳性对照组 669.23±63.12**