一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统及方法

1.一种荧光自抑制探针的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统包括荧光自抑制探针、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲液、反应原料与miRNA目标分子；其中，所述荧光自抑制探针与miRNA目标分子杂交结合，所述荧光自抑制探针包括荧光自抑制线性探针与荧光自抑制发夹探针。
2.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制线性探针的结构中包括淬灭碱基、淬灭基团与荧光基因，其中淬灭碱基与淬灭基团实现双重淬灭的功能。
3.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制发夹探针的结构中包括淬灭基团与荧光基因，其中荧光基团和淬灭基团的碱基互补配对，所述荧光自抑制发夹探针的序列3’端含有所述miRNA目标分子对应的结合区域和特异性酶切识别序列。
4.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制线性探针采用如SEQ ID NO.1所示的序列，
SEQ ID NO.1:5’‑CCCGTGGAGTCTGTG‑(Quencher)‑I‑(Fluorophore)‑NNNNNNNNNN‑3’，所述荧光自抑制线性探针的碱基序列包括适用于不同miRNA目标分子的通用碱基序列，以及与特定miRNA目标分子结合的特异性互补碱基序列；所述荧光自抑制线性探针的通用碱基序列为CCCGTGGAGTCTGTG和I，所述荧光自抑制线性探针的特异性互补碱基序列为N碱基重复序列；所述荧光自抑制线性探针还包括荧光基团、淬灭碱基和淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制线性探针中，所述荧光基团(Fluorophore)为6‑羧基荧光素(FAM)、六氯‑6‑甲基荧光素(HEX)、ROX(ROX)、6‑羧基四甲基若丹明(TAMRA)、5H‑吲哚菁(Cy5)中的一种或多种，优选为6‑羧基荧光素(FAM)；
所述淬灭基团(Quencher)为黑洞猝灭基团1(BHQ1)、黑洞猝灭基团2(BHQ2)、和4‑(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)中的一种或多种，优选为黑洞猝灭基团1(BHQ1)；所述淬灭碱基(I)为A、G、C、T中的一种或多种，优选为G。
6.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制发夹探针采用如SEQ ID NO.2所示的序列，
SEQ ID NO.2：5’‑(Quencher)‑ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA‑(Fluorophore)‑AAAGAGTCTGTGNNNNNNNNNN‑3’，
所述荧光自抑制发夹探针的碱基序列包括适用于不同目标产物的通用碱基序列，以及与不同目标产物结合的特异性互补碱基序列，其中，所述荧光自抑制发夹探针的特异性互补碱基序列为N碱基重复序列，所述荧光自抑制发夹探针的通用碱基序列为ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA与AAAGAGTCTGTG；所述荧光自抑制发夹探针还包括荧光基团和淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制发夹探针中，所述荧光基团(Fluorophore)为6‑羧基荧光素(FAM)、六氯‑6‑甲基荧光素(HEX)、ROX(ROX)、6‑羧基四甲基若丹明(TAMRA)、5H‑吲哚菁(Cy5)中的一种或多种，优选为6‑羧基荧光素(FAM)；
所述淬灭基团(Quencher)为黑洞猝灭基团1(BHQ1)、黑洞猝灭基团2(BHQ2)、和4‑(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)中的一种或多种，优选为黑洞猝灭基团1(BHQ1)。
8.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统中的缓冲液包括Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、NaCl、MgCl2与DTT。
9.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统中，所述DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶的一种或多种，优选为Vent DNA聚合酶。
10.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统中，所述切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.BtsI切刻内切酶的一种或多种，优选为Nt.BstNBI切刻内切酶。
11.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统包括10‑
100mM Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、10‑100mM NaCl、10‑50mM MgCl2、0.2‑2.0mM DTT、0.05‑
0.5U/μL Vent DNA聚合酶、0.05‑0.5U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶、0.025‑0.5mM dNTPs、
0.025‑0.5μM荧光自抑制线性探针与0.025‑0.5μM荧光自抑制发夹探针，优选为50mM Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT、0.1U/μL Vent DNA聚合酶、0.2U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶、0.125mM dNTPs、0.125μM荧光自抑制线性探针与0.125μM荧光自抑制发夹探针。
12.使用权利要求1‑11中任一项所述等温扩增系统的等温扩增方法，其特征在于，所述等温扩增方法的实现过程包括等温扩增循环I与等温扩增循环II；
等温扩增循环I中，荧光自抑制线性探针以miRNA为靶标，进行杂交结合，在Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下，生成与miRNA目标序列反向互补的DNA单链A，并释放荧光信号；
等温扩增循环II中，荧光自抑制发夹探针与生成的DNA单链A进行杂交结合，在Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下，生成与miRNA目标序列相同的DNA单链B，并释放荧光信号；
循环I和循环II反应既相互独立，又相互作用；循环I产生的单链A，会触发循环II反应的开始，进而产生大量的单链B，并释放大量的荧光信号，而产物单链B又会反过来触发循环I反应持续进行，进而实现目标产物和荧光信号的级联放大。
13.根据权利要求12所述的等温扩增方法，其特征在于，所述等温扩增反应的温度为
37‑65℃，优选为55℃。
14.使用权利要求1‑11任一项所述用于miRNA检测的等温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括等温扩增反应试剂，所述等温扩增反应试剂包括Vent DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻内切酶、缓冲液、dNTPs和内参基因标准品。
15.根据权利要求14所述的等温扩增试剂盒，其特征在于，所述等温扩增试剂盒的内参基因标准品为cel‑miR‑39、U6或hsa‑miR‑1228的一种或多种，优选为cel‑miR‑39，用于实现miRNA靶标的定量。
16.根据权利要求15所述的等温扩增试剂盒，其特征在于，所述等温扩增试剂盒的内参基因标准品cel‑miR‑39采用如SEQ ID NO.3所示序列，
SEQ ID NO.3：5’‑UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG‑3’；
内参基因标准品cel‑miR‑39对应的所述荧光自抑制探针采用如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列，其中：
SEQ ID NO.4：5’‑CCCGTGGAGTCTG‑(BHQ1)‑G‑(FAM)‑CAAGCTGATT‑3’，SEQ ID NO.5：5’‑(BHQ1)‑ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA‑(FAM)‑AAAGAGTCTGTGTCACCGGGTG‑3’；
所述等温扩增试剂盒用于miRNA检测时，当对miRNA目标分子进行检测时，参照内参基因标准品cel‑miR‑39的扩增结果，实现miRNA目标分子的定量。

一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统及方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及医学检测和分子诊断技术领域，尤其涉及一种用于痕量miRNA快速检测的荧光自抑制探针的等温扩增系统和扩增方法。\n背景技术\n[0002] 微小核糖核酸(miRNA)是一类长度约为18‑24个核苷酸的单链非编码RNA，不编码蛋白质，但是能够广泛参与基因的调控。目前，循环miRNA已经被证明可以作为肿瘤早期检测、疗效监测重要的分子标志物，用于癌症的早期筛查和预后诊疗。通常，循环肿瘤miRNA分子标志物在人体液中的含量较低，同时会受到体液中其他核酸分子的干扰。更重要的是，多个miRNA分子标志物联合使用，会极大提高肿瘤早筛和诊断的准确率。因此，这些都对miRNA检测方法的灵敏度、特异性、以及单样本多靶标检测的性能提出了较高的要求。\n[0003] 过去，聚合酶链式反应(PCR)是用于miRNA检测的常用技术。然而，PCR扩增技术仍然存在诸多难以克服的弊端。例如：1)PCR无法直接检测miRNA目标分子，需要经历逆转录过程；2)PCR扩增所用的酶耐受性较差，对模板的纯度要求较高；3)PCR扩增是一种连续变温的反应，对设备的温度控制和精度要求甚高；4)PCR检测高度依赖精密的分析设备，无法在实验室以外的环境开展实验；5)PCR检测耗时较长，无法满足临床应用场景快速检测的需求；\n6)PCR检测灵敏度相对较低，一般只能检测大于10拷贝的目标分子，无法实现极低浓度靶标的检出；因此，开发检测灵敏度更高、特异性更强、单样本多靶标检测性能更优的miRNA快速检测方法将具有更广泛的临床应用价值。\n[0004] 等温扩增是一种新型的核酸扩增技术，其特点是反应全程始终维持在恒定的温度下进行，通过添加不同活性、不同功能的酶，以及特异性引物或探针来实现核酸的快速扩增目的。等温扩增技术发现之初，主要用于DNA双链的检测及应用。随后，研究表明等温扩增技\n9\n术特别适合miRNA这类长度较短的单链RNA的检测，可以在30～60分钟内，实现10倍及以上目标基因的扩增。然而，目前大多等温扩增技术，如环介导等温扩增术(LAMP)在整个反应过程中，需要同时使用4‑6条引物，且引物长度较长，相互之间还会存在互补重叠区域，容易产生非特异性扩增、并出现假阳性结果。同时，由于miRNA目标分子检测的特殊性，多数等温扩增技术仍采用染料法，既增加了非特异性扩增的概率，又无法实现单样本多靶标的应用需求。因此，极大地限制了等温扩增技术在miRNA分子标志物检测的应用。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的在于：克服现有等温扩增技术灵敏度低、特异性差、检测效率低等缺陷，提供一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统和扩增方法，能够有效降低反应前探针的荧光背景信号，同时降低探针之间的错配和非特异性延伸，显著提高用于miRNA快速检测等温扩增方法的特异性和灵敏度。\n[0006] 为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案如下：\n[0007] 本发明的第一个目的是提供一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统，所述等温扩增系统包括荧光自抑制探针、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲液、反应原料与miRNA目标分子等。其中，所述荧光自抑制探针与miRNA目标分子之间杂交结合，触发反应的开始。\n[0008] 为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：\n[0009] 进一步地，所述等温扩增系统采用荧光自抑制线性探针和荧光自抑制发夹探针。\n[0010] 所述荧光自抑制线性探针的碱基序列包括适用于所有不同miRNA目标分子的通用碱基序列，以及与特定miRNA目标分子结合的互补碱基序列。其中，SEQ ID NO.1中N碱基重复序列为能够与特定miRNA目标分子特异性结合的区域；SEQ ID NO.1中CCCGTGGAGTCTGTG序列和I碱基为荧光自抑制线性探针的通用碱基序列。\n[0011] SEQ ID NO.1：5’‑CCCGTGGAGTCTGTG‑(Quencher)‑I‑(Fluorophore)‑NNNNNNNNNN‑\n3’。\n[0012] 所述荧光基团(Fluorophore)为6‑羧基荧光素(FAM)、六氯‑6‑甲基荧光素(HEX)、ROX(ROX)、6‑羧基四甲基若丹明(TAMRA)、5H‑吲哚菁(Cy5)中的一种或多种；优选为6‑羧基荧光素(FAM)；\n[0013] 所述淬灭基团(Quencher)为黑洞猝灭基团1(BHQ1)、黑洞猝灭基团2(BHQ2)、和4‑(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)中的一种或多种；优选为黑洞猝灭基团1(BHQ1)；\n[0014] 所述淬灭碱基(I)为A、G、C、T中的一种或多种；优选为G。\n[0015] 所述荧光自抑制发夹探针的碱基序列包括能够适用于所有目标产物的通用碱基序列，以及能够结合特定目标产物的特异性互补碱基序列。其中，SEQ ID NO.2中N碱基重复序列为能够与特定目标产物特异性结合的区域；SEQ ID NO.2中ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA和AAAGAGTCTGTG序列为荧光自抑制发夹探针的通用碱基序列。\n[0016] SEQ ID NO.2：5’‑(Quencher)‑ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCA[0017] GAGCCAA‑(Fluorophore)‑AAAGAGTCTGTGNNNNNNNNNN‑3’。\n[0018] 所述荧光基团为6‑羧基荧光素(FAM)、六氯‑6‑甲基荧光素(HEX)、ROX(ROX)、6‑羧基四甲基若丹明(TAMRA)、5H‑吲哚菁(Cy5)中的一种或多种；优选为6‑羧基荧光素(FAM)；\n[0019] 所述淬灭基团为黑洞猝灭基团1(BHQ1)、黑洞猝灭基团2(BHQ2)、和4‑(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)中的一种或多种；优选为黑洞猝灭基团1(BHQ1)；\n[0020] 进一步地，所述等温扩增系统的缓冲液包括：Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、NaCl、MgCl2、DTT。\n[0021] 进一步地，所述等温扩增系统DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶的一种或多种，优选Vent DNA聚合酶。\n[0022] 进一步地，所述等温扩增系统切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.BtsI切刻内切酶的一种或多种，优选Nt.BstNBI切刻内切酶。\n[0023] 进一步地，所述等温扩增系统的反应体系为20μL，其中，各组分组成及其浓度范围为：10‑100mM Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、10‑100mM NaCl、10‑50mM MgCl2、0.2‑2.0mM DTT、\n0.05‑0.5U/μL Vent DNA聚合酶、0.05‑0.5U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶、0.025‑0.5mM dNTPs、0.025‑0.5μM荧光自抑制线性探针与0.025‑0.5μM荧光自抑制发夹探针。优选为50mM Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT、0.1U/μL Vent DNA聚合酶、\n0.2U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶、0.125mM dNTPs、0.125μM荧光自抑制线性探针、0.125μM荧光自抑制发夹探针。\n[0024] 本发明的第二个目的是提供一种基于等温扩增系统的等温扩增方法，将miRNA目标分子直接加入等温扩增系统中，进行等温扩增，得到miRNA目标分子对应的特异性等温扩增产物。\n[0025] 为了进一步优化上述检测方案，本发明所采取的技术措施还包括：\n[0026] 进一步地，等温扩增方法的实现过程包括等温扩增循环I与等温扩增循环II。在等温扩增循环I中，荧光自抑制线性探针以miRNA为靶标，进行杂交结合，在Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下，生成与miRNA目标序列反向互补的DNA单链A，并释放荧光信号。\n[0027] 进一步地，在等温扩增循环II中，荧光自抑制发夹探针与生成的DNA单链A进行杂交结合，在Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下，生成与miRNA目标序列相同的DNA单链B，并释放荧光信号。\n[0028] 进一步地，循环I和循环II反应既相互独立，又相互作用。循环I产生的单链A，会触发循环II反应的开始，进而产生大量的单链B，并释放大量的荧光信号。而产物单链B又会反过来触发循环I反应持续进行，进而实现目标产物和荧光信号的级联放大。\n[0029] 进一步地，所述等温扩增反应的温度为37‑65℃，优选为55℃。\n[0030] 本发明的第三个目的是提供用于miRNA检测的等温扩增试剂盒。\n[0031] 为了进一步优化上述检测方案，本发明所采取的技术措施还包括：\n[0032] 进一步地，所述试剂盒还包括等温扩增反应试剂，所述反应试剂包括Vent DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻内切酶、缓冲液、dNTPs和内参基因标准品。\n[0033] 进一步地，所述试剂盒的内参基因使用cel‑miR‑39、U6、hsa‑miR‑1228的一种或多种，优选cel‑miR‑39作为内参基因。\n[0034] 进一步地，所述内参基因cel‑miR‑39采用如SEQ ID NO.3所示序列。\n[0035] SEQ ID NO.3：5’‑UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG‑3’。\n[0036] 进一步地，所述内参基因cel‑miR‑39荧光自抑制探针采用如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列。\n[0037] SEQ ID NO.4：5’‑CCCGTGGAGTCTG‑(BHQ1)‑G‑(FAM)‑CAAGCTGATT‑3’，[0038] SEQ ID NO.5：5’‑(BHQ1)‑ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA‑(FAM)‑AAAGAGTCTGTGTCACCGGGTG‑3’。\n[0039] 进一步地，所述等温扩增试剂盒用于miRNA检测时，当对miRNA目标分子进行检测时，参照内参基因标准品cel‑miR‑39的扩增结果，进而实现miRNA目标分子的定量。\n[0040] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：\n[0041] (1)本发明所述的基于荧光自抑制探针的等温扩增系统及扩增方法，能够显著降低反应体系中探针的本底荧光信号，极大地提高检测信噪比，特别适合临床样本中痕量循环miRNA分子标志物的检测。\n[0042] (2)本发明所述等温扩增系统及扩增方法，所用探针本底荧光信号较低，序列长度较短，两方面因素有利于实现单样本中多个miRNA靶标的检测，对于提高肿瘤循环miRNA分子标志物检测准确性的意义重大。\n附图说明\n[0043] 图1为本发明实施例中荧光自抑制线性探针和荧光自抑制发夹探针的结构示意图；\n[0044] 图2为本发明实施例中基于荧光自抑制探针等温扩增方法的反应原理图；\n[0045] 图3为本发明实施例中基于荧光自抑制探针等温扩增方法的扩增产物电泳图；\n[0046] 图4为本发明实施例中基于荧光自抑制探针等温扩增实时荧光检测的扩增曲线和标223准曲线分析图；\n[0047] 图5为本发明实施例中基于荧光自抑制探针等温扩增方法的检测特异性结果；\n[0048] 图6为本发明实施例中基于荧光自抑制探针等温扩增方法的单样本多靶标检测结果。\n[0049] 图7为本发明实施例中基于荧光自抑制探针的等温扩增检测试剂盒，用于血清样本中hsa‑miR‑223定量检测结果。\n具体实施方式\n[0050] 下面结合图1‑2对本发明的技术原理做详细说明。\n[0051] (一)荧光自抑制探针结构设计\n[0052] 如图1所示，本发明提供一种新型荧光自抑制线性探针和一种新型荧光自抑制发夹探针，其结构。针对传统的TaqMan探针在反应前，荧光基团和淬灭基团距离较远，无法抑制探针的荧光本底信号的问题，本发明提出一种在反应前，荧光基团和淬灭基团相邻，反应后通过酶切作用相互分离，信号释放的探针结构。同时，充分利用G碱基能够淬灭荧光基团的特点，将G碱基和淬灭基团同时与荧光基团相邻，实现双重荧光淬灭的功能，即所谓了荧光自抑制线性探针。为了实现对miRNA目标分子的指数扩增，还提出一种荧光自抑制发夹探针结构。其中，荧光基团和淬灭基团分别位于发夹茎臂的5’和3’末端，发夹茎臂3’末端引出一段可以和目标产物互补配对的序列，该序列还含有相应的酶切识别位点，以便进行酶切反应。\n[0053] (二)基于荧光自抑制探针等温扩增方法的反应原理\n[0054] 本发明提供一种基于荧光自抑制探针等温扩增方法，其反应原理如图2所示。所述等温扩增方法有两个扩增循环组成，包括循环I和循环II。首先，循环I反应的开始由miRNA靶标触发，miRNA与其特异性荧光自抑制线性探针结合，在Vent DNA聚合酶的作用下，进行链的延伸，形成互补的双链。随后，Nt.BstNBI切刻内切酶识别特异性位点，将荧光自抑制线性探针所在链切开一个缺口，缺口3’端的序列被置换出去，生成产物A，荧光信号释放。循环I中置换过程与酶切过程会重复进行，会产生大量的产物A并释放大量的荧光信号。然后，产物A会触发循环II反应的开始。产物A先与荧光自抑制发夹探针结合，将发夹探针打开，信号释放。与循环I反应相同，在Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下，生成大量的产物B和释放大量的荧光信号。其中，产物B会继续触发循环I反应。因此，循环I和循环II各自内部，以及相互之间的指数扩增反应均能够重复进行，形成级联放大反应，并释放大量的荧光信号。\n[0055] 下面结合图3‑7和具体实施例，对本发明的具体实施方式进一步描述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明阐述的内容后，本领域相关技术人员对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样属于本发明的保护范围。\n[0056] 实施例1荧光自抑制探针等温扩增方法的产物特异性分析\n[0057] 本实施例以人类hsa‑miR‑223标准品为样品，提供一种用于miRNA检测的基于荧光自抑制探针等温扩增系统。\n[0058] 选取人类hsa‑miR‑223序列作为靶序列(SEQ ID NO.6)；针对该靶序列，设计特异性荧光自抑制探针，探针序列为：SEQ ID NO.7‑8；将miR‑223标准品模板加入20μL的等温扩增反应体系中。反应体系各组分浓度分别为：50mM Tris‑HCl(pH 7.9@25℃)、100mM NaCl、\n10mM MgCl2、1mM DTT、0.1U/μL Vent DNA聚合酶、0.2U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶、0.125mM dNTPs、0.125μM荧光自抑制线性探针、0.125μM荧光自抑制发夹探针。等温扩增反应条件为\n55℃，等温扩增反应共持续30分钟，得到如图3所示的等温扩增产物A和产物B，分别对应循环I和循环II生成的产物。结果表明，本发明的基于荧光自抑制探针等温扩增方法能够有效检测miRNA目标分子，且产物的特异性较高，无非特异性扩增现象出现。\n[0059] 实施例2荧光自抑制探针等温扩增方法的检测灵敏度试验\n[0060] 本实施例以几种不同浓度的人类hsa‑miR‑223标准品为样品，对荧光自抑制探针等温扩增检测方法的灵敏度进行分析。\n[0061] 选取人类hsa‑miR‑223序列作为靶序列，将hsa‑miR‑223标准品进行十倍梯度稀释，将获得的不同浓度miR‑223模板分别加入20μL的等温扩增反应体系中，反应体系中其他组分及浓度与实施例1中相同，等温扩增反应共持续90分钟，每隔一分钟采集一次荧光信号，得到如图4所示实时荧光定量扩增曲线和标准曲线。结果表明，本发明的荧光自抑制探针等温扩增方法能够在90分钟内，实现覆盖10aM～1nM之间九个不同浓度的动态检测范围，\n2\n且扩增曲线之间的线性相关性较好(R＝0.9947)。经计算，所述荧光自抑制探针等温扩增方法的最低检测限(LOD)约为0.08aM，说明本发明的荧光自抑制探针等温扩增方法检测灵敏度较高，具备实现极低浓度miRNA目标分子的检测能力。\n[0062] 实施例3荧光自抑制探针等温扩增方法的检测特异性试验\n[0063] 本实施例以hsa‑miR‑223标准品为野生型对照组，分别对其同源序列hsa‑miR‑\n223‑5p和hsa‑miR‑599，以及突变体序列(hsa‑miR‑223‑Mut1、hsa‑miR‑223‑Mut2、hsa‑miR‑\n223‑Mut3)进行检测，以分析所述荧光自抑制探针等温扩增方法的检测特异性。\n[0064] 以hsa‑miR‑223序列作为对照组靶序列；以其特异性探针序列为检测探针；分别将相同浓度的hsa‑miR‑223序列(SEQ ID NO.6)、hsa‑miR‑223‑5p(SEQ ID NO.9)、hsa‑miR‑\n599(SEQ ID NO.10)、hsa‑miR‑223‑Mut1(SEQ ID NO.11)、hsa‑miR‑223‑Mut2(SEQ ID NO.12)和hsa‑miR‑223‑Mut3(SEQ ID NO.13)的标准品加入20μL的等温扩增反应体系中，反应体系中其他组分及浓度与实施例1中相同，等温扩增反应共持续60分钟，每隔一分钟采集‑(CqMut‑CqWet)/CqWet\n一次荧光信号，得到如图5所示的实时荧光定量扩增曲线。采用2 法将曲线的\nCq值转换成目标分子的相对检测水平，分析结果如图5柱状图所示。结果表明，对于hsa‑miR‑223的同源序列，以及两个突变体序列(hsa‑miR‑223‑Mut2、hsa‑miR‑223‑Mut3)，反应体系中目标分子的相对检测水平差异极显著(P<0.01)，说明使用hsa‑miR‑223的特异性探针，不会产生以其同源序列、以及hsa‑miR‑223‑Mut2、hsa‑miR‑223‑Mut3突变体序列为模板的扩增产物。而对于仅有一个碱基突变的hsa‑miR‑223‑Mut1，反应体系中目标分子的相对检测水平差异也是显著的(P<0.05)，说明单碱基差异序列(hsa‑miR‑223‑Mut1)也不会对hsa‑miR‑223目标基因的检测产生影响。因此，本发明的荧光自抑制探针等温扩增方法的检测特异性较高，miRNA目标分子的同源序列，不会对其检测的准确性产生影响。\n[0065] 实施例4荧光自抑制探针等温扩增方法的单样本多靶标检测性能试验\n[0066] 本实施例以hsa‑miR‑223、hsa‑miR‑21和hsa‑miR‑27a标准品为样品，对单个反应体系中这三个miRNA标准品进行同时检测和分析。\n[0067] 分别选取人类hsa‑miR‑223、hsa‑miR‑21和hsa‑miR‑27a作为靶序列。其中，hsa‑miR‑21序列为SEQ ID NO.14，针对该靶序列，设计特异性荧光自抑制探针，探针序列为：SEQ ID NO.15‑16。hsa‑miR‑27a序列为SEQ ID NO.17，针对该靶序列，设计特异性荧光自抑制探针，探针序列为：SEQ ID NO.18‑19。分别将这三种miRNA靶序列标准品进行十倍梯度稀释，获得五个不同浓度的miRNA模板样品，将相同稀释倍数hsa‑miR‑223、hsa‑miR‑21和hsa‑miR‑27a标准品和相应的特异性探针同时加入20μL的等温扩增反应体系中，反应体系中其他组分及浓度与实施例1中相同，等温扩增反应共持续60分钟，每隔一分钟采集一次荧光信号，得到如图6所示实时荧光定量扩增曲线和标准曲线。结果表明，本发明的荧光自抑制探针等温扩增方法能够在单个反应体系中实现三个miRNA目标分子的同时检测，同时，不同浓\n2\n度的miRNA靶标的扩增曲线线性相关性较高(R >0.9)，充分表明所述荧光自抑制探针等温扩增方法的单样本多靶标检测性能较高。\n[0068] 实施例5基于荧光自抑制探针的等温扩增检测试剂盒，用于hsa‑miR‑223定量检测结果。\n[0069] 本实施例分别以早期肝癌患者和健康人血清为样本，对hsa‑miR‑223分子进行定量检测。\n[0070] 选取外源合成的cel‑miR‑39标准品为参照基因，在进行血清样本中miRNA提取时，将1nM cel‑miR‑39标准品与血清裂解液充分混合，并完成血清miRNA的提取。分别将最适浓度的hsa‑miR‑223探针组合和最适浓度的cel‑miR‑39探针组合，以及1μL模板，同时加入20μL的等温扩增反应体系中，反应体系中其他组分及浓度与实施例1中相同，等温扩增反应共持续60分钟。同时，作为方法学对照，采用RT‑qPCR检测方法对1μL模板进行定量检测。反应结束后，参考cel‑miR‑39基因的Cq值，计算hsa‑miR‑223的相对表达水平，得到如图7所示基因表达水平柱状图。结果表明，本发明的荧光自抑制探针等温扩增方法与传统的RT‑qPCR检测方法所得样本中hsa‑miR‑223的表达水平大致相同，充分表明所述荧光自抑制探针等温扩增方法的定量准确性较高。\n[0071] 以上对本发明的具体实施进行了详细阐述，但其只作为范例，本发明不限制于以上阐述的具体实施例。对于本领域相关技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。