用复合酶酶解牡蛎制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法

1、一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方 法，其特征是将牡蛎肉加入2～4倍肉重的Tris-HCl缓冲液打浆，按照 550～650U/g肉的比例加入碱性蛋白酶，在45～55℃下恒温搅拌，酶解1～2 小时，然后灭酶，冷却；用盐酸调pH至5-6，按照650-750U/g肉的比 例加入菠萝蛋白酶，搅拌，45-55℃下恒温酶解1-2小时，灭酶，冷却， 离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G-25柱层析分离纯化后， 冻干。

技术领域\n本发明涉及一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制 活性的肽的方法。\n背景技术\n蛋白酶抑制剂是一类具有肿瘤抑制活性的物质，目前牛肺胰蛋白酶 抑制剂和人尿胰蛋白酶抑制剂已经被开发成肿瘤的辅助药物，广泛应用 于临床。国外已有人以太平洋褶柔鱼、鲣鱼、河豚鱼、对虾、白姑鱼、 长蛇鲻鱼等水产品为原料，分别从其肝脏、卵、表皮粘液和肌肉中分离 到了蛋白酶抑制剂，所得产品主要应用于疾病的预防和治疗。但是，迄 今尚未见从蛋白水解物中提取蛋白酶抑制剂的报道。目前存在的问题主 要是天然胰蛋白酶抑制剂的含量非常有限，而且提取比较困难。\n发明内容\n本发明的目的是提供一种用复合酶定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶 抑制活性的肽的方法，它能弥补现有技术的上述不足。\n一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的 方法，其特征是将牡蛎肉加入2～4倍肉重的Tris-HCl缓冲液打浆，按照 550～650U/g肉的比例加入风味碱性蛋白酶，恒温搅拌，在45～55℃下酶 解1～2小时，然后灭酶，冷却；用盐酸调pH至5-6，按照650-750U/g 肉的比例加入菠萝蛋白酶，搅拌，45-55℃下恒温酶解1-2小时，灭酶， 冷却，离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G-25柱层析分离纯 化后，冻干。\n本发明以低值的牡蛎为原料，利用风味碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶复 合酶解制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽，所得产物活性高，对商品胰蛋 白酶活性的抑制率可达67％。\n具体实施方式：\n将牡蛎肉加入2～4倍，最好是3倍肉重的Tris-HCl缓冲液(0.05M、pH8.5) 中打浆，体系最初pH为8～9，最好是8.5。按照550～650U/g肉，最好是600U/g 肉的比例加入风味碱性蛋白酶(Alcalase)，在45～55℃，最好是50℃下恒 温搅拌，酶解1～2小时，最好是1小时，然后100℃灭酶，冷却至40-50℃， 最好45℃；用盐酸调pH至5-6，最好是5.5，按照650-750U/g肉，最好是700 U/g肉的比例加入菠萝蛋白酶，搅拌，在45-55℃，最好是50℃下恒温酶解 1-3小时，最好是2小时，然后100℃灭酶，冷却至常温，4000r/min以上的 转速下离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G-25柱层析分离纯化 后，冻干即得到具有胰蛋白酶抑制活性的肽(分子量≤10k)。